本發(fā)明涉及化妝品技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法。
背景技術(shù)：
鱟，又稱馬蹄蟹，是一種生活在海洋中的大型底棲節(jié)肢動(dòng)物,從早古生代的奧陶紀(jì)出現(xiàn)至今已有4億多年的歷史,是動(dòng)物界具有獨(dú)特進(jìn)化地位的“活化石”之一。鱟是無脊椎動(dòng)物血液學(xué)研究的絕好材料,也是目前鱟資源開發(fā)利用和鱟試劑研制的主要原材料,一直受到日、美等國(guó)學(xué)者的高度重視。隨著對(duì)鱟血淋巴的免疫功能研究以及和其他無脊椎動(dòng)物血淋巴的免疫學(xué)比較研究,尤其是從鱟血淋巴中分離出許多具有抗菌、抗病毒的活性物質(zhì)?？傮w而言，鱟作為一種具有巨大醫(yī)藥開發(fā)潛力的重要資源，為世界各國(guó)高技術(shù)產(chǎn)業(yè)所矚目。
目前鱟的主要用途是制備鱟試劑。鱟血細(xì)胞中的顆粒細(xì)胞中含有能與內(nèi)毒素起凝集作用的酶系統(tǒng)。根據(jù)此原理，世界各國(guó)研究人員經(jīng)不懈努力，開發(fā)出了用于藥品細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)的鱟試劑。同時(shí)，鱟試劑還能被β-葡聚糖激活，而1-3-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的特有成分，從而鱟試劑亦被開發(fā)應(yīng)用于檢測(cè)深度真菌感染。但鱟試劑的提取過程中僅利用到了鱟血細(xì)胞，剩余的其他成分并未得到有效開發(fā)利用。鱟試劑的提取過程包括：
a鱟細(xì)胞裂解液的配制：裂解液為Tris-HCl,NaCl緩沖液。其中，所述緩沖液為pH 7-8，NaCl，Tris-HCl可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)，一般為50mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl；
b鱟細(xì)胞的裂解乳化：取全血離心后的鱟細(xì)胞，按1:5-1:8.5的比例加入鱟細(xì)胞裂解液，使用高速勻漿機(jī)勻漿5-20分鐘，既得鱟細(xì)胞裂解乳化物。
c鱟細(xì)胞裂解液分離提純：將上述乳化物低溫離心25-30分鐘，取上清液，分裝備用，即為鱟細(xì)胞裂解液。向裂解液中以1:1-1:2的比例加入氯仿溶液，低溫?cái)嚢桦x心后，仔細(xì)取出上清液備用。
d制劑：取c步驟中最終上清液，各生產(chǎn)廠家根據(jù)自身情況，向其中添加多肽顯色基質(zhì)，低溫?cái)嚢璺盅b后，真空冷凍干燥后即得鱟試劑。
另外，在鱟試劑的提取過程中作為鱟全血的另一組成部分，鱟血漿也被廢棄。
化妝品在存儲(chǔ)和使用過程中，極易受微生物的污染而導(dǎo)致腐敗。由于微生物的作用可引起化妝品變質(zhì)、腐敗，在感官上其色澤和氣味發(fā)生變化，從而失去商品價(jià)值。更重要的是致病微生物的污染會(huì)導(dǎo)致人體健康的危害。防止化妝品由于微生物污染而產(chǎn)生對(duì)人體皮膚的危害及產(chǎn)品的變質(zhì)、發(fā)霉，當(dāng)前最有效的辦法就是添加防腐劑，防腐劑是能夠抑制微生物的生長(zhǎng)、繁殖的一類化學(xué)藥劑。隨著科研水平的進(jìn)步，業(yè)界對(duì)防腐劑的安全性研究也越來越深入，許多傳統(tǒng)有被使用的防腐劑，都被證實(shí)具有一定的負(fù)面作用。所以，開發(fā)安全的純天然或是生物抗菌、防腐技術(shù)成為業(yè)界的研發(fā)方向之一。此外，在化妝品中由于其成分如主原料、防腐劑、乳化劑、香料等絕大多數(shù)都是化學(xué)合成品，使用時(shí)發(fā)生過敏反應(yīng)己屢見不鮮。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于豐富目前化妝品的種類，提供一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，以實(shí)現(xiàn)化妝品天然綠色，且具有抗菌、防腐、滋養(yǎng)、修復(fù)、保濕等多重功效。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
1、一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細(xì)胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細(xì)胞是鱟試劑生產(chǎn)工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20m mol/L)，低溫超聲破碎，破碎條件為：100ml超聲波輸出功率為700W，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10S，反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)pH去沉淀：將抽提液用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中SOD粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和100份0.9％NaCl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
第二步，由上述抑菌組合物制備化妝品
(1)按如下質(zhì)量百分比配置化妝品包括的組份：
(2)得到化妝品成品
A.將上述化妝品組份中包括的部分油相與去離子水進(jìn)行初步乳化；
b.調(diào)整上述乳化體系溫度至35℃～40℃，加入橄欖油、抑菌組合物，體系經(jīng)攪拌均勻降溫后得成品。
而且，所述第一步的步驟(5)中的pH調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
而且，所述第一步的步驟(5)中抑菌組合物的鱟素肽粗提液﹕血藍(lán)蛋白粗提液﹕SOD粗提液的最佳配比為：8﹕1﹕1或6﹕2﹕2。
而且，所述第二步的(2)步中進(jìn)行初步乳化的油相組份包括維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯及賦形增稠劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果是：
1、本專利原料抑菌組合物對(duì)鱟試劑生產(chǎn)廢料進(jìn)行了充分提取。主要提取了鱟血細(xì)胞提取廢料中的鱟素肽及血漿中的血藍(lán)蛋白及超氧化物歧化酶(SOD)等成分，將其混合后用于化妝品的制備。
2、本專利方法獲得的化妝品能有效的抑制各類細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)。較傳統(tǒng)化學(xué)抑菌產(chǎn)品而言，更為安全溫和有效，無毒副作用，能避免常規(guī)抑菌產(chǎn)品耐藥性和過敏現(xiàn)象的發(fā)生。
3、由于本發(fā)明的抑菌組合物應(yīng)用化妝品領(lǐng)域，因此，鱟素肽的提取采用的是快速，便捷的低成本提取方式，提取出的鱟素肽粗提液完全能夠滿足日常性抗菌，消炎，防腐性用品的需要。
4、本專利方法獲得的化妝品具有較強(qiáng)的抗紫外輻射能力。作為護(hù)膚品使用，可以抵御輻射對(duì)人體的肌膚損傷，減緩皮膚老化。
附圖說明
圖1是本發(fā)明化妝品在波長(zhǎng)280-400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，其具體實(shí)施方案應(yīng)該理解為僅為舉例說明，不是限定性的，不能以下述舉例說明來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
一種從鱟試劑廢料中提取抑菌組合物制備化妝品的方法，該方法包括步驟如下：
第一步，在鱟試劑廢料中提取抑菌組合物
(1)原料處理
收集鱟血細(xì)胞及血漿，作為原料備用；其中，所述鱟血細(xì)胞是鱟試劑生產(chǎn)工藝中丟棄的乳化物沉淀，所述血漿是鱟試劑生產(chǎn)過程中丟棄的血漿；
(2)鱟素肽粗提液的制備
a.酸解：將鱟細(xì)胞乳化物離心后的下層沉淀以固液比例1:6.5-8的比例加入酸液(20m mol/L)，低溫超聲破碎，破碎條件為：100ml超聲波輸出功率為700W，超聲波總作用時(shí)間為10min,每次超聲作用時(shí)間為10S，反復(fù)超聲3次，收集上清液即為細(xì)胞酸抽提液；
b.調(diào)pH去沉淀：將抽提液用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5，離心除沉淀，得上清液；
c.熱變性處理：上清液沸水浴處理5-10min,4℃下離心棄沉淀收集上清液，上清液用0.22uM膜過濾得鱟素肽粗提液；
(3)血漿中血藍(lán)蛋白粗提液的制備
將上述步驟(1)中的血漿經(jīng)300000g超離心3.5h，即得到初步提純的血藍(lán)蛋白沉淀，將沉淀再溶于pH7.0，0.2mol/L磷酸緩沖液中，即為血藍(lán)蛋白粗提液；
(4)血漿中SOD粗提液的制備
按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，取100份上述步驟(1)中的鱟血漿，加入34份0.05mol/L磷酸鹽緩沖液和100份0.9％NaCl溶液，輕輕攪拌混勻，將混合液置于65℃水浴鍋中，恒溫20min后，急冷至10℃，離心去除沉淀，取上清液，即為SOD粗提液；
(5)粗提液的混合
將上述三種粗提液按60-80份的鱟素肽粗提液，10-20份的血藍(lán)蛋白提取液，10-20份的SOD提取液混合，使用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH值4-5后過濾，得到最終形式的抑菌組合物。
其中，所述pH調(diào)節(jié)劑為檸檬酸、檸檬酸鈉、乳酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、硼酸、硼砂中的一種或多種的組合。
第二步，由上述抑菌組合物制備化妝品
(1)按如下質(zhì)量百分比配置化妝品包括的組份：
(2)得到化妝品成品
a.上述化妝品組份中包括油相的維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯、賦形增稠劑及橄欖油、去離子水和本發(fā)明所述的抑菌組合物，先使化妝品原料的油相中維生素E醋酸酯、二乙二醇脂肪酸酯及賦形增稠劑和去離子水進(jìn)行初步乳化；
b.調(diào)整上述乳化體系的溫度，降溫至35～40℃，加入橄欖油、抑菌組合物，體系經(jīng)攪拌均勻，進(jìn)一步降溫后完成操作，然后灌裝得成品。
抑菌組合物的抑菌效果實(shí)驗(yàn)
(1)組成
抑菌組合物由鱟素肽粗提液，血藍(lán)蛋白提取液，SOD提取液按一定配比組合而成。
2抑菌試驗(yàn)
A實(shí)驗(yàn)材料
由鱟素肽粗提液、血藍(lán)蛋白提取液、SOD提取液組合的抑菌組合物。
B受試菌種
細(xì)菌：金黃色葡萄球菌：(Staphylococcus aureus)ATCC 6538
大腸埃希氏菌：(Escherichia coli)ATCC 8739
銅綠假單胞菌：(Pseudomonas.aeruginosa)ATCC 9027
注：上述菌株均由中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)微生物菌種庫提供。
C培養(yǎng)基
細(xì)菌培養(yǎng)基：卵磷脂吐溫80-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌20min后制成斜面?zhèn)溆谩?/p>
D菌懸液的制備
實(shí)驗(yàn)前將各個(gè)菌株分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基斜面，細(xì)菌(金黃色葡萄球菌，大腸埃希氏菌，銅綠假單胞菌)均于36±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48小時(shí)。分別挑取適量菌落于無菌生理鹽水中混勻，制成一定濃度的混合菌懸液?；旌霞?xì)菌懸液總濃度約為1.0×108cfu/ml。置于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
E抑菌組合物抑菌液的的制備
按照正交設(shè)計(jì)法確定各提取液組合的配比，將四種提取液按表1的方案分別進(jìn)行配制后，用純凈水以2:3比例進(jìn)一步稀釋至化妝品中添加濃度，備用。
表1復(fù)合提取液抑菌作用考察因素及水平
F提取液的抑菌試驗(yàn)
采用濾紙片擴(kuò)散法，無菌條件下進(jìn)行，將濾紙用打孔器打成直徑6mm的圓形濾紙片，置于潔凈干凈的小燒杯，121℃干熱滅菌20min后，分別放入4種不同比例提取液復(fù)配液中充分浸泡，每只試管放入8片備用。將已配制好的固體培養(yǎng)基融化，分別倒入培養(yǎng)皿中，121℃滅菌20min，待冷卻凝固后，吸取0.1ml菌懸液于平板上涂布均勻。用無菌鑷子分別夾取已在提取物原液中浸泡過的直徑為6mm圓形濾紙片，貼在含菌平板上，每個(gè)平板內(nèi)貼5片，以無菌水浸泡的濾紙片作為空白對(duì)照，將各培養(yǎng)皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中平板倒置培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑的大小，設(shè)3個(gè)重復(fù)，取其平均值?；旌霞?xì)菌懸液的抑菌圈直徑見表2
表2
由抑菌圈大小可以看出，提取液配比為8：1：1或6：2：2時(shí)，抑菌作用明顯。
化妝品抗紫外實(shí)驗(yàn)
將上述化妝品1.0g，分別置于25mL比色管中，用60％乙醇定容至刻度，用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280～400nm范圍內(nèi)掃描，確定其紫外吸收光譜，計(jì)算本化妝品在UVB區(qū)(280～320nm)和UVA區(qū)(320～400nm)的平均吸光度值，評(píng)價(jià)其抗紫外線輻射能力。
結(jié)果與分析
按上述方法，測(cè)得本化妝品在波長(zhǎng)280～400nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜如圖1所示。計(jì)算得該化妝品在UVB區(qū)(280～320nm)和UVA區(qū)(320～400nm)的平均吸光度值分別為0.348和0.266?？梢?，本化妝品在紫外線UVB區(qū)和UVA區(qū)均具有較強(qiáng)的抗紫外線輻射能力，即具有廣譜抗紫外線能力。同時(shí)也表明，本化妝品抗UVB區(qū)紫外線的能力強(qiáng)于抗UVA區(qū)紫外線的能力。