本發(fā)明涉及一種雨生紅球藻固體分散體、其制備方法和用途。
技術背景
雨生紅球藻(haematococcusagardh)是一種淡水產的單細胞綠藻，富含類胡蘿卜素、蛋白質、不溶性膳食纖維、維生素b2、維生素b12、煙酸、鈣、鎂、鋅等營養(yǎng)成分，是維生素b1、維生素b6的來源。另外，在生長過程中，受極端環(huán)境影響(如氨缺乏、強光照、溫度劇烈變化等不適宜條件)，藻體會由運動的營養(yǎng)細胞轉變?yōu)楹癖诘撵o孢子，同時大量積累紅色的蝦青素，被譽為天然蝦青素的“來源”、“濃縮品”。
蝦青素(astaxanthin)，又稱“蝦黃素”，是一種類胡蘿卜素?；瘜W名稱：3，3"-二羥基-4，4"-二酮基-β-胡蘿卜素，分子式c40h52o4。天然蝦青素是迄今為止自然界發(fā)現(xiàn)抗氧化活性最強的化合物之一，其抗氧化活性是維生素的550倍、類胡蘿卜素的10倍，被譽為“超級抗氧化劑”，對人體絕對安全。動物和臨床試驗研究證明，蝦青素有增強免疫功能、緩解運動疲勞、抑制腫瘤發(fā)生、預防心血管疾病、防止皮膚衰老、保護眼睛及中樞神經系統(tǒng)等多種生理功能。除此之外，蝦青素在緩解關節(jié)疼痛、預防老年癡呆等方面具有令人滿意的效果。
雨生紅球藻是繼螺旋藻、鹽藻之后的另一種經濟微藻，近年來已成為國內外健康產業(yè)研發(fā)熱點之一。在美國，雨生紅球藻粉已經獲得了fda的批準，允許作為新的膳食成分進入保健品市場；日本也被批準將其應用于食品和飼料行業(yè)；歐盟也已有相關產品注冊。中國國家衛(wèi)計委(原衛(wèi)生部)于2010年10月批準雨生紅球藻作為新資源食品(公告號：2010年第17號)，從此掀起國內系統(tǒng)研究、開發(fā)、應用雨生紅球藻的熱潮。截止目前，國內已形成雨生紅球藻養(yǎng)殖、采收、提取、深加工、產品研發(fā)生產為一體的產業(yè)鏈，以雨生紅球藻及其提取物為原料的食品、保健食品已被國家食品藥品監(jiān)督管理總局陸續(xù)批準上市，取得了較好的社會效益和經濟效益。
縱觀國內外雨生紅球藻產業(yè)研發(fā)應用現(xiàn)狀，至少存在以下技術瓶頸：
(1)雨生紅球藻在含有特定功能性成分--蝦青素的同時，還富含人體所必須的多種營養(yǎng)成分。而目前人工養(yǎng)殖雨生紅球藻主要作為天然蝦青素的獲取來源，對其全面、豐富的營養(yǎng)成分研究和應用不足，造成極大資源浪費；
(2)蝦青素并非雨生紅球藻固有，而是生長過程受外界環(huán)境(溫度、光照等)劇烈變化，通過應激反應而產生的次生代謝產物。蝦青素含量高低與雨生紅球藻生長過程應激反應程度密切相關。而目前國內雨生紅球藻養(yǎng)殖應激產生蝦青素的工藝并不成熟，其含量處于不可控狀態(tài)；
(3)蝦青素由于本身的超強抗氧化性，理化性質非常不穩(wěn)定，受溫度、光照影響極易氧化衰竭。未破壁的雨生紅球藻(粉)中蝦青素以游離、單酯、雙酯、多酯等多種形式存在于厚壁孢子中而保持相對穩(wěn)定，但很難被提取、開發(fā)、應用，使用價值極低；經破壁處理后的雨生紅球藻(粉)及其提取物，增大了蝦青素與外界接觸機會，若處理、包裝、保存不當，蝦青素可在處理過程中或運輸、保存過程中快速氧化衰竭(一般數(shù)天或數(shù)周衰竭殆盡)，使其開發(fā)、應用受到極大限制；
(4)蝦青素作為脂溶性β-胡蘿卜素，直接食用很難被吸收利用，生物利用度不高，需較大劑量(≥12mg/日)方可顯現(xiàn)保健功能。資源有效使用率較低，造成資源使用浪費。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在解決目前雨生紅球藻產業(yè)存在的技術瓶頸，提供一種全面使用雨生紅球藻營養(yǎng)及功能成分(蝦青素)、在普通包裝及常溫保存條件下顯著提高蝦青素穩(wěn)定性、食用后顯著提高蝦青素生物利用度、大幅度提高抗氧化活性、降低食用劑量的雨生紅球藻固體分散體及其制備方法和在藥品、保健食品、食品領域的應用。從而進一步開發(fā)、拓展、提升雨生紅球藻及其蝦青素的使用領域和應用價值。
本發(fā)明的第一目的是提供一種全面應用雨生紅球藻營養(yǎng)及功能成分(蝦青素)、顯著提高蝦青素穩(wěn)定性和生物利用度、大幅提高抗氧化活性、降低使用劑量的雨生紅球藻固體分散體。
本發(fā)明的第二目的是提供上述雨生紅球藻固體分散體的制備方法。
本發(fā)明的第三目的是提供上述方法制備的雨生紅球藻固體分散體在藥品、保健食品、食品領域的用途。
本發(fā)明的目的是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。
一方面，本發(fā)明提供一種雨生紅球藻固體分散體。所述雨生紅球藻固體分散體由破壁雨生紅球藻經co2超臨界抽提后的干燥藻渣、雨生紅球藻co2超臨界抽提物經包合和微囊化制備的包合微囊粉、固體分散載體三相組成。其中，干燥藻渣、包合微囊粉、固體分散載體三者質量比(w/w)為348～408:180～240:12；優(yōu)選為368～388:200～220:12；更優(yōu)選為375:213:12。
另一方面，本發(fā)明提供了上述雨生紅球藻固體分散體的制備方法，所述方法包括雨生紅球藻破壁、破壁雨生紅球藻抽提、抽提后剩余藻渣干燥、抽提物包合微囊粉制備、包合微囊粉與干燥藻渣形成固體分散體等具體實施步驟。
步驟1雨生紅球藻破壁
取人工養(yǎng)殖、采收的雨生紅球藻新鮮藻泥(含固量18～25％、蝦青素質量百分含量占干重≥3.0％)，脫水后置高壓均質機中充分破壁。處理壓力為：第一次30～40mpa，第二次80～90mpa，鏡檢或蝦青素含量檢測破壁率≥90％。
步驟2破壁雨生紅球藻抽提
將已破壁的雨生紅球藻移至co2超臨界萃取設備(ha121-50-02型co2超臨界萃取裝置，江蘇華安科研儀器有限公司)中充分萃取(溫度60～80℃，壓力35～45mpa，co2流速15～25l/h，萃取2～4小時)，收集抽提物。抽提物中蝦青素轉移率≥90％，蝦青素的質量百分含量為7～17％，優(yōu)選為9～15％，更優(yōu)選為11～13％。
步驟3抽提后剩余藻渣干燥
取雨生紅球藻經co2超臨界抽提后的剩余藻渣，添加75～82％的去離子水充分攪拌混勻，通過管道緩慢進入噴霧干燥塔(溫控≤180℃)進行噴霧干燥，收集干燥粉末(水分≤10.0％)(備注：所述干燥藻渣為co2超臨界抽提后剩余物，無任何輔料添加)，即得。
步驟4抽提物包合微囊粉制備
稱取雨生紅球藻co2超臨界抽提物，置帶研磨攪拌的潔凈容器中，按抽提物：輔料質量比(w/w)＝25:12～25添加藥學可接受的輔料β-環(huán)糊精、明膠、聚維酮(pvp)、改性淀粉、維生素e、維生素c、脂溶性迷迭香提取物、水溶性迷迭香提取物、l-乳酸鈣中的一種或幾種，充分攪拌、乳化、研磨成糊狀，低溫干燥后，再用有機溶劑洗滌干凈，干燥即得。蝦青素的質量百分含量為6～8％。
脂溶性提取物與藥學可接受輔料添加量質量比(w/w)為25:12～25、優(yōu)選為25:15～21、更優(yōu)選為25:17～19、最優(yōu)選為25:18。
步驟5固體分散體制備
按包合微囊粉:干燥藻渣：固體分散載體質量比(w/w)＝180～240:348～408:12稱取包合微囊粉、干燥藻渣和藥學可接受的輔料聚維酮(pvp)、木糖醇、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、枸櫞酸等中的一種或幾種作為固體分散載體。先將稱取的包合微囊粉和干燥藻渣置于帶研磨攪拌的潔凈容器中，添加95％乙醇(添加量為總質量20％)充分攪拌制成混懸液。再將稱取好的固體分散載體用純化水(用量為雨生紅球藻固體分散體總質量的20％)溶解混懸后，攪拌下緩慢添加至上述混懸液中，充分攪拌乳化，低溫抽去溶劑制成軟才，擠壓過20目篩，干燥，即得。
此外，本發(fā)明還提供了上述雨生紅球藻固體分散體在藥品、保健食品、功能性普通食品或其他食品方面的應用及用途。本發(fā)明所述雨生紅球藻固體分散體可以直接使用，也可加入藥學上可以接受的輔料制成粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或丸劑等多種口服固體制劑，還可作為原料與其他藥品、食品原料形成組合物。用于制備抗氧化、增強免疫功能、緩解運動疲勞、抑制腫瘤發(fā)生、預防心腦血管疾病、防止皮膚衰老、保護眼睛和中樞神經系統(tǒng)的藥物、保健食品、功能性普通食品或其他食品中的用途。
雨生紅球藻由于自身富含人體所需多種營養(yǎng)成分，且在生長過程中受外界環(huán)境刺激會產生超級抗氧化劑-----蝦青素，注定該生物具有特定營養(yǎng)和保健功能。作為開發(fā)應用雨生紅球藻的專業(yè)技術，必須綜合考慮其營養(yǎng)及保健功能價值，實現(xiàn)營養(yǎng)及功能成分的全面研究和應用最大化。本發(fā)明采用新鮮雨生紅球藻，通過高壓均質機破壁、co2超臨界萃取等行業(yè)較為成熟的技術，先將雨生紅球藻成功分離為營養(yǎng)成分(藻渣)與功能成分(提取物)兩相，然后摒棄過去雨生紅球藻產業(yè)通過抽提獲取蝦青素后將藻渣白白丟棄的做法，對提取物進行乳化、包合、微囊化技術處理，將脂溶性抽提物固體微囊化成與水混懸的包合微囊粉，顯著提高蝦青素穩(wěn)定性和生物利用度后，再將其返回到提取后剩余藻渣中，形成與原雨生紅球藻體系相似、但蝦青素穩(wěn)定性和生物利用度顯著提高的固體分散體。為雨生紅球藻更加系統(tǒng)、全面開發(fā)應用提供一種均一、穩(wěn)定、可控的固體分散體，便于進一步推廣應用。
與現(xiàn)有工藝技術比較，本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點和技術效果：
1)通過破壁、co2超臨界萃取等技術將雨生紅球藻分成提取相(功能成分)、藻渣相(營養(yǎng)成分)，然后對兩相分別進行工藝技術處理后再合二為一，實現(xiàn)了營養(yǎng)和功能成分的全面、最大化研究應用。
2)成功破解了未破壁的雨生紅球藻蝦青素存在于厚壁孢子、無法提取應用、使用價值低，而破壁的雨生紅球藻及其提取物、蝦青素不穩(wěn)定、保存運輸和使用受限的技術瓶頸。在不改變雨生紅球藻營養(yǎng)及功能成分構成體系的前提下，實現(xiàn)了破壁、蝦青素穩(wěn)定可控、常規(guī)包裝保存等，開發(fā)應用前景更為廣闊。
3)通過對脂溶性提取物(蝦青素)乳化、包合、微囊化等前沿技術處理，取得如下顯著進步和實質性技術效果：a、提高蝦青素穩(wěn)定性；b、增加脂溶性抽提物水溶性；c、使粘稠油狀提取物固體微囊化；d、掩蓋提取物藻腥味；e、有效控制包合微囊物中蝦青素的釋放；f、提高以蝦青素為代表的脂溶性β-胡蘿卜素生物利用度。
4)經輔料添加和包合微囊化技術處理的包合微囊粉，在固體分散載體作用下，以固體分散形式與藻渣形成均一、穩(wěn)定、高度分散的固體分散體。進一步提高營養(yǎng)及功能成分(蝦青素)溶解性能、提高溶出速率、從而進一步提高營養(yǎng)及功能成分(蝦青素)的生物利用度。
5)經co2超臨界萃取的雨生紅球藻提取物，為深紅色粘稠油狀液體，富含7～17％的蝦青素。該提取物作為藥品、保健食品及食品生產加工原料，不存在溶劑殘留問題，是目前雨生紅球藻主流的開發(fā)應用方向，具有一定優(yōu)勢，但并未解決脂溶性蝦青素穩(wěn)定性差，直接食用吸收低，生物利用度不高的問題。本發(fā)明創(chuàng)造性地將雨生紅球藻脂溶性油狀提取物通過乳化、包合、微囊化，徹底阻隔了蝦青素與外界接觸的機會，同時將脂溶性油狀物改性為能與水均一穩(wěn)定混懸的包合微囊粉，徹底逆轉了蝦青素不穩(wěn)定、直接食用生物利用度低的問題，進一步拓展了提取物開發(fā)應用空間。而將包合、微囊化的提取物以固體分散形式重新返回提取后藻渣，進一步提升營養(yǎng)及功能成分(蝦青素)穩(wěn)定性、釋放速率及生物利用度的同時，實現(xiàn)營養(yǎng)及功能成分的全面應用，則是本發(fā)明創(chuàng)造性、新穎性所在。
具體實施方式
以下參照具體的實施例來對本發(fā)明作進一步的說明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
以下各實施例中，蝦青素的含量采用以下方法來測定：
采用二甲基亞砜對樣品中游離蝦青素及蝦青素脂進行提取，根據(jù)蝦青素在二甲基亞砜中的特征吸光度來計算樣品中總蝦青素含量。
1)試劑
所用試劑均為分析純試劑；蝦青素標準品(sigmaa9335)：含量94～95％。
2)儀器
分光光度計(gbcuv/vis916可見紫外分光光度計，生產廠商澳大利亞gbc公司)；恒溫水浴鍋；離心機。
3)供試品溶液制備
取樣品置研缽中充分研細。精密稱取20mg置10ml離心管中，加二甲基亞砜5ml，振搖使樣品分散均勻，置70℃恒溫水浴中振搖提取10分鐘，取出置離心機中5000轉/分鐘離心5分鐘，收集上清液。重復上述提取操作2-3次，直到樣品變成灰白色，合并提取液至25ml棕色容量瓶中，加二甲基亞砜定容至刻度，搖勻。精密量取1ml置10ml棕色容量瓶中，加二甲基亞砜定容至刻度，搖勻，即得。
4)標準品溶液制備
精密稱取蝦青素標準品5.0mg，置50ml棕色容量瓶中，加二甲基亞砜溶解并定容至刻度，搖勻。精密量取1ml置25ml容量瓶中，加二甲基亞砜定容至刻度，搖勻，即得。
5)測定方法
以二甲基亞砜為空白校正，用紫外分光光度計在530nm波長處分別測定供試品、標準品溶液吸光度值。
6)計算
根據(jù)供試品、標準品溶液吸光度值，計算樣品中蝦青素質量百分含量。
蝦青素含量＝(m2×m×a1×250)/m1×a2×1250×100％
式中：m1：供試品取樣量(mg)；m2：標準品取樣量(mg)；m:標準品純度(％)；a1：供試品溶液吸光度值；a2：標準品溶液吸光度值。
7)精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10％。
實施例1：固體分散體1的制備
雨生紅球藻分離：取人工養(yǎng)殖、采收的新鮮藻泥(含固量23％、蝦青素質量百分含量占干重3.0％)，置高壓均質機中充分破壁(處理壓力為：第一次35mpa，第二次84mpa，鏡檢破壁率90％)。將已破壁的雨生紅球藻移至co2超臨界萃取設備(ha121-50-02型萃取裝置，江蘇華安科研儀器有限公司)中充分萃取(溫度75℃，壓力40mpa，co2流速25l/h)4h，收集抽提物。成功將雨生紅球藻分離為抽提后剩余藻渣、脂溶性油狀抽提物兩相。經檢測抽提物中蝦青素轉移率為90％，蝦青素的質量百分含量為12.0％。
營養(yǎng)成分相(干燥藻渣)制備：取雨生紅球藻經co2超臨界抽提后的剩余藻渣，添加80％的去離子水充分攪拌混勻，通過管道緩慢進入噴霧干燥塔(溫控170℃)進行噴霧干燥，收集干燥粉末，即得。經檢測其水分為8.0％。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制備：稱取雨生紅球藻co2超臨界抽提物，置帶研磨攪拌的潔凈容器中，按抽提物：輔料質量比(w/w)＝25:12添加脂溶性迷迭香提取物、明膠、β-環(huán)糊精、l-乳酸鈣，充分攪拌、乳化、研磨成糊狀，低溫干燥后，再用乙酸乙酯洗滌干凈，干燥即得。經檢測蝦青素質量百分含量為7.2％。
雨生紅球藻固體分散體制備：按包合微囊粉:干燥藻渣：固體分散載體質量比(w/w/w)＝180:408:12稱取包合微囊粉、干燥藻渣和聚維酮(pvp)。先將稱取的包合微囊粉和干燥藻渣置于帶研磨攪拌的潔凈容器中，添加95％乙醇(添加量為總質量20％)充分攪拌制成混懸液。再將稱取好的聚維酮(pvp)用純化水(用量為雨生紅球藻固體分散體總質量的20％)溶解混懸后，攪拌下緩慢添加至上述混懸液中，充分攪拌乳化，低溫抽去溶劑制成軟才，擠壓過20目篩，干燥，即得。經檢測蝦青素含量2.1％。
附圖說明：圖1為雨生紅球藻固體分散體制備工藝流程圖
實施例2：固體分散體2的制備
雨生紅球藻分離及營養(yǎng)成分相制備：同實施例1。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制備：稱取實施例1制備的雨生紅球藻co2超臨界抽提物，置帶研磨攪拌的潔凈容器中，按抽提物：輔料質量比(w/w)＝25:18添加脂溶性迷迭香提取物、改性淀粉、明膠、β-環(huán)糊精，充分攪拌、乳化、研磨成糊狀，低溫干燥后，再用乙醇洗滌干凈，干燥，即得。經檢測蝦青素含量為7.0％。
雨生紅球藻固體分散體制備：按包合微囊粉:干燥藻渣：固體分散載體質量比(w/w/w)＝213:375:12稱取包合微囊粉、干燥藻渣、聚維酮(pvp)+木糖醇。先將稱取的包合微囊粉和干燥藻渣置于帶研磨攪拌的潔凈容器中，添加95％乙醇(添加量為總質量20％)充分攪拌制成混懸液。再將稱取好的聚維酮(pvp)+木糖醇用純化水(用量為雨生紅球藻固體分散體總質量的20％)溶解混懸后，攪拌下緩慢添加至上述混懸液中，充分攪拌乳化，低溫抽去溶劑制成軟才，擠壓過20目篩，干燥，即得。經檢測，蝦青素含量2.5％。
實施例3：固體分散體3的制備
雨生紅球藻分離及營養(yǎng)成分相制備：同實施例1。
功能成分相(抽提物包合微囊粉)制備：稱取實施例1制備的雨生紅球藻co2超臨界抽提物，置帶研磨攪拌的潔凈容器中，按抽提物：輔料質量比(w/w)＝25:25添加水溶性迷迭香提取物、明膠、β-環(huán)糊精、l-乳酸鈣，充分攪拌、乳化、研磨成糊狀，低溫干燥后，再用乙醇洗滌干凈，干燥，即得。經檢測蝦青素質量百分含量為6.0％。
雨生紅球藻固體分散體制備：按包合微囊粉:干燥藻渣：固體分散載體質量比(w/w/w)＝240:348:12稱取包合微囊粉、干燥藻渣和聚維酮(pvp)+甘露醇+山梨醇。先將稱取的包合微囊粉和干燥藻渣置于帶研磨攪拌的潔凈容器中，添加95％乙醇(添加量為總質量20％)充分攪拌制成混懸液。再將稱取好的聚維酮(pvp)+甘露醇+山梨醇用純化水(用量為雨生紅球藻固體分散體總質量的20％)溶解混懸后，攪拌下緩慢添加至上述混懸液中，充分攪拌乳化，低溫抽去溶劑制成軟才，擠壓過20目篩，干燥，即得。經檢測蝦青素含量2.7％。
實施例4：組合物制備
取實施例2制備的雨生紅球藻固體分散體，添加藍莓果粉，粉碎過80目篩，制得抗氧化組合物。
實施例5：片劑的制備
取實施例2制得的雨生紅球藻固體分散體，添加預膠化淀粉、微晶纖維素、硬脂酸鎂少許，經濕法制粒、干燥、壓片，制得用于抗氧化、增強免疫功能、緩解運動疲勞、抑制腫瘤發(fā)生、預防心腦血管疾病、防止皮膚衰老、保護眼睛和中樞神經系統(tǒng)的藥物或保健食品。
實施例6：硬膠囊劑的制備
取實施例2制得的雨生紅球藻固體分散體，添加處方量0.5％的硬脂酸鎂混合均勻，經充填至膠囊內，制得硬膠囊劑。
實施例7：顆粒劑或丸劑的制備
取實施例2制備的雨生紅球藻固體分散體，直接制成顆粒劑；或者添加維生素e、甘油、明膠少許，經制丸、烘干，得丸劑。
為了對本發(fā)明作進一步的說明，本發(fā)明選取實施例1所得的破壁雨生紅球藻、co2超臨界抽提物和實施例2制備的包合微囊粉作為對照樣品，依次編號為1、2、3。選取實施例2所制備的雨生紅球藻固體分散體為試驗樣品，編號為4。同步開展加速穩(wěn)定性試驗、生物利用度試驗，抗氧化活性試驗。并對結果進行比較，具體如下：
1.加速穩(wěn)定性試驗
考察指標確定：本發(fā)明所述的雨生紅球藻固體分散體限制了其功能成分蝦青素的含量限度，為充分驗證加速試驗條件下蝦青素含量的穩(wěn)定性，本試驗選取各樣品中蝦青素的含量作為穩(wěn)定性考察指標。
試驗方案設計：分別取編號為1、2、3、4的試驗樣品各100g，置于潔凈透明玻璃瓶中，按原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導原則(《中國藥典》2015版四部9001)，置溫度為40℃士2℃、相對濕度75％士5％的條件下放置6個月，進行加速穩(wěn)定性試驗，分別于0天、3天、7天、14天、1個月、2個月、3個月、6個月取樣，測定蝦青素含量。測定結果見表1。
表1蝦青素含量測定結果
表1看出：樣品1在3天后蝦青素含量出現(xiàn)明顯下降、14天后衰竭了88％、1個月后蝦青素衰竭殆盡；樣品2蝦青素含量在14天出現(xiàn)明顯下降、3個月后衰竭了98.5％、6個月后蝦青素衰竭殆盡；本發(fā)明所述的功能成分相(樣品3)蝦青素含量在3個月穩(wěn)定、6個月內衰竭了4.8％；本發(fā)明所述的雨生紅球藻固體分散體(樣品4)蝦青素含量在6個月內穩(wěn)定，僅下降了2.3％。
試驗結論：樣品1、2的蝦青素都非常不穩(wěn)定，加速穩(wěn)定性試驗條件下較短時間即出現(xiàn)明顯衰竭，在6個月內衰竭殆盡；樣品3的蝦青素相對穩(wěn)定，具有一定開發(fā)應用前景，但僅限于功能成分-----蝦青素的開發(fā)應用，資源浪費較大；樣品4(本發(fā)明提供的雨生紅球藻固體分散體)中的蝦青素含量6個月內穩(wěn)定，且未改變雨生紅球藻營養(yǎng)及功能成分體系，開發(fā)應用前景廣闊。
2.生物利用度試驗
監(jiān)測指標確定：以功能成分蝦青素含量為監(jiān)測指標，考察灌胃和靜注給予各樣品后被吸收進入血液的蝦青素濃度，從而計算生物利用度。
試驗方案設計：試驗動物采用體重約3kg的健康家兔(由四川大學實驗動物中心提供)，動物隨機分為四組，每組6只。試驗前預先禁食12h后，分別灌胃給予上述樣品，劑量按蝦青素折算為0.6mg/kg(相當于70kg成人日服用蝦青素12mg)，給予樣品后密集測定血漿中蝦青素含量，至達峰時間后半小時，檢測血藥峰濃度(cmax)。試驗樣品灌胃結束后，停藥一周，至動物體內樣品完全代謝，然后靜脈注射給予等劑量蝦青素標準品溶液，并測定血漿中蝦青素含量(μg/ml)，以此作為參比數(shù)據(jù)計算蝦青素生物利用度，結果見表2。
表2：各樣品中蝦青素生物利用度檢測結果
由表2看出：樣品1、2中的蝦青素生物利用度均在30％左右；樣品3、4中蝦青素生物利用度均提升至90％以上。樣品3和樣品4比較：樣品4(即本發(fā)明所述雨生紅球藻固體分散體)生物利用度更高。
試驗結論：樣品4中蝦青素的生物利用度是樣品1的3.1倍、樣品2的3.13倍；樣品3與樣品4中蝦青素的吸收利用度都在90％以上，兩者比較樣品4(即雨生紅球藻固體分散體)生物利用度更高。
3.抗氧化活性試驗
試驗樣品制備：取上述四個樣品，分別用2％的亞硫酸鈉溶液配置成含蝦青素10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml三個濃度梯度的溶液，臨用時新鮮配制。
實驗動物：昆明種小鼠，雌雄兼用，體重25±4g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，動物合格證號：滬動合證字152號。
主要試劑及儀器：四乙氧基丙烷(tep)：sigma公司產品；tba溶液：硫代巴比妥酸為上海試劑二廠產品，配制方法：取0.67g硫代巴比妥酸加100ml水在50℃水浴加熱助溶5～10分鐘；tca溶液：三氯乙酸為中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司生產，配制方法：取三氯乙酸30g加水150ml配制而成；752c紫外可見分光光度計：上海第三分析儀器廠；dk-8b電熱恒溫水槽：上海精宏實驗設備有限公司；lxj-ii離心機：上海第三醫(yī)療儀器廠。
試驗方案設計：設空白對照組(n＝32)和樣品組(試驗樣品1～4)(含蝦青素10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml組)，每組動物數(shù)為10～12只。參照常規(guī)方法，取正常小鼠肝組織用冷生理鹽水制成10％組織勻漿。勻漿在冰浴條件下進行，每管加300μl，再加不同濃度試驗樣品，混勻，置37℃水浴溫孵30分鐘。取出后加10％三氯乙酸(tca)2.5ml和0.67％硫代巴比妥酸(tba)1ml，置沸水浴中30分鐘，流水冷卻至室溫，加入正丁醇4.0ml振蕩混勻后于3000rmp離心10分鐘，取上清液于535nm比色測定。以標準的四乙氧基丙烷計算含量，以nmol/g組織濕重表示。實驗數(shù)據(jù)用x±sd表示，studentttest進行顯著性檢驗。結果見表3。
表3試驗樣品對小鼠肝勻漿mda含量的影響
*p<0.05，**p<0.01vs空白對照組
試驗結論：表3看出，空白對照組mda含量為81±21nmol/g組織濕重；與空白對照比較，本發(fā)明所述的1～4號樣品mda抑制率有統(tǒng)計學差異，表明1～4號樣品(含不同濃度蝦青素)均顯示抗氧化活性。隨蝦青素濃度的增加，其抗氧化活性也隨之增強；本發(fā)明所述的1、2號樣品組內比較無統(tǒng)計學差異，表明蝦青素濃度一致的前提下，1、2號樣品抗氧化活性無明顯差異；本發(fā)明所述的3、4號樣品與1、2號樣品組間比較存在統(tǒng)計學差異，表明在蝦青素濃度一致的前提下，3、4號樣品抗氧化活性明顯強于1、2號樣品；本發(fā)明所述的3、4號樣品組內比較存在統(tǒng)計學差異，表明在蝦青素濃度一致的前提下，4號樣品抗氧化活性明顯強于3號樣品。