本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的適配體修飾的攜氧載藥多功能脂質(zhì)體復合物。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴重危害人類健康的重大疾病之一，近年來發(fā)病率呈顯著上升趨勢。肺癌是所有癌癥中存活率最低的癌癥之一。肺癌分為小細胞肺癌（SCLC）和非小細胞肺癌（NSCLC）。非小細胞肺癌是肺癌中的常見類型，大約占所有確診肺癌患者中的80~85%。厄洛替尼（erlotinib）是一類選擇性表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI），是特異性較高的抗腫瘤靶向治療藥物。盡管厄洛替尼在NSCLC的治療中取得了一定的療效，但腫瘤細胞對其產(chǎn)生耐藥性阻礙了其在臨床上的有效應用。

研究表明，肺癌細胞對分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥性的原因有很多。缺氧是致使肺癌細胞對厄洛替尼的敏感性降低的原因之一。缺氧是非小細胞肺癌的主要微環(huán)境特征之一，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。局部微環(huán)境的缺氧可促進腫瘤細胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移、凋亡等惡性生物學行為的發(fā)生。因此，如何逆轉(zhuǎn)缺氧誘導的腫瘤耐藥性已成為當今醫(yī)學界研究的熱點。

目前，臨床上已有應用的攜氧體分為兩類：全氟碳化物（PFCs）和血紅蛋白攜氧載體（HBOC）。PFCs相對HBOC攜氧能力更強，具有的化學氧超過患者自身紅細胞的供氧能力。而且，PFC顆粒微小，可經(jīng)毛細血管滲入到紅細胞不能達到的腫瘤缺氧區(qū)，使腫瘤組織的P(O₂)顯著提高。因此，利用PFCs供氧可提高化療的療效，明顯延緩腫瘤的生長速度。PFCs種類很多，相比較而言，全氟溴辛烷（PFOB）具有載氧量高、易降解、已用于臨床試驗等優(yōu)勢。因此，PFOB是理想的、可靠的、安全的攜氧載體。

由于PFOB和厄洛替尼均不溶于水，需要選擇能夠裝載難溶性藥物的納米材料作為載體。脂質(zhì)體是由卵磷脂、膽固醇按一定比例制備而成的，具有與生物體細胞相類似的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，因此具有很好的生物相容性。但脂質(zhì)體在體內(nèi)酶以及化學環(huán)境下，容易降解而破壞。目前，已有很多學者利用聚乙二醇（PEG）修飾脂質(zhì)體，以提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。然而，PEG化容易阻礙細胞攝取，降低了藥物輸送效率。殼聚糖（chitosan，簡寫Cs）是由自然界廣泛存在的幾丁質(zhì)經(jīng)過脫乙酰作用得到的疏水性聚合物，其生物相容性好，在生物體內(nèi)可降解，并且已用于臨床。因此，利用殼聚糖來修飾脂質(zhì)體，可以有效的提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

近年來，靶向納米藥物在腫瘤治療方面具有廣闊的應用前景。納米藥物的主動靶向是通過偶聯(lián)一定的配體，如核酸適配體、抗體、多肽等，以提高藥物在腫瘤中的濃度。核酸適配體是一小段經(jīng)體外篩選得到的寡核苷酸序列，與傳統(tǒng)抗體相比，它具有體積小、穩(wěn)定、生物相容性高、能與相應的配體進行高親和力和強特異性的結(jié)合等優(yōu)勢。EGFR在NSCLC中高表達，并且與腫瘤細胞的增殖、侵襲、損傷修復、血管生成密切相關(guān)。因此，EGFR可作為肺癌治療的靶蛋白，將納米材料用識別EGFR的適配體修飾可特異性靶向EGFR高表達的肺癌細胞。

基于以上背景，本發(fā)明構(gòu)建了一種由殼聚糖修飾的脂質(zhì)體以及固定在脂質(zhì)體中具有特異性EGFR識別能力的核酸適配體組成的，并包載有分子靶向藥物厄洛替尼和攜氧體PFOB的攜氧載藥多功能脂質(zhì)體復合物，其能特異性地靶向肺癌細胞，并能釋放氧氣調(diào)節(jié)腫瘤缺氧微環(huán)境，以協(xié)同改善分子靶向藥物厄洛替尼的耐藥性，有效抑制腫瘤的生長，達到治療肺癌的效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種適配體修飾的攜氧載藥多功能脂質(zhì)體復合物，該復合物具有靶向能力，可包載對腫瘤細胞有殺傷作用的抗癌藥物，并同時通過攜帶的攜氧體負載氧氣以改善腫瘤缺氧的微環(huán)境，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞缺氧所誘導產(chǎn)生的耐藥性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種適配體修飾的攜氧載藥多功能脂質(zhì)體復合物，其由抗癌藥物、攜氧體和納米載體構(gòu)成，具有一體化靶向輸送藥物和供氧功能，能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性；

所述納米載體是由卵磷脂、膽固醇、殼聚糖、靶向EGFR的核酸適配體制成。

所述脂質(zhì)體復合物的粒徑均一，尺寸為80~250 nm。

納米載體中所用卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為1:1~5:1；殼聚糖用量占所得納米載體重量的15%~50%。

脂質(zhì)體復合物中抗癌藥物量為納米載體重量的1%~10%；所述抗癌藥物包括分子靶向藥物厄洛替尼。

所述攜氧體為全氟溴辛烷。

所述多功能脂質(zhì)體復合物的制備方法包括以下步驟：

1）將殼聚糖溶于0.1%（v/v）的冰醋酸中，并加水稀釋成1%（m/v）的殼聚糖溶液；然后在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）/N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的作用下，將其與靶向EGFR的核酸適配體共價偶聯(lián)，超濾后得到適配體修飾的殼聚糖懸浮液；其中，核酸適配體的連接量為10~150 pmol/mg；

2）將卵磷脂、膽固醇、抗癌藥物和攜氧體溶于有機溶劑中，減壓旋蒸，形成脂質(zhì)膜；

3）用步驟1）所得殼聚糖懸浮液水化脂質(zhì)膜，冰浴超聲10 min，過0.45 μm濾膜，即得所述多功能脂質(zhì)體復合物（ACLEP）的懸浮液；其氧氣含量為50~400 mg/mL。

所述多功能脂質(zhì)體復合物可用于制備肺癌治療藥物。

本發(fā)明適配體修飾的攜氧載藥復合物包括由卵磷脂和膽固醇制備的脂質(zhì)體，固定在脂質(zhì)體中、經(jīng)靶向表皮生長因子受體（EGFR）的核酸適配體修飾的殼聚糖衍生物（Apt-Cs），以及包載在脂質(zhì)體中的分子靶向藥物和攜氧體構(gòu)成；可利用水化薄膜法在水溶液中自組裝而成，制備方法簡單。

本發(fā)明的顯著效果在于：

（1）本發(fā)明中利用殼聚糖穩(wěn)定脂質(zhì)體，解決了脂質(zhì)體穩(wěn)定性差的問題，因此可延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，從而提高藥物的生物利用度。

（2）本發(fā)明中的納米載體表面連接有適配體，解決了非靶向納米藥物特異性差的問題；同時，利用適配體的靶向功能，可與抗癌藥物協(xié)同增效，提高藥物的抗腫瘤效果。

（3）本發(fā)明脂質(zhì)體復合物中還包載有攜氧體，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物和氧氣的共輸送，有利于改善腫瘤缺氧微環(huán)境，可達到逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的效果。

附圖說明

圖1為實施例1所合成ACLEP的粒徑分布（A）和AFM圖（B）。

圖2為實施例1所合成ACLEP的熒光光譜圖。

圖3為在常氧和缺氧條件下，實施例2所得ACLE和實施例2所得ACLEP中厄洛替尼的累積釋放曲線對比圖。

圖4為在常氧和缺氧條件下，不同肺癌細胞對ACLE和ACLEP的攝取情況試驗圖。

圖5為在常氧和缺氧條件下，不同脂質(zhì)體復合物對A549、PC-9和H1975細胞增殖抑制作用的情況圖。

圖6為模型小鼠在給予不同脂質(zhì)體復合物后的體重變化曲線（A）和瘤體積變化曲線（B）。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1

將4mg EDC和8mg NHS溶于200μL的二次水中，再向其中加入100μL羧基修飾的靶向EGFR的適配體（10μM，其具體序列參見文獻Tan Y, Shi Y-s, Wu X-d, Liang H-y, Gao Y-b, Li S-j, et al. DNA aptamers that target human glioblastoma multiforme cells overexpressing epidermal growth factor receptor variant III in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 2013;34(12):1491-8.），室溫避光攪拌3h；然后再向其中加入200μL 1%（v/v）的殼聚糖溶液，攪拌8h，超濾(MW=10000)三次，每次15min，棄濾液，用PBS稀釋制成適配體修飾的殼聚糖（Apt-Cs）懸浮液。

稱取20mg卵磷脂、5mg膽固醇、1.58mg厄洛替尼和200μL PFOB于梨形燒瓶，加入二氯甲烷進行溶解，減壓旋蒸，形成脂質(zhì)膜；用上述所得Apt-Cs懸浮液水化脂質(zhì)膜，冰浴超聲10min，得到裝載有厄洛替尼和全氟溴辛烷的適配體修飾的攜氧載藥脂質(zhì)體復合物（ACLEP）的懸浮液。

利用粒度測定儀測定合成的ACLEP的粒徑分布，并利用原子力電子顯微鏡（AFM）觀測ACLEP的形貌，結(jié)果如圖1所示。

由圖1（A）可見，所得ACLEP粒徑均一，平均粒徑約為200nm；由圖1（B）可見，所得ACLEP呈球形，表面光滑。

實施例2

稱取20mg卵磷脂、5mg膽固醇和1.58mg厄洛替尼于梨形燒瓶，加入二氯甲烷進行溶解，減壓旋蒸，形成脂質(zhì)膜，用實施例1中制備的Apt-Cs懸浮液水化脂質(zhì)膜，冰浴超聲10min，得到僅裝載厄洛替尼的適配體修飾的載藥脂質(zhì)體復合物（ACLE）的懸浮液。利用粒度測定儀測定合成的ACLE的粒徑約為200 nm。

實施例3

稱取20mg卵磷脂、5mg膽固醇和200μL PFOB于梨形燒瓶，加入二氯甲烷進行溶解，減壓旋蒸，形成脂質(zhì)膜，用實施例1中制備的Apt-Cs懸浮液水化脂質(zhì)膜，冰浴超聲10min，得到僅裝載全氟溴辛烷的適配體修飾的攜氧脂質(zhì)體復合物（ACLP）懸浮液。利用粒度測定儀測定合成的ACLP的粒徑約為200 nm。

實施例4

稱取20mg卵磷脂和5mg膽固醇于梨形燒瓶，加入二氯甲烷進行溶解，減壓旋蒸，形成脂質(zhì)膜，用實施例1中制備的Apt-Cs懸浮液水化脂質(zhì)膜，冰浴超聲10min，得到適配體修飾的空脂質(zhì)體復合納米載體（ACL）的懸浮液。利用粒度測定儀測定合成的ACL的粒徑約為150 nm。

實施例5

利用適配體在520nm處有最大熒光強度的特點，通過熒光光譜儀繪制系列濃度適配體的標準曲線，并根據(jù)所得標準曲線確定實施例1中制備得到的ACLEP的連接量。

圖2為實施例1所得ACLEP的熒光光譜圖。經(jīng)計算，所得ACLEP中適配體的連接量為0.150±0.42 nmol/mg。

實施例6

依據(jù)氧化還原反應：(1) Na₂SO₃+O₂=Na₂SO₄；(2) KMnO₄+Na₂SO₃+H₂O=3Na₂SO₄ +2KOH+ 2MnO₂，取少量實施例1中制備得到的ACLEP懸浮液與Na₂SO₃溶液充分反應，將未反應的Na₂SO₃溶液進一步用KMnO₄溶液氧化，根據(jù)KMnO₄溶液的用量確定ACLEP中的氧氣含量。

經(jīng)計算，所得ACLEP中含氧量為0.406±0.14 g/mL。

實施例7

在常氧（20%O₂）和缺氧（5%O₂）條件下，分別取1mL實施例2中制備得到的ACLE懸浮液和1mL實施例1中制備得到的ACLEP懸浮液于透析袋中（MW=3KDa），置于100mL的PBS緩沖溶液中，分別于37℃攪拌0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、36h、48h、72h進行取樣，并同時補加相同體積的緩沖液，245nm處測各個樣品的紫外吸光度，得到ACLE和ACLEP在常氧和缺氧條件下的藥物釋放率，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可見，在常氧條件下，ACLE和ACLEP中厄洛替尼的釋放量相當；然而在缺氧條件下，ACLEP中厄洛替尼的釋放量明顯高于ACLE，因此說明氧氣的輸送有助于藥物在缺氧環(huán)境中的釋放。

從分子水平看，非小細胞肺癌存在著不同的分子分型，A549細胞是EGFR野生型、K-Ras突變的原發(fā)性耐藥株，H1975細胞則是EGFR的L858R、T790M突變所致的獲得性耐藥細胞株，PC-9細胞為表達EGFR外顯子19位缺失的單突變對厄洛替尼敏感的細胞株。因此，在肺癌細胞的研究中，選取A549、H1975、PC-9這三株細胞作為研究對象。

實施例8

分別在常氧（20%O₂）和缺氧（5%O₂）條件下培養(yǎng)A549、PC-9、H1975細胞，每株細胞均設(shè)2組實驗組和1組對照組。待細胞密度達到80%左右，棄去舊培養(yǎng)基，補充不完全培養(yǎng)基， 2組實驗組分別加入10μL實施例2中制備得到的ACLE和實施例1中制備得到的ACLEP，避光，37℃孵育3h，然后棄去舊培養(yǎng)基，消化細胞，1500rpm離心5min，用washing buffer洗兩遍，最終懸浮于400μL的PBS中，流式檢測，分析各細胞株對ACLE和ACLEP的攝取能力；與此同時，為了考察該適配體（Apt）對肺癌細胞的特異性識別，另取培養(yǎng)的肺癌細胞預先與適配體孵育1h，使其競爭性結(jié)合肺癌細胞表面的EGFR蛋白，washing buffer洗去未結(jié)合的適配體，然后再加入實施案例2中制備得到的ACLE孵育3h，流式檢測，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，（1）當Apt競爭性結(jié)合EGFR后，肺癌細胞攝取的ACLE明顯降低；（2）在不同氧分壓的條件下，各肺癌細胞對ACLE和ACLEP的攝取均存在差異，相比較而言，攝取能力H1975>PC-9>A549；（3）與常氧條件相比，缺氧條件下各肺癌細胞對ACLE的攝取量相對較少；（4）在缺氧條件下，各肺癌細胞對ACLEP的攝取明顯多于ACLE。上述結(jié)果（1）（2）表明，該適配體可特異性識別肺癌細胞表面的EGFR，且對H1975細胞的特異性最高；結(jié)果（3）（4）表明，在缺氧條件下，氧氣的不足會抑制肺癌細胞對ACLE的攝取，攜載PFOB有助于細胞對納米粒子ACLEP的攝取，從而可增加細胞內(nèi)的厄洛替尼的濃度，克服耐藥性。

實施例9

用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的A549、PC-9、H1975細胞，用培養(yǎng)基稀釋成濃度為1×10⁵個/mL的細胞懸浮液。分別在常氧（20%O₂）和缺氧（5%O₂）條件下，按每孔100μL細胞懸浮液的量接種到96孔板中，周圍用PBS封孔，置于培養(yǎng)箱中孵育24h后，按濃度梯度分別加入實施例4中制備得到的ACL、實施例2中制備得到的ACLE、實施例3中制備得到的ACLP及實施例1中制備得到的ACLEP，每個濃度設(shè)五個復孔；同時設(shè)置Control組，即加入不含藥物的新鮮完全培養(yǎng)基。藥物作用72h后，棄上清液，每孔加入100μL MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490nm處各孔的吸光值，并依據(jù)以下公式計算存活率，結(jié)果如圖5所示：

存活率=(A_樣品-A_空白)/(A_Control-A_空白)×100%。

由圖5可知，（1）空載體ACL在一定的濃度范圍內(nèi)對肺癌細胞幾乎沒有毒性，說明本發(fā)明所使用的納米載體是安全可靠的；（2）在兩種氧氣濃度條件下，ACLP對細胞的毒性差異不大，而在缺氧條件下，ACLE作用的各肺癌細胞的存活率明顯高于常氧條件下的細胞存活率，說明缺氧降低了ACLE的作用效果，原因可能是由于缺氧會抑制細胞對納米粒子的攝?。唬?）在缺氧條件下，ACLEP相對ACLE有效地抑制了各肺癌細胞的生長，說明通過氧氣輸送改善腫瘤缺氧微環(huán)境有助于克服肺癌細胞的耐藥性。

實施例10

收集對數(shù)生長期的A549細胞，1000rpm離心5min，用PBS洗滌2次，無菌條件下送到動物室。

在無菌實驗條件下，于裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射A549細胞，每只0.1mL，待裸鼠腋窩處出現(xiàn)米粒大結(jié)節(jié)，說明成功建立模型。

裸鼠尾靜脈分別注射生理鹽水、實施例4中制備得到的ACL、實施例2中制備得到的ACLE、實施例1中制備得到的ACLEP，每三天測動物體重及腫瘤體積，腫瘤體積(v)按公式V=(長×寬²)／2計算，并繪制腫瘤生長曲線，結(jié)果如圖6所示。

由圖6（A）可見，給藥后，給藥組裸鼠體重與空白對照組相比未發(fā)生明顯的變化，表明各脂質(zhì)體復合物在給藥劑量范圍為裸鼠的安全劑量范圍。由圖6（B）可見，相對于其他脂質(zhì)體復合物，ACLEP在裸鼠體內(nèi)的抗腫瘤效果最顯著，說明在體內(nèi)ACLEP通過負載氧氣可協(xié)同增加分子靶向藥物厄洛替尼在肺癌治療中的效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。