本發(fā)明涉及植物有效成分提取技術領域，具體來說是一種從加拿大一枝黃花中提取抗氧化物的方法。

背景技術：

目前在醫(yī)療和食品領域使用較多的是合成抗氧劑，但動物實驗研究表明，合成抗氧劑，如bht、bha對生物體具有潛在的毒副作用。天然抗氧化劑因具有無毒副作用、無殘留、無污染、穩(wěn)定、安全等優(yōu)點而越來越受到人們的關注，在醫(yī)藥學、保健與功能食品、美容養(yǎng)顏護膚等領域有非常重要的意義。

加拿大一枝黃花(solidagocanadensisl.)原產(chǎn)北美，1931年作為花卉植物引入我國，后溢生為惡性雜草，其繁殖力強，傳播速度快，嚴重破壞生態(tài)環(huán)境并造成嚴重的經(jīng)濟損失。研究結果表明加拿大一枝黃花天然化學成分豐富，富含黃酮和多酚類等抗氧化活性物質(zhì)，因此進一步對加拿大一枝黃花中的活性物質(zhì)進行開發(fā)利用，既實現(xiàn)對外來入侵植物的綜合利用和調(diào)控，又能制備大量天然抗氧化劑，具有重要的生態(tài)、經(jīng)濟和社會意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從加拿大一枝黃花中提取抗氧化物的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種從加拿大一枝黃花中提取抗氧化物的方法，步驟包括：

(1)將加拿大一枝黃花洗凈，陰干，烘至恒重，粉碎過20-100目篩；

(2)粉末中加入體積濃度為50-95％乙醇溶液，超聲提取并過濾，濾液濃縮至無溶劑得到濃縮物；

(3)濃縮物分散于水中，用石油醚萃取4次，除去色素，保留水相；

(4)向水相中加入乙酸乙酯溶劑，萃取4次，保留上層有機相，合并萃取物：

(5)萃取物濃縮干燥即得抗氧化劑。

進一步的，步驟(1)中，所述加拿大一枝黃花為地上部分，烘干條件為40℃恒溫鼓風干燥。

進一步的，步驟(2)中，所述乙醇的質(zhì)量分數(shù)為70％，超聲波提取的功率為1kw，提取時間30min。

進一步的，步驟(3)中，所述石油醚與濃縮物的水溶液的體積比為3:1。

進一步的，步驟(4)中，所述乙酸乙酯與水相的體積比為3:1。

進一步的，步驟(5)中，所述濃縮為42℃減壓濃縮，干燥是40℃減壓真空干燥。

本發(fā)明提取的抗氧化物主要以多酚和黃酮類化學成分為主。

本發(fā)明的有益技術效果是：本發(fā)明的優(yōu)點在于材料來源廣，成本低廉，提取工藝簡單，抗氧化活性與天然抗氧化劑vc相比具明顯優(yōu)勢。

附圖說明

圖1是加拿大一枝黃花總提取物及其各萃取物清除abts自由基的能力結果圖；

圖2是加拿大一枝黃花對鐵離子的還原能力結果圖；

圖3是加拿大一枝黃花總提取物及其各萃取物氧自由基吸收能力結果圖。

具體實施方式

下面將結合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

一種從加拿大一枝黃花中提取抗氧化物的方法，步驟包括：

(1)將加拿大一枝黃花地上部分洗凈，陰干，40℃恒溫鼓風烘至恒重，粉碎；

(2)粉末中加入質(zhì)量分數(shù)為70％乙醇溶液，設置超聲功率為1kw、提取并過濾30min，上清液弄死至無溶劑得到濃縮物；

(3)濃縮物分散于水中，用濃縮物水溶液3倍體積的石油醚萃取4次，除去色素，保留水相；

(4)向水相中加入3倍體積的乙酸乙酯溶劑，萃取4次，保留上層有機相，合并萃取物：

(5)萃取物42℃減壓濃縮后40℃真空干燥即得抗氧化劑。

實施例2

從加拿大一枝黃花提取的抗氧化活性驗證

主要試劑和儀器：

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(abts)、2,4,6-三吡啶基三嗪(tptz)、2,2-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫(aaph)、維生素e水溶性類似物(trolox)和抗壞血酸(vc)，美國sigma-aldrich公司；分析純，天津市大茂化學試劑廠；kq-500de型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；n-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；synergyh1型酶標儀：美國biotek公司。

樣品制備：

加拿大一枝黃花乙醇提取物(總提取物)、乙酸乙酯萃取物、水飽和正丁醇萃取物和水層剩余物按如下方法制備：將加拿大一枝黃花地上部分用清水洗凈，于通風處陰干3d，剪碎后40℃烘干直至恒重，粉碎。準確稱取加拿大一枝黃花粉末480.0g，用體積分數(shù)為70％的乙醇室溫下浸泡12h，超聲波輔助提取30min，重復4次，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至浸膏后稱重，得乙醇提取物(總提取物)。后取部分總提取物加水混懸，用有機溶劑石油醚萃取，去除色素，后依次用乙酸乙酯和水飽和正丁醇與分散液按體積比3:1混和進行萃取，重復萃取4次，合并萃取液，回收溶劑，濃縮至浸膏后稱重，分別得到加拿大一枝黃花乙酸乙酯萃取物、水飽和正丁醇萃取物和水層剩余物。

1、加拿大一枝黃花清除abts自由基能力的測定

配置含7.0mmabts和2.45mm過硫酸鉀的abts自由基溶液，室溫避光12h后用甲醇稀釋到在734nm的吸光值為0.7±0.2(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

取適宜濃度的樣品50.0μl(用乙醇配置)和abts自由基溶液200.0μl于96孔板中，室溫反應6min后于734nm處測樣品吸光值(as)，用甲醇代替abts自由基溶液為樣品組在反應體系中自身的吸光值(ab)，用乙醇代替樣品為樣品空白組吸光值(ac)，所有測定平行3次，對照樣品為vc。樣品的抗氧化程度用對abts自由基的清除率表示，抗氧化能力用半數(shù)清除率ic50值表示，ic50值越低，抗氧化活性越強。清除率的計算公式采用式(1)，根據(jù)樣品濃度與清除率的關系用origion8.6軟件進行非線性擬合，得ic50值。按(1)式計算對abts自由基的清除率。

清除率＝[(ac-(as-ab))/ac]*100％式(1)

2、加拿大一枝黃花鐵離子還原能力(frap)的測定

frap(ferricreducingabilityofplasma)法反映被測樣品的總抗氧化能力，能夠體現(xiàn)待測樣品整體抗氧化水平，該法常被用以表明樣品的抗氧化功能特性，其原理是抗氧化活性物質(zhì)將fe³⁺還原為fe²⁺，fe²⁺與三吡啶三吖嗪(tptz)結合生成明顯的有色絡合物，并在波長593nm處有最大吸收。吸光值越大，表明待測樣品有越強的還原能力。樣品的還原能力以達到相同吸光值的feso4當量濃度表示，記為frap值。

frap工作液配制：①配制10mmol/l的tptz溶液(準確稱取0.0312gtptz于小燒杯中，用40mmol/l的鹽酸溶解，并定容至10ml容量瓶中，置于冰箱避光冷藏備用)；②配制20mmol/l的三氯化鐵溶液(準確稱取0.5406gfecl3·6h2o于小燒杯中，用蒸餾水溶解，并定容至100ml容量瓶中)；③配制ph3.6的乙酸緩沖液(將30mmol/l的乙酸溶液與30mmol/l的乙酸鈉溶液按體積比9.25:0.75的比例混勻，調(diào)至ph3.6)。將以上三者按照體積比1：1：10的比例混合，在37℃恒溫水浴鍋中保溫備用。

feso4標準曲線的繪制：配制100μg/ml的feso4溶液，采用倍稀法，準確移取feso4溶液25μl于含有25μl乙醇的酶標板中，各加入300μlfrap工作液，迅速搖勻后，置于37℃恒溫水浴鍋中反應10min，于波長593nm處測定吸光值，平行3次。繪制feso4標準曲線，試驗所得feso4標準曲線方程為y＝0.0055x-0.0073，(r²＝0.995)。

樣品鐵離子還原能力的測定：配制樣品溶液，準確移取25μl的樣品溶液于酶標板中，加入300μlfrap工作液，迅速搖勻后，置于37℃恒溫水浴鍋中反應10min，于波長593nm處測定吸光值，平行3次。根據(jù)feso4標準曲線，計算相同吸光值下feso4的當量濃度，記為frap值。

3、加拿大一枝黃花氧自由基吸收能力(orac)的測定

orac是氧自由基吸收能力(oxygenradicalabsorbancecapacity)的縮寫，也被稱為抗氧化能力指數(shù)，orac分析法中的自由基主要來源于偶氮化合物2，2'-偶氮-雙-(2-脒基丙烷)氯化二氫[2，2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，aaph]熱分解產(chǎn)生的過氧化氫自由基，也可以是芬頓(fenton)反應過程中產(chǎn)生的羥自由基，以熒光素鈉(sodiumflourescein，fl)為熒光探針，觀察自由基與熒光探針作用后，探針熒光強度的衰退過程，以水溶性維生素e類似物(6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，trolox)作為抗氧化標準物質(zhì)，檢測體系中各種抗氧化劑延緩探針熒光強度衰退的能力，以此評價抗氧化劑的抗氧化能力。

磷酸鹽緩沖液的制備：精密量取適量磷酸，以高純水稀釋得到75mmol/l磷酸溶液；

準確稱取4.3235g磷酸，以高純水定容至500ml。稱取8.56g磷酸氫二鉀以高純水500ml溶解，以磷酸溶液調(diào)ph＝7.4，即得75mmol/lph7.4的磷酸鹽緩沖液。

aaph溶液的制備：精密稱取aaph207mg，以磷酸鹽緩沖液溶解并定容至5ml量瓶，即得濃度為153mmol/l的aaph溶液。

fl溶液的制備：準確稱取0.0301gfl(30mg)，定容至100ml，此時濃度為0.8mmol/l，記為母液a。

吸取1ml母液a，定容至100ml，此時濃度為8×10^-3mmol/l，記為母液b。

吸取1ml母液b，定容至100ml，此時濃度為8×10^-5mol/l，此為fl稀釋液。

trolox溶液配制trolox母液10mmol/l，量取100ul，定容至10ml，此時濃度為100ug/ml。

精密吸取不同濃度樣品溶液25.0μl(用乙醇配置)，再加入fl稀釋液150.0μl于96孔板中，隨后振蕩5min，37℃溫育10min后迅速加入aaph液25.0μl啟動反應，以激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長535nm進行測定并記錄熒光值，反應過程中每隔1.5min測定一次熒光值，測定時間設定在熒光衰減呈基線后為止，所有測定平行3次。以測定時間為橫坐標，熒光值為縱坐標繪制trolox系列標準溶液和不同濃度樣品熒光衰變曲線，試驗得trolox系列標準溶液的標準曲線方程為y＝5.8211x-0.7086，(r²＝0.997)。

實驗所得的各微孔不同時間點的絕對熒光強度數(shù)據(jù)與其初始時間的熒光強度相比，折算成相對熒光強度f，以相對熒光強度采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積(areaunderthecurve，auc)。其公式為：auc＝0.5×[2×(f0+f1+···+fn-1+fn)-f0-fn]×△t，其中fn表示第n個測定點的相對熒光強度，△t標示相鄰兩個時間點之間的時間間隔(即1.5min)，根據(jù)上述公式可簡化為：auc＝0.75×(f0+f1+···+fn-1+fn)-f0-fn。測定結果以orac值表示，即以相當于trolox的微克數(shù)表示(μg/mg)，按以下公式(2)計算：

orac值＝[(aucsample-auc﹢aaph)/(auctrolox-auc﹢aaph)](molarityoftrolox/molarityofsample)式(2)

數(shù)據(jù)分析采用spss17.0和origin8.6軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。所有實驗平行3次，實驗結果以平均值±標準偏差表示，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

6、試驗結果

加拿大一枝黃花總提取物及其各萃取物清除abts自由基的能力見圖1。

從圖1可知，加拿大一枝黃花總提取物及其各萃取物對abts自由基均具有清除作用，在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增大，清除率升高。

加拿大一枝黃花總提取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水層剩余物和vc的ic50值分別為59.32、55.52、159.35、129.10和306.76μg/ml。ic50值越小，抗氧化能力越強，因此清除abts自由基的能力由強到弱依次為乙酸乙酯萃取物＞總提取物＞水層剩余物＞vc＞正丁醇萃取物。

乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最強，且強于陽性對照vc(p＜0.01)，是vc的5.53倍。

加拿大一枝黃花對鐵離子的還原能力見圖2，由圖2可知還原能力的大小依次為乙酸乙酯萃取物＞vc＞總提取物＞正丁醇萃取物＞水層剩余物。

乙酸乙酯萃取物比vc的抗氧化能力強(p＜0.05)，且是vc的1.33倍。

由圖3可知加拿大一枝黃花總提取物及其各萃取物氧自由基吸收能力的大小依次為乙酸乙酯萃取物＞vc＞正丁醇萃取物＞水層剩余物＞總提取物。

氧自由基吸收能力試結果表明乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最強，是vc的1.40倍，這與清除abts自由基和frap試驗所得的試驗結果一致。

外來入侵植物加拿大一枝黃花乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力強，與vc相比具有更強的抗氧化活性。

最后所應說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍當中。