本發(fā)明屬于海洋生物技術領域，尤其涉及一種水綿乙醇提取物的制備方法和應用。

背景技術：

水綿屬(spirogyra)屬于綠藻門，綠藻植物綱(chloropsida)，雙星藻目(orderzygnematales)，雙星藻科(familyzygnemaceae)。水綿是水綿屬綠藻的總稱，又名水青苔、石衣、水衣、水苔等，是一種普遍生活在淡水里的真核多細胞藻類，是一種單列的長筒狀細胞構(gòu)成的絲狀體，在水中多呈團狀，世界上大概有超過400種水綿，廣布于池塘、溝渠、河流、湖泊和稻田。水綿以絲狀體斷裂再生或行接合生殖，由孢子萌發(fā)成新的個體，隨水傳播，水綿生命力和繁殖力極強。

水綿可作為某些魚類的餌料，曬干可作為食物。目前國內(nèi)對水綿的研究主要集中在環(huán)境保護方面，如水綿的水質(zhì)凈化、減輕水體富營養(yǎng)化作用；而關于水綿藥用作用的相關報道較為少見。《中華本草》記載可以以水綿葉狀體入藥，味甘，性平，具有清熱解毒、利濕的作用，可用于治療丹毒、燙火傷、癰腫和漆瘡。羅群等發(fā)表的論文“水綿有效成分的提取及其抑菌作用”公開了水綿水提取物對大腸桿菌具有明顯的抑制作用，而不同體積分數(shù)的乙醇、不同提取時間提取得到的水綿乙醇超聲提取物性質(zhì)不穩(wěn)定，其中，不同體積分數(shù)乙醇的水綿提取物對大腸桿菌均無明顯的抑制作用；與其他體積分數(shù)乙醇的水綿提取物相比較，60％乙醇的水綿提取物對枯草芽孢桿菌的抑制作用最為明顯；而95％乙醇提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均無明顯的抑制作用。

經(jīng)檢索，未見有關于水綿具有抗氧化和抗衰老作用方面的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種水綿乙醇提取物的制備方法。本發(fā)明制備得到的水綿乙醇提取物具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明的技術方案將通過下面的詳細描述來進一步體現(xiàn)和說明。

一種水綿乙醇提取物的制備方法，包括如下步驟：

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍10～12小時，室溫融化10～12小時，反復凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心10～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分數(shù)為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心10～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，即得水綿乙醇提取物。

優(yōu)選地，步驟s2中按沉淀與乙醇的固液比0.8～1.5g/ml加入乙醇進行超聲提取。

優(yōu)選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優(yōu)選地，步驟s2中每次超聲提取的時間為10～30min。

本發(fā)明制備得到的水綿乙醇提取物具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

此外，本發(fā)明發(fā)明人在進一步的研究中，意外地發(fā)現(xiàn)，對上述制備水綿乙醇提取物過程中，分離水綿乙醇提取物后，對剩余的沉淀進行進一步處理得到的水綿水提取物，同樣具有顯著的抗氧化、抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。其中，所述水綿水提取物的制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融3次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數(shù)為70％的乙醇超聲提取4次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水在溫度為70℃的條件下提取5次，每次60min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級水調(diào)節(jié)其相對于水綿(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示水綿濕藻)，即得水綿水提取物。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)在整體動物水平上以氧化應激模型及衰老相關模型進行試驗的試驗結(jié)果表明，本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物可以顯著延長氧化脅迫條件下和自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，具有顯著的抗衰老作用。

(2)本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物能促進體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)水平，具有顯著的抗氧化作用。

(3)本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物的制備方法具有周期短，有機溶劑消耗少，工藝簡單，安全無毒，穩(wěn)定高效等特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1水綿乙醇提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

圖2水綿乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

圖3水綿乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

圖4水綿水提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

圖5水綿水提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。

本發(fā)明所述水綿(spirogyrasp.)由中國科學院水生生物研究所提供，其在中國科學院淡水藻種庫中的編號為fachb-738。

本發(fā)明人在對水綿進行研究的過程中，進行了大量的試驗，意外發(fā)現(xiàn)對水綿濕藻反復凍融，離心取上清后剩余的沉淀進行乙醇超聲提取制得到的水綿乙醇提取物，有效成分穩(wěn)定，70％～99％乙醇的水綿乙醇提取物均能夠延長自然條件下和氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命，促進體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)的水平，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明水綿乙醇提取物可單獨或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優(yōu)選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發(fā)明所述的抗氧化、抗衰老作用是指對以病理或生理條件下因發(fā)生氧化應激反應所產(chǎn)生的變化為主要特征的衰老及衰老相關疾病的防治作用。

本發(fā)明實施例中所使用的試驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例中所述sbasal溶液和smedium溶液的制備方法如下：

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃?zhèn)溆谩?/p>

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無色透明轉(zhuǎn)為微乳白透明，無明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實施例1水綿乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融4次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按沉淀與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數(shù)為80％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為25min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于水綿(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示水綿濕藻)，即得水綿乙醇提取物。

實施例2水綿乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時，室溫融化10小時，反復凍融5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按沉淀與乙醇的固液比0.8g/ml加入體積分數(shù)為70％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為30min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于水綿(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示水綿濕藻)，即得水綿乙醇提取物。

實施例3水綿乙醇提取物的制備

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍10小時，室溫融化12小時，反復凍融4次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按沉淀與乙醇的固液比1.5g/ml加入體積分數(shù)為90％的乙醇超聲提取2次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液進行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級水溶解，調(diào)節(jié)其相對于水綿(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示水綿濕藻)，即得水綿乙醇提取物。

實施例4水綿乙醇提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國明尼蘇達大學秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中加入終濃度為100mga/ml的實施例1制備的水綿乙醇提取物，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)，然后每隔1天統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進行分析。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，與對照組相比，水綿乙醇提取物相能夠延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物具有延緩衰老進程的作用。

實施例5水綿乙醇提取物對氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實施例1制得的水綿乙醇提取物，按終濃度100mga/ml加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進行分析。結(jié)果如圖2所示。

百草枯，學名甲基紫精，是一種強氧化劑，可誘導體內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧自由基(ros)，使機體處于氧化脅迫環(huán)境，進而出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。圖2結(jié)果顯示，水綿乙醇提取物能夠延長氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時間，提高其存活率。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實施例6水綿乙醇提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設試驗組和對照組，每組設兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例1制得的水綿乙醇提取物，水綿乙醇提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組水綿乙醇提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購于sigma公司，cas號：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標儀在485nm激發(fā)波長和538nm發(fā)射波長下檢測熒光強度，室溫檢測2h，每10min測一次。結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)水綿乙醇提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的水綿乙醇提取物能夠促進體內(nèi)ros的清除，顯著降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

實施例7水綿水提取物的制備

s1、取新鮮的水綿濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時，室溫融化12小時，反復凍融3次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分數(shù)為70％的乙醇超聲提取4次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時間為20min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級水的固液比1g/ml加入一級水在溫度為70℃的條件下提取5次，每次60min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級水調(diào)節(jié)其相對于水綿(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示水綿濕藻)，即得水綿水提取物。

實施例8水綿水提取物對自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實施例7制備的水綿水提取物，對照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)，然后每隔1天統(tǒng)計秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進行分析。結(jié)果如圖4所示。

圖4結(jié)果顯示，與對照組相比，水綿水提取物相能夠延長自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的水綿水提取物具有延緩衰老進程的作用。

實施例9水綿水提取物對秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設試驗組和對照組，每組設兩個孔，每孔終體積為1ml，試驗組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實施例7制得的水綿水提取物，水綿水提取物的終濃度100mga/ml，對照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗組水綿水提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針溶液，利用熒光酶標儀在485nm激發(fā)波長和538nm發(fā)射波長下檢測熒光強度，室溫檢測2h，每10min測一次。結(jié)果如圖5所示。

圖5結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)水綿水提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗結(jié)果表明本發(fā)明提供的水綿水提取物能夠促進體內(nèi)ros的清除，顯著降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。