本發(fā)明涉及一種防治輻射損傷的中藥復(fù)方制劑歸芪益元膏，也涉及一種輻射損傷動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

重離子束(¹²c⁶⁺)是21世紀(jì)最理想的放療射線，在治療腫瘤方面有極好的發(fā)展前景。一方面，由于¹²c⁶⁺束在治療靶區(qū)腫瘤時(shí)，對(duì)正常組織的輻射損傷不容忽視，因此開發(fā)藥物防治¹²c⁶⁺束的輻射損傷意義重大。另一方面，令人遺憾的是，在輻射損傷的探索領(lǐng)域，缺乏病證結(jié)合動(dòng)物模型的支撐阻礙了中醫(yī)中藥的防治研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一方面提供了一種防治輻射損傷的中藥復(fù)方制劑歸芪益元膏，另一方面，研究擬構(gòu)建病證結(jié)合大鼠¹²c⁶⁺束輻射損傷模型，為今后輻射損傷領(lǐng)域的研究提供動(dòng)物模型支撐。

本發(fā)明的第一個(gè)方面：

一種防治輻射損傷的中藥組合物，包括有按重量份計(jì)的如下組分：黃芪25～35份、人參12～18份、當(dāng)歸12～18份、熟地12～18份、枸杞子12～18份、麥冬12～18份、五味子8～12份。

在一個(gè)實(shí)施例中，黃芪30份、人參15份、當(dāng)歸15份、熟地15份、枸杞子15份、麥冬15份、五味子10份。

本發(fā)明的第二個(gè)方面：

包含有上述中藥組合物的中藥制劑。

本發(fā)明的第三個(gè)方面：

中藥組合物的制備方法，將各組分進(jìn)行通過(guò)粉碎、壓榨、研磨、過(guò)篩、滲漉、萃取、水提、醇提、酯提或者層析。

本發(fā)明的第四個(gè)方面：

大鼠¹²c⁶⁺束輻射損傷模型的構(gòu)建方法，包括如下步驟：對(duì)wistar大鼠在麻醉狀態(tài)下接受¹²c⁶⁺束輻射肺部。

輻射強(qiáng)度是250mev，輻射劑量是8gy。

麻醉前12小時(shí)wistar大鼠禁食。

本發(fā)明的第五個(gè)方面：

上述的中藥組合物在用于制備¹²c⁶⁺束輻射損傷的治療藥物中的應(yīng)用。

所述的¹²c⁶⁺束輻射損傷包括有哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞(rbc)、白細(xì)胞(wbc)、血紅蛋白(hgb)、血小板(plt)的降低。

所述的¹²c⁶⁺束輻射損傷包括有哺乳動(dòng)物的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低。

所述的¹²c⁶⁺束輻射損傷包括有骨髓細(xì)胞g2/m期阻滯、dna合成能力阻滯、γh2ax蛋白表達(dá)量升高、53bp1蛋白表達(dá)量升高、mrna表達(dá)量升高、bax蛋白表達(dá)量升高或者pcna蛋白表達(dá)量升高。

藥理作用：歸芪益元膏是博士后導(dǎo)師李金田教授率領(lǐng)的課題組，在多年研究中藥復(fù)方防治輻射損傷的過(guò)程中發(fā)明創(chuàng)制的，方由黃芪、人參、當(dāng)歸、熟地、枸杞子、麥冬、五味子組成。黃芪味甘性微溫，歸脾、肺經(jīng)，人參味甘微苦性微溫，歸脾、肺經(jīng)，二者大補(bǔ)元?dú)?，共為君藥；?dāng)歸味辛甘性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，補(bǔ)血活血，熟地味甘性微溫，歸肝、腎經(jīng)，益真陰，滋腎水，二者共為臣藥；枸杞子味甘性平，歸肝、腎、肺經(jīng)，滋補(bǔ)肝腎，為佐藥；麥冬味甘微苦性微寒，歸心、肺、胃經(jīng)，潤(rùn)肺養(yǎng)陰，五味子味酸性溫，歸肺、腎、心經(jīng)，上斂肺氣、下滋腎陰，二藥同伍，以達(dá)“金水相生”的效果，共為使藥。該方中的人參、麥冬、五味子組成了生脈散，是益氣生津的名方。上述諸藥合用，共奏益氣滋陰之效。歸芪益元膏能減輕¹²c⁶⁺束輻射造成的旁效應(yīng)，其機(jī)制與改善氧化應(yīng)激反應(yīng)水平有關(guān)。

20世紀(jì)60年代鄺安堃教授首開先河發(fā)現(xiàn)過(guò)量腎上腺皮質(zhì)激素可誘發(fā)小鼠呈現(xiàn)類似中醫(yī)陽(yáng)虛癥狀，證候動(dòng)物模型的發(fā)展已走過(guò)了整整50年。筆者采用對(duì)疾病動(dòng)物模型進(jìn)行辨證建立病證結(jié)合動(dòng)物模型。該病證結(jié)合動(dòng)物模型具有疾病和證候的雙重特征，為輻射損傷動(dòng)物模型首次提供了證候物質(zhì)基礎(chǔ)。通過(guò)以方測(cè)證，進(jìn)一步證實(shí)該模型的合理性，對(duì)這一領(lǐng)域的研究奠定了初步基礎(chǔ)，為中醫(yī)中藥介入輻射損傷防治領(lǐng)域提供了可靠的動(dòng)物模型支撐。

本發(fā)明的以上組成中，各味藥的重量是以生藥計(jì)算的，如果以克為單位，上述配方組成可制成一個(gè)療程劑量的藥物制劑，若日服2-4次，為20-40天的服用量，如制成制劑，則因制劑的大小不同可制成100-1000劑。所述100-1000劑是指單位劑量的制劑形式，如片劑100-1000片，膠囊劑100-1000粒，顆粒劑l00-1000份，口服液l00-l000ml，膏劑l00-l000份，丸劑10-1000丸等。

以上組成是按重量作為配比的，在生產(chǎn)時(shí)可按照相應(yīng)比例增大或減少，如大規(guī)模生產(chǎn)可以以kg為單位，或以t(噸)為單位；小規(guī)模制劑也可以以g為單位。重量可以增大或者減小，但各組成之間的生藥材重量配比的比例不變。

以上重量配比的比例是經(jīng)過(guò)科學(xué)篩選得到的，對(duì)于特殊病人，如重癥或輕癥，肥胖或瘦小的病人，可以相應(yīng)調(diào)整組成的量的配比，增加或減少不超過(guò)100％，藥效基本不變。

本發(fā)明的中藥組合物，是通過(guò)將上述配方組成的中藥原料藥材經(jīng)過(guò)提取或其他方式加工，制成藥物活性物質(zhì)，隨后，以該物質(zhì)為原料，需要時(shí)加入藥物可接受的載體，按照制劑學(xué)的常規(guī)技術(shù)制成的。所述活性物質(zhì)可以通過(guò)分別提取中藥原料得到，也可以通過(guò)共同提取中藥原料藥材得到，也可以通過(guò)其他方式待到，如：通過(guò)粉碎、壓榨、研磨、過(guò)篩、滲漉、萃取、水提、醇提、酯提、層析等方法得到、這些活性物質(zhì)可以是浸膏形式的物質(zhì)，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根據(jù)制劑的不同需要決定制成不同的濃度。

本發(fā)明的中藥組合物，優(yōu)選的是單位劑量的藥物制劑形式，在制成藥物制劑時(shí)可以制成任何可藥用的劑型，這些劑型選自：片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、優(yōu)選的是口服制劑形式，最優(yōu)選的是丸劑，片劑，膠囊劑，顆粒劑。

本發(fā)明的中藥組合物，其藥物活性物質(zhì)是經(jīng)過(guò)提取加工制得的，如可以用以下方法加工：

以上藥物粉碎，用煉蜜制丸，

或

以上藥物經(jīng)過(guò)水煮，得到水提取物，濃縮成膏，以該清膏為原料，需要時(shí)加入藥物可接受的載體，按照制劑學(xué)的常規(guī)技術(shù)制成。

本發(fā)明的中藥組合物，根據(jù)需要可以加入一些藥物可接受的載體，可以采用制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備該藥物制劑，如將藥物活性物質(zhì)與藥物可接受的載體混合。所述藥物可接受的的載體選自：蜂蜜、練蜜、甘露醇、山梨醇、山梨酸或鉀鹽、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素a、維生素c、維主素e、維生素d、氮酮、edta二鈉、edta鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土溫60-80、司班-80、蜂蠟、羊毛脂、液體石蠟、十六醇、沒食子酸酯類、瓊、三乙醇胺、堿性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、b-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。

本發(fā)明的中藥制劑，在制成藥劑時(shí)，單位劑量的藥劑可含有本發(fā)明的藥物活性物質(zhì)0.1～l000mg，其余為藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體以重量計(jì)可以是制劑總重量的0.01-99.9％。

本發(fā)明的藥物制劑在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量。服用方法因病人的體質(zhì)情況對(duì)癥服用，如日服1-4次，每次1-4丸。

附圖說(shuō)明

圖13組大鼠總路程比較其中，

圖23組大鼠活動(dòng)時(shí)間比較

圖33組大鼠休息時(shí)間比較

圖43組大鼠平均速度比較

圖53組大鼠攝食量比較

圖63組大鼠飲水量比較

圖73組大鼠心率比較

圖83組大鼠肛溫比較

圖93組大鼠排尿量比較

圖103組大鼠體重比較

圖113組大鼠血象比較

圖123組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較

圖13歸芪益元膏的制備工藝流程圖

圖14大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(空白對(duì)照組(左肺))

圖15大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(單純輻射組(左肺))

圖16大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(歸芪益元膏組(左肺))

圖17大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(空白對(duì)照組(右肺))

圖18大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(單純輻射組(右肺))

圖19大鼠肺腎組織病理形態(tài)學(xué)改變(歸芪益元膏組(右肺))

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

材料

1.動(dòng)物健康雄性spf級(jí)wistar大鼠，體質(zhì)量180～200g，鼠齡38～40周，30只，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)碼：scxk(甘)2015-0002。飼養(yǎng)期間保持自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(24±1)℃，濕度為(55±5)％，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2.藥物和試劑歸芪益元膏藥物組成:黃芪30g、人參15g、當(dāng)歸15g、熟地15g、枸杞子15g、麥冬15g、五味子10g。方中原藥材由甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供并質(zhì)量鑒定。歸芪益元膏水煎液自制，生藥共計(jì)115g，先用涼水浸泡30min，用水量為生藥量的8倍，武火煎沸后，文火煎30min，濾出藥液；再加6倍量水煎沸后文火煎20min，濾出藥液，合并2次煎液，濃縮至97.28ml，生藥量為1.028g/ml。水合氯醛(批號(hào)：20160325)：國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

3.儀器中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子研究裝置(hirfl-csr)。大鼠自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)：digbehv-l，上海吉量軟件科技有限公司。多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)：rm6240bd，成都儀器廠。天平：910324，sartoriusanglytic。肛溫表。動(dòng)物血球分析儀:hemavet950s，美國(guó)hemavet。

方法

1.病證結(jié)合模型制備30只wistar大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、單純輻射組、歸芪益元膏組，wistar大鼠在麻醉狀態(tài)下接受250mev¹²c⁶⁺束輻射右側(cè)肺部,輻射劑量8gy,麻醉劑為10％水合氯醛(300mg/kg體重)腹腔注射,麻醉前12小時(shí)大鼠禁食。正常對(duì)照組也同步采取麻醉措施，輻射時(shí)右側(cè)肺部對(duì)準(zhǔn)束流窗口,輻射劑量0gy。

各組分別于¹²c⁶⁺束照射前，正常對(duì)照組及單純輻射組給予0.9％氯化鈉注射液，每次2ml，每天1次ig，連續(xù)7天；歸芪益元膏組給予歸芪益元膏水煎液10.28g/(kg·d)，每次2ml，每天1次ig，連續(xù)7天。各組分別于¹²c⁶⁺束照射后，繼續(xù)按原定方案灌胃7天，處死大鼠，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2.病證結(jié)合動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)參考《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》中氣虛、陰虛證的標(biāo)準(zhǔn)。具體證候：神疲乏力，納呆，心悸，午后潮熱，口干多飲，尿少便結(jié)，舌紅絳少苔，脈細(xì)數(shù)。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《放射病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》擬定。具體癥狀：乏力，食欲減退，白細(xì)胞明顯下降。

3.客觀指標(biāo)測(cè)定

3.1自發(fā)活動(dòng)采用大鼠自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)觀察各組大鼠于照射后第1、3、7天的總路程、活動(dòng)時(shí)間、休息時(shí)間、平均速度的變化。

3.2攝食量、飲水量、心率、肛溫、排尿量、體重各組大鼠于照射后第1、3、7天早晨9時(shí)灌胃前，分別稱量剩余食物量、剩余飲水量、排尿量、體重并作記錄以觀察攝食量、飲水量、排尿量、體重。各組大鼠于上述同樣時(shí)間點(diǎn)用多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄心率。各組大鼠于照射后第1、3、7天下午15時(shí)用肛溫表測(cè)肛門溫度并作記錄。

3.3血象大鼠輻射7天后采樣，取材前稱重，股動(dòng)脈取血，采用動(dòng)物血球分析儀對(duì)血象進(jìn)行檢測(cè)。

3.4脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)各組大鼠處死后，立即取出脾臟和胸腺，計(jì)算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量指標(biāo)以表示，采用t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料用x²檢驗(yàn)，以p<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.3組大鼠自發(fā)活動(dòng)變化見圖1～4(注：與正常對(duì)照組比較，^**p<0.01；與單純輻射組比較，^△△p<0.01)。單純輻射組的總路程、活動(dòng)時(shí)間、平均速度呈降低趨勢(shì)，休息時(shí)間呈增加趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射使大鼠的自發(fā)活動(dòng)趨向減弱。歸芪益元膏組的總路程、活動(dòng)時(shí)間、平均速度呈增高趨勢(shì)，休息時(shí)間呈降低趨勢(shì)，并且從輻射后第1天到第7天與單純輻射組比較有極顯著差異(p<0.01)，表明歸芪益元膏處理對(duì)輻射大鼠的自發(fā)活動(dòng)有改善作用。

2.3組大鼠攝食量、飲水量、心率、肛溫、排尿量、體重變化見圖5～10(注：與正常對(duì)照組比較，^**p<0.01；與單純輻射組比較，^△△p<0.01)。正常對(duì)照組攝食量、飲水量、體重呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)。單純輻射組的攝食量、排尿量、體重呈下降趨勢(shì)，飲水量、心率、肛溫呈上升趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射可影響大鼠的攝食量、飲水量、心率、肛溫、排尿量、體重。歸芪益元膏組的攝食量、飲水量、心率、肛溫、體重呈上升趨勢(shì)，排尿量呈下降趨勢(shì)，并且從輻射后第1天到第7天與單純輻射組比較有極顯著差異(p<0.01)，表明歸芪益元膏處理可明顯改善輻射大鼠的上述癥狀及體征。

3.3組大鼠血象變化見圖11(注：與正常對(duì)照組比較，^**p<0.01；與單純輻射組比較，^△△p<0.01)。單純輻射組的紅細(xì)胞(rbc)、白細(xì)胞(wbc)、血紅蛋白(hgb)、血小板(plt)降低，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射改變了大鼠的血象。歸芪益元膏組的rbc、wbc、hgb、plt升高，與單純輻射組比較有極顯著差異(p<0.01)，表明歸芪益元膏處理對(duì)輻射大鼠血象有一定的保護(hù)作用。

表1各組大鼠wbc、rbc、hgb、plt計(jì)數(shù)比較

注：與正常對(duì)照組相比，*p<0.01；與輻射12h組相比，δp<0.01

4.3組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)變化見圖12(注：與正常對(duì)照組比較，^**p<0.01；與單純輻射組比較，^△△p<0.01)。單純輻射組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射改變了大鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。歸芪益元膏組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)升高，與單純輻射組比較有極顯著差異(p<0.01)，表明歸芪益元膏處理可明顯減輕輻射對(duì)大鼠脾臟和胸腺的損傷，有一定的保護(hù)作用。

實(shí)施例2

1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

spf級(jí)健康雄性wistar大鼠42只，體重(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)spf級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)scxk(甘)2015-0002)，查隨機(jī)數(shù)字表將其分為空白對(duì)照組、單純輻射組和輻照+藥物組。飼養(yǎng)在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)spf級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，spf級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證號(hào)為syxk(甘)2015-0005。

2實(shí)驗(yàn)藥品制備

方藥組成：黃芪30g，當(dāng)歸、熟地、麥冬、人參、枸杞子各15g，五味子10g。方中原藥材由本校甘肅省高校中藏藥化學(xué)與質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室提供并質(zhì)量鑒定。制備過(guò)程由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥實(shí)驗(yàn)室完成。歸芪益元膏按下述方法制備：取處方量藥材，加12倍量水回流提取2次，每次6倍量水，每次回流1.5小時(shí)，合并提取液，沉降，300目篩過(guò)濾，減壓濃縮至生藥量1.5g/ml，作為藥膏。分別以原藥膏2wt‰的比例加入阿斯巴甜，3wt‰的比例加入苯甲酸鈉，與原藥膏混合均勻，溶解。取黃原膠(原藥膏的4wt‰)和1,2-丙二醇按1:5的比例配成混懸液，加入上述藥膏中，混合均勻后，用膠體磨循環(huán)研磨1分鐘，收膏，灌裝、滅菌，即得。流程如圖13所示。

3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃

各組分別于¹²c⁶⁺束照射前，正常對(duì)照組及單純輻射組給予0.9％氯化鈉注射液，每次2ml，每天1次ig，連續(xù)7天；歸芪益元膏組給予歸芪益元膏10.28g/(kg·d)，每次2ml，每天1次ig，連續(xù)7天。

4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照射

重離子照射在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子加速器研究裝置(heavyionresearchfacilityinlanzhou-coolerstoragering，簡(jiǎn)稱hirfl-csr)的淺層腫瘤治療終端上進(jìn)行，束流為12c6+離子束。坪區(qū)照射，能量為165mev，let為20kev/um，吸收劑量率為2gy/min，用空氣電離室監(jiān)測(cè)劑量，單純輻射組和輻照+藥物組大鼠右肺部照射劑量為2gy。

5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

照射后分別于6h、12h、24h處死各組大鼠6只，取血，取左、右肺、左腎組織進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

6指標(biāo)檢測(cè)方法

q-pcr、western-blot和免疫組化檢測(cè)大鼠右肺、左肺、左腎組織中dna損傷、細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)基因表達(dá)情況，硝酸還原酶法檢測(cè)no含量變化，he染色觀察大鼠左肺、右肺組織形態(tài)學(xué)變化。全自動(dòng)動(dòng)物血球分析儀檢測(cè)大鼠外周血象變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞周期的變化。

7實(shí)驗(yàn)結(jié)果

7.1大鼠一般狀況

輻射各組大鼠精神差，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，呼吸急促，體重減輕，皮毛褪色，但未出現(xiàn)死亡。解剖后輻射各組大鼠肺部淤血嚴(yán)重。輻照+中藥組大鼠精神尚可，皮毛潤(rùn)澤，呼吸平穩(wěn)，無(wú)死亡，肺部淤血減輕。

7.2各組大鼠肺腎病理形態(tài)學(xué)變化(圖14-19所示)

空白對(duì)照組大鼠雙肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁薄而光滑，無(wú)增厚，肺泡腔完整，腔內(nèi)無(wú)滲出物，血管正常；在直接照射的右肺組織，單純輻射6h、12h、24h組可見肺泡壁增厚，肺泡壁毛細(xì)血管充血，肺泡腔內(nèi)出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

在旁組織左肺中，單純輻射6h、12h組大鼠肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血、出血，肺泡壁無(wú)增厚，肺泡腔完整，腔內(nèi)無(wú)滲出物。單純輻射24h組，肺泡壁增厚，局灶可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

在直接照射的右肺，與單純輻射組相比，歸芪益元膏6h、12h、24h組大鼠肺泡壁無(wú)增厚，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血、出血，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。在旁組織左肺中，歸芪益元膏各組大鼠肺泡壁無(wú)增厚，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管無(wú)充血、出血。

7.3各組大鼠骨髓細(xì)胞周期的變化(表2)

在輻射6h后，大鼠骨髓細(xì)胞周期未發(fā)生明顯改變。在輻射后12h，g2/m期細(xì)胞率由4.36％變?yōu)?.18％，輻射后24h，g2/m期細(xì)胞率由7.18％變?yōu)?.27％，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)明顯上揚(yáng)，說(shuō)明在右肺受輻射后，骨髓細(xì)胞出現(xiàn)了g2/m期阻滯。大鼠用藥物干預(yù)后其右肺部再進(jìn)行重離子輻射，在輻射后6h、12h、24h出現(xiàn)了g0/g1期細(xì)胞率的下降，s期細(xì)胞率的上揚(yáng)，說(shuō)明中藥可以促進(jìn)骨髓細(xì)胞從g0/g1期進(jìn)入s期，促進(jìn)s期dna合成能力，保證細(xì)胞周期的正常進(jìn)行。

表2各組大鼠股骨骨髓細(xì)胞周期的變化

注：*與空白組比較，p<0.05

7.4各組大鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、血紅蛋白結(jié)果(表3)

單純輻射組大鼠外周血象wbc、rbc、plt、hgb在照射后12h明顯下降，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；輻照+藥物組明顯升高，與單純輻射組12h比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。

表3各組大鼠外周血wbc、rbc、plt、hgb計(jì)數(shù)比較

與空白對(duì)照組相比*p<0.01，與單純輻射組12h相比δp<0.01

7.5各組大鼠肺腎組織中γ-h2ax、53bp1蛋白及mrna表達(dá)變化(表4-7)

單純輻射組大鼠左右肺、左腎中γh2ax、53bp1蛋白及mrna表達(dá)量在輻射后12h、24h明顯升高，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組相比，輻照+藥物組大鼠左右肺、左腎中γh2ax、53bp1蛋白及mrna表達(dá)量在輻射后12h、24h明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

表4各組大鼠右肺、左肺和左腎中γh2axmrna表達(dá)變化

注：*與空白組比較，p<0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組比較，p<0.05

表5各組大鼠右肺、左肺和左腎中γh2ax蛋白表達(dá)變化

注：*與空白組比較，p<0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組比較，p<0.05

表6各組大鼠右肺、左肺和左腎中53bp1mrna表達(dá)變化

注：**與空白組比較，p<0.05；△△與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組比較，p<0.05

表7各組大鼠右肺、左肺和左腎中53bp1蛋白表達(dá)變化

注：*與空白組比較，p<0.05；△與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組比較，p<0.05

7.6各組大鼠肺腎組織中bax蛋白及mrna表達(dá)變化(表8-9)

輻射后24h右肺、左肺、左腎組織中baxmrna及蛋白表達(dá)模型上調(diào)，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；輻照+藥物組明顯下調(diào)，與單純輻射組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。

表8各組大鼠肺腎組織中bax平均灰度值

與空白對(duì)照組相比，*p<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組相比，δp<0.01(平均灰度值越大，蛋白表達(dá)越低)

表9各組大鼠肺腎組織中baxmrna相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*p<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)單純輻射組相比，δp<0.01

7.7各組大鼠肺腎組織中pcna蛋白及mrna表達(dá)變化(表10-11)

表10各組大鼠右肺、左肺和左腎中pcnamrna表達(dá)變化

*與空白組比較，p＜0.05；**與空白組比較，p＜0.01△與模型組比較，p＜0.05；△△與空白組比較，p＜0.01

表10各組大鼠右肺、左肺和左腎中pcna蛋白表達(dá)變化

*與空白組比較，p＜0.05；**與空白組比較，p＜0.01△與模型組比較，p＜0.05；△△與空白組比較，p＜0.01

輻射后24h右肺、左肺、左腎組織中pcnamrna及蛋白表達(dá)模型上調(diào)，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；輻照+藥物組明顯下調(diào)，與單純輻射組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。

討論

1.病證結(jié)合動(dòng)物模型的造模依據(jù)

1.1模擬病因重離子是指原子序數(shù)大于質(zhì)子的正離子，如碳離子(¹²c⁶⁺)等。腫瘤重離子治療是把¹²c⁶⁺注入同步加速器使之處于高能狀態(tài)，加速到接近光速并在束流上予以控制，再引出來(lái)治療照射腫瘤，可直接導(dǎo)致對(duì)周邊正常組織的輻射損傷。在中醫(yī)古籍中鮮有輻射損傷的相關(guān)記載。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)高能粒子作用于機(jī)體時(shí)，高能粒子的能量在短時(shí)間內(nèi)以熱的形式傳遞給機(jī)體，超出機(jī)體的承受能力，可中傷機(jī)體，形成類似火熱溫毒的致病證候?！端貑枴り庩?yáng)應(yīng)象大論》云：“壯火之氣衰，少火之氣壯；壯火食氣，氣食少火；壯火散氣，少火生氣。”張景岳《類經(jīng)》注：“火，天地之陽(yáng)氣也。天非此火，不能生物；人非此火，不能有生。故萬(wàn)物之生，皆由陽(yáng)氣。但陽(yáng)和之火則生物，亢烈之火反害物，故火太過(guò)氣反衰，火和平則氣乃壯。”從中醫(yī)理論角度分析，¹²c⁶⁺束乃六氣之屬，為火熱之氣，常則宜人，過(guò)則演變?yōu)榱畬?壯火，耗傷氣陰，出現(xiàn)氣陰兩虛證。

1.2模擬癥狀按照病證結(jié)合動(dòng)物模型的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照單純輻射組大鼠的臨床癥狀，我們可以推斷輻射損傷模型大鼠的證候?qū)傩浴?sup>12c⁶⁺束輻射大鼠右側(cè)肺部以后，耗傷肺之氣陰，繼之出現(xiàn)全身氣陰虧損，因此與正常對(duì)照組相比較，單純輻射組大鼠神疲懶動(dòng)，納呆，心悸，午后潮熱，口干多飲，尿少便結(jié)，舌紅絳少苔。證明該模型的證候?qū)傩允菤怅巸商撟C。

1.3客觀指標(biāo)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，單純輻射組的自發(fā)活動(dòng)(總路程、活動(dòng)時(shí)間、平均速度)在照射¹²c⁶⁺束后的1～7天內(nèi)趨向降低，自發(fā)活動(dòng)(休息時(shí)間)呈增加趨勢(shì)(p<0.01)，表明輻射使大鼠的自發(fā)活動(dòng)趨向減弱。正常對(duì)照組攝食量、飲水量、體重呈逐漸增長(zhǎng)趨勢(shì)。單純輻射組的攝食量、排尿量、體重呈下降趨勢(shì)，飲水量、心率、肛溫呈上升趨勢(shì)，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射可影響大鼠的攝食量、飲水量、心率、肛溫、排尿量、體重。符合氣陰兩虛證的證候表現(xiàn)。

血象反映了機(jī)體造血系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)，造血系統(tǒng)是對(duì)輻射損傷最敏感的系統(tǒng)之一，血象中紅細(xì)胞(rbc)和白細(xì)胞(wbc)的計(jì)數(shù)變化是衡量輻射損傷的生化指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中，單純輻射組的rbc和wbc降低，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明¹²c⁶⁺束輻射右側(cè)肺部對(duì)大鼠骨髓造血系統(tǒng)有一定損傷。脾臟和胸腺是哺乳動(dòng)物重要的免疫器官，同骨髓一樣是免疫細(xì)胞形成、各種免疫因子產(chǎn)生的場(chǎng)所，共同構(gòu)成機(jī)體的防御系統(tǒng)。脾臟和胸腺同樣對(duì)輻射損傷最為敏感。本實(shí)驗(yàn)中¹²c⁶⁺束輻射導(dǎo)致單純輻射組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，與正常對(duì)照組比較均有極顯著差異(p<0.01)，表明輻射損傷了大鼠的免疫器官-脾臟和胸腺。符合西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)-《放射病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。