本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要成分，分布于機體的各個器官，是生物體內(nèi)含量最多、最豐富的蛋白質(zhì)，約占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25％～30％。膠原蛋白含有大量極性基團，具有表面活性和很好的相容性。膠原蛋白獨特的三股螺旋結(jié)構(gòu)，賦予其良好的生物相容性、生物可降解性、低抗原性等特性。此外，膠原分子能夠激活內(nèi)源性凝血途徑，且含有的羥基脯氨酸又是一種起修復(fù)作用的氨基酸，當膠原與血小板作用后，能快速引起后繼的與血液聚集相關(guān)聯(lián)的一系列過程的進行，從而迅速凝血，達到止血效果；同時，膠原蛋白能促進成纖維細胞的增殖和分化，誘導(dǎo)成核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的聚集，促進毛細血管生長，進而加速組織再生和創(chuàng)面愈合。因此，膠原蛋白已在醫(yī)藥、生物組織工程等方面展現(xiàn)出極大潛力。
明膠是膠原的溫和斷裂降解產(chǎn)物，是分子量分布很寬的多肽分子混合物，分子量一般在幾萬至十幾萬。明膠為親水性膠體，是一種兩性電解質(zhì)。明膠分子結(jié)構(gòu)上有大量的羥基，另外還有許多羧基和氨基；明膠含有內(nèi)氨酸、甘氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸等人體所需的18種氨基酸，但明膠屬于營養(yǎng)不完全蛋白質(zhì)，缺乏某些必需氨基酸，尤其是色氨酸。明膠易溶于溫水，其溶解度與凝固溫度相差很小，易受水份、溫度、濕度的影響而變質(zhì)。正因為明膠的凝膠性、固水性、粘合性和溶解性等多種特性，使其醫(yī)藥行業(yè)有廣泛的用途。
現(xiàn)有的止血膠原蛋白海綿多用牛跟腱為原料進行提取膠原蛋白或明膠后，結(jié)合其他高分子生物材料、高分子聚合物或制備技術(shù)進行膠原蛋白海綿的制備，品種單一，因此開發(fā)效果更佳的多樣的止血膠原蛋白海綿具有重要的意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿，該膠原蛋白海綿能加速出血部位的止血速度，并且在組織愈合的同時逐漸降解，降解產(chǎn)物通過促進細胞增殖等作用，起到促進創(chuàng)傷修復(fù)的作用。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿的應(yīng)用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
一種具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿，其特征在于，所述具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿是由牦牛皮膠原蛋白及牦牛皮明膠構(gòu)成；
進一步，所述具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿是由混合溶液冷凍干燥或直接干燥得到的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的支架；
進一步，所述具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿是由混合溶液冷凍干燥或直接干燥得到的具有三維多孔結(jié)構(gòu)的支架，所述支架具備以下特點：質(zhì)量≥5mg/cm3，拉力≥65g/cm2，吸水量不小于吸水前自身重量的17倍，總蛋白含量≥總重量的65％(m/m)，厚度為1～6毫米。
一種具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將新鮮的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干凈，然后剔除牦牛毛，剪成長5～8cm、寬5～8cm小塊，并除去表層和皮下組織層，得到的牦牛皮真皮層小塊；
(2)i型膠原制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊進一步切碎，長1～3mm，寬1～3mm。0.5mol·l-1醋酸溶液，料液比1:10～30，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.0～2.5。低溫攪拌提取16～36h，過濾、鹽析、純化，冷凍干燥后備用；
(3)明膠制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊直接進行水提，得到提取液，該提取液利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜過濾后，得到上下層不同分子量范圍的提取液，將所述上層提取液濃縮，冷凍干燥后備用；
(4)將步驟(2)和步驟(3)所得的樣品按照質(zhì)量比1:1～4混合后加蒸餾水低溫溶解，濃縮料液比至1:0.6～0.2；
(5)將步驟(4)所得的濃縮溶液真空或離心脫氣后倒入磨具，將模具于-80℃冷凍4～8h后冷凍干燥，得到所述的快速止血牦牛皮膠原蛋白海綿。
優(yōu)選的，步驟(2)所述的加nacl進行鹽析，nacl最終濃度至3～5mol/l，之后的反復(fù)鹽析用梯度2.5～0.9mol/l逐級鹽析；
優(yōu)選的，步驟(3)所述牦牛皮提取的明膠的分子量10～180kda；
優(yōu)選的，步驟(3)所述水提的條件是指料液比為1：10～20，溫度為65～100℃，提取次數(shù)1～4次，每次3～8小時；
優(yōu)選的，步驟(3)所述的微孔濾膜是指濾過分子量為10kda孔徑的濾膜至孔徑為0.1μm的濾膜；
優(yōu)選的，步驟(3)(4)所述的濃縮的條件是低溫常壓濃縮，溫度30～40℃或壓力為0.09mpa，真空度為500～600mmhg的加壓濃縮；
優(yōu)選的，步驟(2)(3)(5)所述的冷凍干燥是在-10～-80℃冷凍4～8h，然后在真空、冷阱溫度-60℃下冷凍干燥16～20h；
優(yōu)選的，步驟(3)所述的冷凍干燥是在-20～-80℃冷凍5～7h，然后在真空、冷阱溫度-60℃下冷凍干燥16～20h。
所述一種具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿在外表皮出血的止血，內(nèi)臟組織大量出血的止血，神經(jīng)外科，骨科，婦科及普外科手術(shù)中止血和創(chuàng)傷修復(fù)應(yīng)用。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：
1.本發(fā)明以青藏高原牦牛的皮為原料，利用牦牛生長于高寒地區(qū)，牦牛皮的無污染性，及其所提取膠原/明膠相比其他來源明膠的高變性溫度(參見表1)的可能原因——膠原蛋白氨基酸序列的特殊性，開發(fā)新的膠原蛋白海綿的制備原材料，提高牦牛皮的附加值。
2.本發(fā)明提取方法中所用提取溶劑為純水，后期僅低溫冷凍及冷凍干燥，提取制備方法成本低。
3.本發(fā)明快速止血膠原蛋白海綿使用操作方便，膜強度高；柔韌性好。可根據(jù)使用要求的不同，選擇合適強度的支架材料。
4.本發(fā)明快速止血膠原蛋白海綿用途廣泛，能夠快速止血，保護傷口、促進愈合，以及用于神經(jīng)外科，骨科，婦科，普外科，手術(shù)室等臨床醫(yī)學(xué)其他領(lǐng)域。
5.本發(fā)明原料中截取高分子量的牦牛皮明膠，因為不同分子量明膠對血小板聚集的促進作用不一致，高分子量范圍的明膠止血效果更明顯。
6.本發(fā)明具有快速止血作用的牦牛皮膠原蛋白海綿能加速出血部位的止血速度，并且在組織愈合的同時逐漸降解，降解產(chǎn)物通過促進細胞增殖等作用，起到促進創(chuàng)傷修復(fù)的作用。
表1不同酶解時間牦牛皮膠樣品的dsc值(
不同的上標代表有統(tǒng)計差異，p<0.05。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
1.制備牦牛皮膠原蛋白海綿
(1)新鮮的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干凈，用5％的naoh溶液浸泡48h后剔除牦牛毛，用蒸餾水清洗3次至中性，剪成長5～7cm、寬5～7cm小塊，并除去表皮和皮下組織層，得到真皮層；
(2)i型膠原制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊進一步切碎，長1～2mm，寬1～2mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:15，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.0。低溫攪拌提取16h，過濾后，濾液中加入nacl進行鹽析，nacl最終濃度至4mol/l，攪拌10h，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級用2.5，1.8和0.9mol/l的nacl反復(fù)鹽析、酸溶，最后得到膠原粗提液；將粗提液裝入100kda孔徑的透析袋中，用0.04mol/l的醋酸溶液透析16h，再用蒸餾水透析16h，4h晃動透析袋一次，得到純化物后，冷凍干燥備用；
(3)明膠制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊直接進行水提，料液比為1:15，溫度為80℃，提取次數(shù)3次，每次5小時，三次提取液混合，該提取液利用0.1μm濾膜過濾后，將上層提取液在壓力為0.09mpa，真空度為550mmhg的條件下濃縮至1:0.2，冷凍干燥備用；
(4)將步驟(2)和步驟(3)所得的樣品按照質(zhì)量比1:1混合后加蒸餾水低溫溶解，濃縮料液比至1:0.2；
(5)將所得的濃縮溶液真空脫氣后倒入磨具，將模具于-20℃冷凍6h后在真空、冷肼溫度-60℃下冷凍干燥16h，即得到快速止血牦牛皮膠原蛋白海綿。
所制備的快速止血牦牛皮膠原海綿厚度約為3～5毫米，鈷60輻射滅菌后備用。
2.牦牛皮膠原蛋白海綿快速止血和修復(fù)創(chuàng)傷的效果實驗：以小鼠剪尾出血為模型，將直徑為0.4毫米，厚3～5毫米的原片狀牦牛皮膠原蛋白海綿貼附到剛剪尾出血的小鼠尾巴處，鼠尾停止出血時間小于10s，比空白鼠尾停止出血的時間縮短了25s左右。用膠原蛋白海綿止血的小鼠尾部1周左右，相比未用膠原蛋白海綿止血的小鼠尾部，傷口處有類似新生毛囊的生成，上皮組織有生長趨勢，創(chuàng)面和周圍皮膚接近，創(chuàng)面顏色較淡，較平整，表面被表皮細胞層覆蓋。
實施例2
1.制備牦牛皮膠原蛋白海綿
(1)新鮮的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干凈，用10％的naoh溶液浸泡12h后剔除牦牛毛，用蒸餾水清洗5次至中性，剪成長6～8cm、寬6～8cm小塊，并除去表皮和皮下組織層，得到真皮層；
(2)i型膠原制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊進一步切碎，長2～3mm，寬2～3mm。0.5mol·l-1醋酸溶液，料液比1:20，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:1.5。低溫攪拌提取24h，過濾后，濾液中加入nacl進行鹽析，nacl最終濃度至5mol/l，攪拌12h，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級用2.1，1.5和1.0mol/l的nacl反復(fù)鹽析、酸溶，最后得到膠原粗提液；將粗提液而裝入100kda孔徑的透析袋中，用0.08mol/l的醋酸溶液透析24h，再用蒸餾水透析24h，6h晃動透析袋一次，得到純化物后，冷凍干燥備用；
(3)明膠制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊直接進行水提，料液比為1:20，溫度為90℃，提取次數(shù)3次，每次6小時，三次提取液混合，該提取液利用0.1μm濾膜過濾后，將上層提取液在壓力為0.09mpa，真空度為600mmhg的條件下濃縮至1:0.4，冷凍干燥備用；
(4)將步驟(2)和步驟(3)所得的樣品按照質(zhì)量比1:3混合后加蒸餾水低溫溶解，濃縮料液比至1:0.3；
(5)將所得的濃縮溶液真空脫氣后倒入磨具，將模具于-80℃冷凍5h后在真空、冷肼溫度-60℃冷凍干燥14h，即得到快速止血牦牛皮膠原海綿。
所制備的快速止血牦牛皮膠原海綿厚度約為2～4毫米，鈷60輻射滅菌后備用。
2.牦牛皮膠原蛋白海綿快速止血和修復(fù)創(chuàng)傷的效果實驗：以小鼠剪尾出血為模型，將直徑為0.4毫米，厚2～4毫米的原片狀牦牛皮膠原蛋白海綿貼附到兔子耳部中央動脈創(chuàng)面，兔耳創(chuàng)面的止血時間在80～92s之間，比空白物理按壓止血時間縮短140s左右。2周后，膠原蛋白海綿止血的兔子耳部創(chuàng)傷面較平整，顏色較淡，接近周邊皮膚。
實施例3
1.制備牦牛皮膠原蛋白海綿
(1)新鮮的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干凈，用8％的naoh溶液浸泡36h后剔除牦牛毛，用蒸餾水清洗4次至中性，剪成長5～6cm、寬5～6cm小塊，并除去表皮和皮下組織層，得到真皮層；
(2)i型膠原制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊進一步切碎，長1～2mm，寬1～2mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:30，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:2。低溫攪拌提取24h，過濾后，濾液中加入nacl進行鹽析，nacl最終濃度至3mol/l，攪拌10h，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級用2.0，1.4和0.9mol/l的nacl反復(fù)鹽析、酸溶，最后得到膠原粗提液；將粗提液裝入100kda孔徑的透析袋中，用0.1mol/l的醋酸溶液透析24h，再用蒸餾水透析24h，4h晃動透析袋一次，得到純化物后，冷凍干燥備用；
(3)明膠制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊直接進行水提，料液比為1:20，溫度為90℃，提取次數(shù)2次，每次8小時，兩次提取液混合，該提取液利用15kda孔徑的濾膜過濾后，將上層提取液在壓力為0.09mpa，真空度為600mmhg的條件下濃縮至1:0.2，冷凍干燥備用；
(4)將步驟(2)和步驟(3)所得的樣品按照質(zhì)量比1:1混合后加蒸餾水低溫溶解，濃縮料液比至1:0.4；
(5)將所得的濃縮溶液真空脫氣后倒入磨具，將模具于-80℃冷凍6h后在真空、冷肼溫度-60℃冷凍干燥16h，即得到快速止血牦牛皮膠原海綿。
所制備的快速止血牦牛皮膠原海綿厚度約為1～3毫米，鈷60輻射滅菌后備用。
2.牦牛皮膠原蛋白海綿作為組織工程材料的效果實驗：膠原蛋白海綿與人皮膚表皮成纖維細胞共同培養(yǎng)，成纖維細胞可以正常生長，細胞形態(tài)正常，且隨著時間的退役，細胞與膠原海綿共培養(yǎng)物中的部分膠原蛋白變細，細胞數(shù)量增加，海綿的空隙越來越小。
實施例4
1.制備牦牛皮膠原蛋白海綿
(1)新鮮的青藏高原牦牛wildyak的牦牛皮清洗干凈，用10％的naoh溶液浸泡24h后剔除牦牛毛，用蒸餾水清洗5次至中性，剪成長7～8cm、寬7～8cm小塊，并除去表皮和皮下組織層，得到真皮層；
(2)i型膠原制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊進一步切碎，長2～3mm，寬2～3mm。0.5mol/l醋酸溶液，料液比1:25，牦牛皮:胃蛋白酶重量比100:2.5。低溫攪拌提取36h，過濾后，濾液中加入nacl進行鹽析，nacl最終濃度至3.5mol/l，攪拌12h，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級用2.5，1.6和1.1mol/l的nacl反復(fù)鹽析、酸溶，最后得到膠原粗提液；將粗提液裝入100kda孔徑的透析袋中，用0.08mol/l的醋酸溶液透析36h，再用蒸餾水透析36h，6h晃動透析袋一次，得到純化物后，冷凍干燥備用；
(3)明膠制備：步驟(1)得到的牦牛皮真皮層小塊直接進行水提，料液比為1:30，溫度為85℃，提取次數(shù)4次，每次5小時，四次提取液混合，該提取液利用15kda孔徑的濾膜過濾后，將上層提取液在壓力為0.09mpa，真空度為580mmhg的條件下濃縮至1:0.5，冷凍干燥備用；
(4)將步驟(2)和步驟(3)所得的樣品按照質(zhì)量比1:4混合后加蒸餾水低溫溶解，濃縮料液比至1:0.4；
(5)將所得的濃縮溶液真空脫氣后倒入磨具，將模具于-50℃冷凍8h后在真空、冷阱溫度-60℃下冷凍干燥18h，即得到快速止血牦牛皮膠原海綿。
所制備的快速止血牦牛皮膠原海綿厚度約為2～4毫米，鈷60輻射滅菌后備用。
2.牦牛皮膠原蛋白海綿作為組織工程材料的效果實驗：膠原蛋白海綿與人皮膚表皮成纖維細胞共同培養(yǎng)，成纖維細胞可以正常生長，且隨著時間的推移，細胞數(shù)量增加，海綿的空隙越來越小。用ao/eb熒光染色法檢測后，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)24h時，細胞的代謝活性沒有受到嚴重影響，且基本無細胞凋亡。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。