本發(fā)明屬于干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種組合細(xì)胞制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病足是指由于糖尿病血管病變、神經(jīng)病變及其感染等綜合因素，導(dǎo)致神經(jīng)性病變使得下肢保護(hù)功能減退，大血管和微血管病變使動(dòng)脈灌注不足致微循環(huán)障礙而引起足部疼痛、皮膚深潰瘍甚至肢體壞疽的疾病狀態(tài)。糖尿病足是糖尿病一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，是糖尿病患者致殘，甚至致死的重要原因之一，不但給患者造成痛苦，而且使其增添了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。糖尿病足的主要治療方法有干細(xì)胞移植治療。干細(xì)胞移植治療糖尿病足主要是根據(jù)干細(xì)胞可以在體內(nèi)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，分泌大量的促血管生成因子，形成新生血管的原理，將其移植到缺血下肢，使其逐漸分化并形成新生毛細(xì)血管，改善和恢復(fù)下肢血流，達(dá)到治療下肢缺血的目的。干細(xì)胞移植作為治療血管再生的新療法，為糖尿病足患者帶來了希望。目前糖尿病足用途的干細(xì)胞制劑主要為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。該制劑的制備方法主要是：采集患者骨髓，分離單核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞中的干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，從而將擴(kuò)增后的干細(xì)胞制備成骨髓來源的干細(xì)胞制劑。其缺點(diǎn)在于骨髓來源的干細(xì)胞量較少，擴(kuò)增速度慢，從而限制了其應(yīng)用。此外，采集骨髓還會(huì)給患者帶來巨大的身體負(fù)擔(dān)，進(jìn)而可能加重病情。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種組合細(xì)胞制劑，用于制備治療缺血性糖尿病足藥物。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種組合細(xì)胞制劑，包含：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和nkt細(xì)胞制劑。優(yōu)選地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞濃度為0.125×106～0.75×106個(gè)/ml。更優(yōu)選地，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為第三代至第六代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述nkt細(xì)胞制劑中nkt細(xì)胞的細(xì)胞濃度為1.25×106～12.5×106個(gè)/ml。更優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)劑包括細(xì)胞生長(zhǎng)因子il-2和il-15。更優(yōu)選地，所述il-2的工作濃度為200～8000u/ml，更優(yōu)選為500u/ml。更優(yōu)選地，所述il-15的工作濃度為10～50ng/ml，更優(yōu)選為30ng/ml。優(yōu)選的，所述組合細(xì)胞制劑為注射制劑。更優(yōu)選的，所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的每次注射劑量為1×107～6×107個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；所述nkt細(xì)胞制劑的每次注射劑量為1×108～10×108個(gè)nkt細(xì)胞。本發(fā)明還提供了上述組合細(xì)胞制劑在制備缺血性糖尿病足藥物中的應(yīng)用。綜上所述，本發(fā)明提供了一種組合細(xì)胞制劑及其應(yīng)用，所述組合細(xì)胞制劑為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和nkt細(xì)胞制劑。本發(fā)明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以臍帶作為組織來源，操作簡(jiǎn)單，而且臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增速度快，容易獲得數(shù)量較多的干細(xì)胞；nkt細(xì)胞由外周血中的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得，對(duì)提高機(jī)體免疫力有明顯的作用，并能清除機(jī)體感染，促進(jìn)糖尿病足患者的傷口愈合；這兩種細(xì)胞制劑配伍使用，協(xié)同增效，可進(jìn)一步改善和恢復(fù)糖尿病足患者的下肢血流，促進(jìn)患者康復(fù)。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備(1)在無菌條件下，取離開母體時(shí)間不超過2h的新鮮臍帶，并篩查產(chǎn)婦是否攜帶傳染性疾病病原體(乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體和艾滋病抗體陰性)，將新鮮臍帶置于含有雙抗的pbs于4℃保溫箱中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；(2)將新鮮臍帶用無菌的pbs清洗，75％乙醇消毒，然后再用pbs清洗；(3)將臍帶剪碎成20mm3大小的塊，并以0.5～1cm的間距均勻接種于培養(yǎng)皿中，緩慢加入dmem-f12完全培養(yǎng)基(購(gòu)自gibco)，然后置于37℃，co2濃度為5％的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)；其中，完全培養(yǎng)基的添加量為50～100μl/cm2；(4)待細(xì)胞貼壁融合后，使用胰酶進(jìn)行消化、離心，分裝至多個(gè)培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(5)待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)80％以上，用胰酶消化，離心，繼續(xù)傳代培養(yǎng)；(6)收集第三代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，用pbs緩沖液洗滌，離心，用注射級(jí)生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞終濃度為0.125×106～0.75×106個(gè)/ml的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。實(shí)施例2nkt細(xì)胞制劑的制備(1)采集40ml的外周血，將其與生理鹽水按體積比1:1混勻，然后將混合溶液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液(axis-shield公司)中，其中混合溶液與淋巴細(xì)胞分離液的體積比為2:1；接著，700g離心20min；(2)離心后的離心管從上至下依次為單個(gè)核細(xì)胞層(pbmc)、淋巴細(xì)胞分離液層和紅細(xì)胞層；收集單個(gè)核細(xì)胞層，采用生理鹽水重懸、洗滌，500g離心10min，如此重復(fù)洗滌2次；(3)將單個(gè)核細(xì)胞用rpm1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，以1×106個(gè)/ml密度接種于培養(yǎng)瓶中，添加細(xì)胞生長(zhǎng)因子il-2和il-15，然后置于37℃，濃度為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；其中，il-2的終濃度為500u/ml，il-15的終濃度為30ng/ml；(4)誘導(dǎo)至第5天后，進(jìn)行補(bǔ)液，全量補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)因子il-2和il-15，補(bǔ)液前細(xì)胞密度小于3×106個(gè)/ml，補(bǔ)液后細(xì)胞密度在0.5～1×106個(gè)/ml，此后，每隔3天補(bǔ)液和補(bǔ)加細(xì)胞生長(zhǎng)因子；(5)至第14天后收集單個(gè)核細(xì)胞，500g離心10min，去上清，然后用注射級(jí)生理鹽水重懸洗滌，再500g離心10min，重復(fù)洗滌一遍，接著用注射級(jí)生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞終濃度為1.25×106～12.5×106個(gè)/ml的nkt細(xì)胞制劑。對(duì)比例1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的制備(1)采集骨髓組織20ml，將骨髓組織和dmem-f12培養(yǎng)基(購(gòu)自gibco公司)按照1:3的體積比混勻，然后接種到15cm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h；(2)72h后換液，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)；(3)觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)80％至90％時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)；(4)傳代至第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)85％以上，用胰酶消化，并用pbs緩沖液洗滌，離心，用注射級(jí)生理鹽水重懸細(xì)胞，得到細(xì)胞終濃度為0.125×106～0.75×106個(gè)/ml的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。實(shí)施例3根據(jù)經(jīng)典的wagner分級(jí)法，糖尿病足患者的損傷程度可以分為5級(jí)，包括0級(jí)：有發(fā)生足潰瘍危險(xiǎn)的足，皮膚無開放性病灶；1級(jí)：表面有潰瘍，臨床上無感染；2級(jí)：較深的潰瘍感染病灶，常合并軟組織炎，無膿腫或骨的感染；3級(jí)：深度感染，伴有骨組織病變或膿腫；4級(jí)：骨質(zhì)缺損，部分趾、足壞疽；5級(jí)：足的大部或全部壞疽。納入2級(jí)和3級(jí)糖尿病足患者各30名，隨機(jī)分為3組，每組2級(jí)、3級(jí)糖尿病足患者各10名，依次為組合制劑組、對(duì)照組1和對(duì)照組2，按照以下方法進(jìn)行治療：組合制劑組：將實(shí)施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑和實(shí)施例2的nkt細(xì)胞制劑組合回輸給20位缺血性糖尿病足患者，其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的劑量為5×107個(gè)，nkt細(xì)胞制劑的劑量為5×108個(gè)；回輸方法為第1天回輸臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，第2天回輸nkt細(xì)胞制劑，以一個(gè)月為療程，連續(xù)回輸12個(gè)療程，然后觀察其療效。對(duì)照組1：將實(shí)施例1的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑回輸給20位缺血性糖尿病足患者，其中臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的劑量為5×107個(gè)，回輸方法為第1天和第2天均回輸臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，以一個(gè)月為療程，連續(xù)回輸12個(gè)療程，觀察其療效。對(duì)照組2：將對(duì)比例1的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑回輸給20位缺血性糖尿病足患者，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑的劑量為5×107個(gè)，回輸方法為第1天和第2天均回輸骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制劑，以一個(gè)月為療程，連續(xù)回輸12個(gè)療程，觀察其療效。給予糖尿病足患者組合制劑組、對(duì)照組1和對(duì)照組2一年治療后，60名患者按照wagner分級(jí)法評(píng)分如表1、表2所示，組合制劑組轉(zhuǎn)化為0級(jí)的患者數(shù)明顯高于對(duì)照組1和對(duì)照組2，無明顯改善的患者數(shù)明顯少于對(duì)照組1和對(duì)照組2，表明本發(fā)明組合細(xì)胞制劑能明顯促進(jìn)糖尿病足患者傷口的愈合。表1：不同制劑治療2級(jí)糖尿病足患者后的轉(zhuǎn)化情況組別無明顯變化(例)轉(zhuǎn)化為1級(jí)(例)轉(zhuǎn)化為0級(jí)(例)組合制劑組136對(duì)照組1442對(duì)照組2433表2：不同制劑治療3級(jí)糖尿病足患者后的轉(zhuǎn)化情況實(shí)施例4分別抽取組合細(xì)胞制劑、實(shí)施例1、對(duì)比例1中的第3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和組合制劑中的外周血誘導(dǎo)培養(yǎng)的nkt細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)：(1)取1×106個(gè)第3代間充質(zhì)干細(xì)胞，250g離心5min去上清，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；避光加入cd73、cd90、cd105、cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr抗體各2.5μl室溫孵育30min，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；用500mlrpmi1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并過濾，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。(2)取3×106個(gè)nkt細(xì)胞，250g離心5min去上清，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次，避光加入cd3、cd4、cd8和cd56各2.5μl室溫孵育30min，用含10％fbs的pbs溶液清洗2次，用500mlrpmi1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并過濾，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表4所示。流式檢測(cè)結(jié)果顯示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)cd105、cd73、cd90(表達(dá)量高于90％)，不表達(dá)cd45、cd34、cd19、cd11b和hla-dr(表達(dá)量低于2％)，顯示間充質(zhì)干細(xì)胞屬性；nkt細(xì)胞表達(dá)cd3+cd56+(表達(dá)量高于20％)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，顯示nkt細(xì)胞屬性。表3：間充質(zhì)干細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果表4：nkt細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果標(biāo)記抗體cd3+cd56+組合制劑56.7％當(dāng)前第1頁(yè)12