本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及血竭素、血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種常見(jiàn)、有遺傳傾向、以高血糖為特征的慢性代謝性和全身進(jìn)行性疾病，具有普遍性、高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為繼癌癥、心腦血管疾病之后，人類(lèi)第三大殺手。糖尿病防治在相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)將是人類(lèi)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。尋找和開(kāi)發(fā)新型、高效、安全治療糖尿病的藥物刻不容緩，是糖尿病治療領(lǐng)域的首要任務(wù)。

糖尿病主要分為I型、II型，其中以II型糖尿病為主，占患糖尿病人數(shù)的90％以上。胰島β細(xì)胞功能缺陷是形成II型糖尿病的主要原因之一，II型糖尿病也被稱(chēng)為是由于β細(xì)胞功能缺陷而導(dǎo)致的單基因或多基因遺傳病。胰島β細(xì)胞功能缺陷的原因主要有胰島β細(xì)胞塊的減損和胰島β細(xì)胞分泌功能的衰減。且研究表明，機(jī)體長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境中會(huì)誘發(fā)多種慢性炎癥，出現(xiàn)胰島β細(xì)胞數(shù)目減少，胰島素分泌不足。因此，保護(hù)胰島β細(xì)胞，調(diào)控胰島素合成和分泌是治療糖尿病的一種重要手段。

胰十二指腸同源盒1(pancreatic duodenal homeobox-1，Pdx-1)最早又被稱(chēng)為生長(zhǎng)抑素活化因子-1(STF-1)、胰島素啟動(dòng)因子-1(IPF-1)或胰島素敏感因子(GSF)。其蛋白序列和結(jié)構(gòu)域在不同物種間高度保守，且蛋白結(jié)構(gòu)的氨基末端(N-terminus)是轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，為胰島素基因轉(zhuǎn)錄所必須，無(wú)論是在β細(xì)胞還是在非β細(xì)胞，都能活化胰島素啟動(dòng)子。同時(shí)，Pdx1還能夠調(diào)節(jié)β細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，抑制β細(xì)胞發(fā)生凋亡。Pdx1對(duì)β細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的調(diào)控主要是通過(guò)Irs1/Irs2-PI3K-Akt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，其中Akt能直接調(diào)節(jié)其下游靶基因Pdx1的功能。最初，Pdx1與其它同源基因一起，在動(dòng)物模型中被證實(shí)與凋亡之間有一定聯(lián)系，漸漸許多研究也證實(shí)Pdx1表達(dá)降低與β細(xì)胞凋亡或因此而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡密切相關(guān)，尤其當(dāng)細(xì)胞處于高糖環(huán)境時(shí)，胰島組織中Pdx1表達(dá)明顯減少。Pdx1因而作為促進(jìn)胰腺發(fā)育，調(diào)控胰島素的合成和分泌、胰島細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在治療糖尿病領(lǐng)域引起極大關(guān)注。

通過(guò)對(duì)Pdx1與II型糖尿病形成關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)在II型糖尿病小鼠模型中，高血糖環(huán)境下，胰島β細(xì)胞內(nèi)Pdx1的表達(dá)降低，直接影響了胰島素基因的表達(dá)和胰島素的合成，同時(shí)影響了β細(xì)胞的增殖，使β細(xì)胞數(shù)目減少。在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)，Pdx1基因的無(wú)義突變與II型糖尿病的形成密切相關(guān)，Pdx1基因缺失突變的患者亦表現(xiàn)出嚴(yán)重的糖尿病癥狀。諸多證據(jù)顯示在患糖尿病的各個(gè)階段都會(huì)發(fā)生β細(xì)胞功能缺陷，且起主導(dǎo)作用。而Pdx1的活性缺失則是β細(xì)胞功能缺陷的根本原因，這使得有正常功能的β細(xì)胞數(shù)目減少，導(dǎo)致胰島素分泌不足，進(jìn)而形成糖尿病。因此，Pdx1在維持β細(xì)胞的正常功能和調(diào)節(jié)糖代謝平衡方面起關(guān)鍵作用，是糖尿病治療的一個(gè)潛在基因靶標(biāo)，全面了解其與糖尿病發(fā)生的關(guān)系，進(jìn)行必要的體外逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)，篩選出高效、低毒、低劑量的Pdx1表達(dá)激活劑，是一種治療糖尿病的新方法。

血竭，又名騏驎竭、海蠟、麒麟血、木血竭，棕櫚科植物麒麟竭果實(shí)和藤莖中的樹(shù)脂。具有活血散瘀，定痛，止血生肌的功效，血竭素是其主要成分之一，屬黃酮類(lèi)化合物中的花青素類(lèi)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血竭素高氯酸鹽可以誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌SGC-7901、人乳腺癌MCF-7等癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，同時(shí)在防治小鼠糖尿病腎病的腎損傷方面發(fā)揮重要作用。目前，尚沒(méi)有血竭素其他結(jié)構(gòu)修飾物生物活性研究的相關(guān)報(bào)道。

總之，以往對(duì)于血竭素及其結(jié)構(gòu)修飾物的生物藥理作用研究還很局限。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了血竭素及其結(jié)構(gòu)修飾物在保護(hù)胰島β細(xì)胞和治療糖尿病方面的機(jī)制，主要是通過(guò)經(jīng)典胰島素信號(hào)通路促進(jìn)Pdx1的表達(dá)，抗胰島β細(xì)胞凋亡，升高體內(nèi)胰島素水平，發(fā)揮降血糖作用的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了血竭素或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之二是設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

血竭素在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的是，所述糖尿病為Ⅱ型糖尿病。

優(yōu)選的是，所述血竭素用于激活轉(zhuǎn)錄因子Pdx1的表達(dá)進(jìn)而保護(hù)胰島β細(xì)胞。

根據(jù)通式(Ⅰ)所示的血竭素藥學(xué)上可接受的鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用：

其中，R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為ClO₄^—、Cl^—或者C₆H₂N₃O₇^—。

優(yōu)選的是，所述血竭素衍生物包括：5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮或者7-羥基-6甲基-2-苯基-鉻烯。

根據(jù)通式(Ⅰ)所示的血竭素衍生物藥學(xué)上可接受的鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用：

優(yōu)選的是，所述通式(Ⅰ)中R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH或OCH₃，R₃為CH3，X為Cl^—；或者

R₁，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—。

優(yōu)選的是，所述通式(Ⅰ)中R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OH或者OCH₃，R₄為OCH₃，X為Cl^—；或者

R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH3，R₄為OH，X為ClO₄^—。

優(yōu)選的是，所述通式(Ⅰ)中R₅為H，R₁，R₃為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃；

R₃為H，R₁，R₅為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃；或者

R₁為H，R₂為OCH₃，R₃，R₅為CH₃，R₄為OH；

X為Cl^—。

優(yōu)選的是，所述糖尿病為Ⅱ型糖尿病。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較所具有的有益效果：Pdx1作為調(diào)控胰島素的合成和分泌、胰島細(xì)胞分化及胰腺發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在治療糖尿病領(lǐng)域引起極大關(guān)注。本發(fā)明首次以Pdx1作為糖尿病藥物作用靶標(biāo)，建立糖尿病藥物篩選系統(tǒng)，對(duì)II型糖尿病治療針對(duì)性強(qiáng)，適用性廣。此外，本發(fā)明所篩選出來(lái)的糖尿病治療藥物血竭素為天然產(chǎn)物，能夠從動(dòng)植物體內(nèi)提取出來(lái)，具有多種天然產(chǎn)物的優(yōu)點(diǎn)，如易被機(jī)體吸收利用，毒副作用相對(duì)較小，不易產(chǎn)生抗藥性等，從而使其成為糖尿病治療的優(yōu)良候選藥物。而且，本發(fā)明還采用糖尿病小鼠模型對(duì)血竭素，血竭素鹽及其多種衍生物的糖尿病治療作用進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)了血竭素，血竭素鹽及其多種衍生物對(duì)糖尿病小鼠顯著的降血糖及促進(jìn)胰島素分泌的作用。通過(guò)以上分析說(shuō)明，本發(fā)明以Pdx1為靶點(diǎn)篩選出的血竭素，血竭素鹽及其系列衍生物，能夠成為糖尿病治療的候選藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為血竭素及其衍生物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性的影響，數(shù)據(jù)表示為：^*：與control組相比，P<0.05，^**：與control組相比，P<0.01。

圖2為血竭素及其衍生物對(duì)經(jīng)典胰島素信號(hào)通路及Pdx1表達(dá)的影響，數(shù)據(jù)表示：^**：與control組相比，P<0.01。

圖3為血竭素對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，數(shù)據(jù)表示：^**：與33nM glucose單獨(dú)處理組相比，P<0.01。

圖4為血竭素對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，數(shù)據(jù)表示：^*：與200μM PA單獨(dú)處理組相比，P<0.05，^**：與200μM PA單獨(dú)處理組相比，P<0.01。

圖5為血竭素對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響，數(shù)據(jù)表示：^**：與糖尿病模型組相比，P<0.01。

圖6為血竭素對(duì)糖尿病小鼠血清中胰島素水平的影響，數(shù)據(jù)表示：^*：與糖尿病模型組相比，P<0.05。

圖7為血竭素對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響，數(shù)據(jù)表示：^**：與糖尿病模型組相比，P<0.01。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。

本發(fā)明所述保護(hù)胰島β細(xì)胞及治療糖尿病的藥物為血竭素及其衍生物。其通式如下：

其中，R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃(血竭素，TI90)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為ClO₄^—(血竭素高氯酸鹽，TI91)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為Cl^—(血竭素鹽酸鹽，TI92)

或R₁，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，R₄為OCH₃，X為C₆H₂N₃O₇^—(血竭素苦味酸鹽，TI94)

或R₁，R₅為H，R₂為O，R₃為CH₃，R₄為OCH₃(5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮，TI95)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃(7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，TI93)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OH，R₃為CH₃，X為Cl^—(7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI96)

或R₁，R₄，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，X為Cl^—(7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI97)

或R₁，R₅為H，R₂為OCH₃，R₃為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI98)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI99)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI100)

或R₃，R₅為H，R₁為CH₃，R₂為OCH₃，R₄為OH，X為ClO₄^—(5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯，高氯酸鹽，TI101)

或R₅為H，R₁，R₃為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI102)

或R₃為H，R₁，R₅為CH₃，R₂為OH，R₄為OCH₃，X為Cl^—(7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI103)

或R₁為H，R₂為OCH₃，R₃，R₅為CH₃，R₄為OH，X為Cl^—(5-羥基-7-甲氧基-4，6二甲基-2苯基-鉻烯，鹽酸鹽，TI104)

本發(fā)明所述的血竭素及其衍生物包括血竭素、血竭素高氯酸鹽、血竭素鹽酸鹽、血竭素苦味酸鹽、5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮、7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯、7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8甲基-2-苯基-鉻烯高氯酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽。

本發(fā)明所述血竭素及其衍生物對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，降低高糖、高脂對(duì)胰島β細(xì)胞的毒性作用，抑制高糖、高脂誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡，本發(fā)明所述的糖尿病是指II型糖尿病；本發(fā)明所述血竭素及其衍生物主要是通過(guò)降低糖尿病血糖水平，或升高胰島素水平，或促進(jìn)胰島β細(xì)胞中調(diào)控胰島素基因的轉(zhuǎn)錄因子Pdx1表達(dá)，或激活胰島β細(xì)胞中AKT和ERK信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)糖尿病的治療作用。

本發(fā)明的血竭素及其衍生物對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用及對(duì)糖尿病的治療作用及相關(guān)機(jī)制研究是通過(guò)以下方法進(jìn)行的：

1、血竭素及其衍生物的獲得

血竭素及其衍生物可通過(guò)商品購(gòu)買(mǎi)獲得或通過(guò)以下方法制備：

血竭素、血竭素高氯酸鹽、血竭素鹽酸鹽的制備方法見(jiàn)專(zhuān)利201610059078.X。

血竭素苦味酸鹽的制備方法見(jiàn)Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

5-甲氧基-6-甲基-2-苯基-7H-色烯-7-酮的制備方法見(jiàn)Robertson A,Whalley W B.383.Journal of the Chemical Society(Resumed),1950:1882-1884.

7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯制備方法見(jiàn)Jurd L.Tetrahedron,1972,28(3):493-504.

7-羥基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見(jiàn)Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見(jiàn)Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

5-羥基-7-甲氧基-6-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽、5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見(jiàn)Brockmann H,Junge H.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1943,76(8):751-763.

7-羥基-5-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽制備方法見(jiàn)Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

5-羥基-7-甲氧基-8-甲基-2-苯基-鉻烯高氯酸鹽(Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

7-羥基-5-甲氧基-6，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽Brockmann H,Junge H,Eckhardt I.Berichte der deutschen chemischen Gesellschaft(A and B Series),1944,77(5):347-353.

7-羥基-5-甲氧基-4，8-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽Chemische Berichte,1944,vol.77/79,p.44,46,Anm.9.

5-羥基-7-甲氧基-4，6-二甲基-2-苯基-鉻烯鹽酸鹽(Journal of the chemical Society,1950,P.1876,1880.

2、血竭素及其衍生物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性的影響

首先釣取Pdx1啟動(dòng)子并克隆入pGL3中，從而構(gòu)建出pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒。HEK293T細(xì)胞以5×10⁴的密度接種于24孔板中。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將Pdx1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Pdx1或空載pGL3與pCMV-β-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后棄去舊的培養(yǎng)基，換成新鮮的10％FBS DMEM培養(yǎng)基。24h后，改用加有10μg/mL化合物的含3％血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～24h，之后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)；當(dāng)所述篩選細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度升高，所述待篩選化合物促進(jìn)人Pdx1的表達(dá)；當(dāng)所述篩選細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)強(qiáng)度降低，所述待篩選化合物抑制人Pdx1的表達(dá)。

如圖1所示，鑒于血竭素，血竭素高氯酸鹽，血竭素鹽酸鹽，7-羥基-6甲基-2-苯基-鉻烯均具能夠較好地促進(jìn)Pdx1啟動(dòng)子活性，所以我們認(rèn)為是它們結(jié)構(gòu)中的共同部分在發(fā)揮此作用，而且據(jù)此我們可以推斷其它具有這個(gè)共同結(jié)構(gòu)的血竭素衍生物，即具有以下通式的化合物也應(yīng)該具有相同的活性，可以作為一種人Pdx1基因的表達(dá)激動(dòng)劑。

3、血竭素及其衍生物通過(guò)經(jīng)典胰島素信號(hào)通路對(duì)Pdx1表達(dá)的影響

胰島β細(xì)胞上存在著胰島素受體和胰島素受體底物，這些蛋白與Pdx1及下游相關(guān)蛋白一起，調(diào)控著胰島素的合成和分泌，維持著β細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活，而PI3K/Akt和ERK信號(hào)通路在這些生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。許多Pdx1的刺激劑，如胰島素和葡萄糖，能夠激活A(yù)kt和ERK磷酸化位點(diǎn)，這反過(guò)來(lái)促進(jìn)了Pdx1的磷酸化和其在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的穿梭位移。為了驗(yàn)證血竭素及其衍生物激活的這兩條信號(hào)通路是否與Pdx1的表達(dá)有關(guān)，本發(fā)明首先檢測(cè)了應(yīng)用這兩個(gè)通路的抑制劑是否影響Pdx1報(bào)告基因的表達(dá)，然后檢測(cè)這兩個(gè)通路的抑制劑是否解除血竭素及其衍生物對(duì)Pdx1表達(dá)的影響。

釣取Pdx1啟動(dòng)子并克隆入pGL3中，從而構(gòu)建出pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒。向INS-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒，然后分別加入各種試劑如血竭素及其衍生物(10μg/mL)，ERK抑制劑U0126(10μM)，Akt抑制劑LY294002(10μM)等。比較加入10μg/mL的血竭素或其衍生物與加入抑制劑U0126或LY294002后，報(bào)告基因的活性。

4、血竭素及其衍生物對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

(1)胰島β細(xì)胞高糖損傷模型的建立

主要采用INS-1細(xì)胞體外模擬高糖對(duì)β細(xì)胞的毒性作用，建立高糖損傷模型，即分別用含有不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞一段時(shí)間后，通過(guò)MTT法考察不同濃度的葡萄糖對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的INS-1細(xì)胞的毒性。

(2)胰島β細(xì)胞高脂損傷模型的建立

主要采用INS-1細(xì)胞體外模擬高脂對(duì)β細(xì)胞的毒性作用，建立高脂損傷模型，即分別用含有不同濃度棕櫚酸(Palmitic acid，PA)的培養(yǎng)基培養(yǎng)INS-1細(xì)胞24h后，通過(guò)MTT法考察不同濃度的棕櫚酸對(duì)INS-1細(xì)胞的毒性。

(3)血竭素及其衍生物對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到33mM高糖培養(yǎng)基條件下的胰島β細(xì)胞高糖損傷模型內(nèi)，72小時(shí)后采用MTT法考察不同濃度的血竭素及其衍生物對(duì)高糖損傷INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以反映血竭素及其衍生物對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

(4)血竭素及其衍生物對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到200μM棕櫚酸培養(yǎng)條件下的胰島β細(xì)胞高脂損傷模型內(nèi)，24小時(shí)后采用MTT法，考察不同濃度的血竭素及其衍生物對(duì)高脂損傷INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響以反映血竭素及其衍生物對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用。

(5)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用

為研究血竭素及其衍生物對(duì)高糖(高脂)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，本發(fā)明主要采用了DAPI染色實(shí)驗(yàn)，這是被廣泛運(yùn)用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)。

將INS-1細(xì)胞種到96孔板中，培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入新培養(yǎng)基，分四組處理：普通培養(yǎng)基組，普通培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素組，33mM高糖培養(yǎng)基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素)。繼續(xù)孵育72h后，用PBS清洗細(xì)胞3遍，然后用4％的多聚甲醛(溶解在PBS中，PH7.4；Sigma)室溫下固定30min。將固定后的細(xì)胞用PBS清洗3次后，37℃避光條件下用DAPI染色20min，然后在Olympus BX50熒光顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察細(xì)胞并拍照。觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目，考察血竭素及其衍生物對(duì)高糖或高脂誘發(fā)的細(xì)胞凋亡的影響。

(6)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用與pdx1表達(dá)的關(guān)系

為了確定血竭素及其衍生物的抗凋亡作用過(guò)程中是否有Pdx1的參與，本發(fā)明主要通過(guò)蛋白免疫印跡的方法考察了在高糖、高脂或普通培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞內(nèi)Pdx1的表達(dá)情況。

將INS-1細(xì)胞種到96孔板中，培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入新培養(yǎng)基，分四組處理：普通培養(yǎng)基組，普通培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素及其衍生物組，33mM高糖培養(yǎng)基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續(xù)孵育72h后分別收集上述四組細(xì)胞，提取蛋白，然后在12％分離膠-5％濃縮膠的膠板中進(jìn)行蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后，最后用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。分析比較Pdx1的蛋白表達(dá)情況以考察血竭素及其衍生物的抗凋亡作用與Pdx1表達(dá)的關(guān)系。

5、血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

(1)糖尿病小鼠模型的建立

為了驗(yàn)證血竭素及其衍生物是否具有降血糖作用，本發(fā)明使用了雄性C57BL/6J糖尿病模型小鼠，來(lái)開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

糖尿病小鼠模型建立方法為：在7周大的雄性C57BL/6J小鼠腹腔內(nèi)注射100mg/kg的STZ，同時(shí)高糖高脂飲食(59％基本飼料，20％蔗糖，18％豬油，3％的蛋黃)。2周后，取小鼠尾靜脈血液，測(cè)量空腹6h后小鼠體內(nèi)血糖含量，連續(xù)3天測(cè)得的小鼠空腹血糖≥7.0mmol/L，代表本發(fā)明中患糖尿病的C57BL/6J小鼠造模成功。

(2)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用

首先將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為以下幾組：正常對(duì)照組：血糖水平正常的C57BL/6J小鼠，用普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病對(duì)照組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射生理鹽水并高糖高脂飲食；實(shí)驗(yàn)組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射不同濃度的血竭素(5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)并高脂飲食。其中實(shí)驗(yàn)組小鼠按加入血竭素及其衍生物的濃度分為3組，和正常對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組一起共分為5組，每組6只小鼠。各組小鼠每隔一天向腹腔注射不同濃度的血竭素及其衍生物或等量的生理鹽水，持續(xù)4周，之后檢測(cè)小鼠體內(nèi)血漿血糖水平。

(3)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠分組同上，然后分別于小鼠眼部取血，5000rpm離心5min，取上清，即為血清。用Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒測(cè)血清的胰島素含量，實(shí)驗(yàn)方法參照說(shuō)明書(shū)。通過(guò)不同組糖尿病小鼠的血清胰島素水平差異值判斷血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響。

(4)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

為了驗(yàn)證血竭素及其衍生物對(duì)體內(nèi)高糖環(huán)境下β細(xì)胞的保護(hù)作用是否也是通過(guò)能促進(jìn)Pdx1蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明采用了蛋白免疫印跡的方法考察了血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：糖尿病對(duì)照組小鼠Pdx1蛋白的表達(dá)量明顯少于正常對(duì)照組，當(dāng)糖尿病小鼠經(jīng)10mg/kg的血竭素及其衍生物處理后，Pdx1蛋白的表達(dá)得以恢復(fù)。表明不僅在體外血竭素及其衍生物能促進(jìn)Pdx1的表達(dá)，在體內(nèi)同樣能促進(jìn)糖尿病小鼠胰島中Pdx1蛋白的表達(dá)。即血竭素及其衍生物通過(guò)促進(jìn)Pdx1的表達(dá)，抑制II型糖尿病小鼠體內(nèi)β細(xì)胞的凋亡，維持一定的β細(xì)胞數(shù)目，使得β細(xì)胞能分泌足夠的胰島素來(lái)發(fā)揮其降血糖作用。

藥物組合物和治療方法

藥物組合物以及治療人Pdx1基因相關(guān)疾病如糖尿病等的方法亦在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。所述藥物組合物包括有效量的本發(fā)明的血竭素及其衍生物以及可藥用載體?！翱伤幱幂d體”包括溶劑、分散劑、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑以及等張劑和吸收延遲劑等。

本發(fā)明的藥物組合物可通過(guò)傳統(tǒng)方法制成各種適應(yīng)于不同給藥途徑的藥物劑型。例如，它可制成口服膠囊或片劑。膠囊可包含任何標(biāo)準(zhǔn)的可藥用物質(zhì)如明膠、纖維素等。片劑可按傳統(tǒng)方法即將藥物組合物與固相載體以及潤(rùn)滑劑壓縮制得。固相載體包括淀粉和糖斑脫土。本發(fā)明的藥物組合物還可制成硬殼片劑或包含捆綁劑如乳糖或甘露醇、常規(guī)填充劑以及壓片劑的膠囊。本發(fā)明的藥物組合物還可通過(guò)非腸道途徑給藥。非腸道途徑給藥劑型包括本發(fā)明的藥物組合物的水劑、等張鹽溶液或5％的糖溶液以及與其他本領(lǐng)域公知的可藥用賦形劑形成的制劑。環(huán)式糊精或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的促溶劑均可作為藥用賦形劑來(lái)遞呈本發(fā)明的藥物組合物。

概括地講，本發(fā)明的血竭素及其衍生物可懸溶于可藥用載體(如生理溶液)中，通過(guò)口服或靜脈輸液，或通過(guò)皮下、肌下、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣道內(nèi)、肺內(nèi)注射或輸液等途徑給藥。劑型的選擇受到給藥途徑、制劑類(lèi)型、患者(病種、病情、體形、體重、體表面積、年齡、性別)、藥物相互影響以及收治醫(yī)師的診斷等諸多因素的影響。適用的制劑用量范圍為0.01～100.00mg/kg。用量范圍可隨病人情況與給藥途徑的不同而做相應(yīng)的調(diào)整。其將主要取決于收治醫(yī)師的診斷。例如，口服劑量一般要高于靜脈注射劑量。所述劑量可通過(guò)本領(lǐng)域公知的經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化方法進(jìn)行調(diào)整。將本發(fā)明的藥物組合物包裹于適宜的藥物遞呈載體(如聚合微粒體或輸入設(shè)備)可提高給藥，特別是口服給藥的效率。

本發(fā)明的藥物組合物的活性可通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明的藥物組合物的藥理活性反映在其調(diào)節(jié)人Pdx1基因表達(dá)活性的能力上。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，所述藥物組合物被注射入動(dòng)物(如小鼠模型)體內(nèi)以評(píng)價(jià)其藥理活性。在此基礎(chǔ)上，合適的劑量范圍和給藥途徑遂得以確定。

為了便于理解本發(fā)明，特列舉以下實(shí)施例。其作用應(yīng)被理解為是對(duì)本發(fā)明的闡釋而非對(duì)本發(fā)明的任何形式的限制。

主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1、細(xì)胞

HepG2細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞和INS-1細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；pGL3載體購(gòu)自BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心-NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心。

2、試劑、酶與藥品

蛋白酶K(20mg/mL)購(gòu)自Sigma公司；λ-HindIII DNA Marker和DL2000DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；HIFI Taq DNA polymerase、10×Taq Buffer和dNTPs購(gòu)自北京全式金公司；限制性?xún)?nèi)切酶XhoI、HindIII和T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；Promega TA克隆試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega公司；LB培養(yǎng)液購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；Amp抗生素(氨芐青霉素)購(gòu)自百靈威科技有限公司；MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，噻唑藍(lán))購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；ERK抑制劑U0126購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；Akt抑制劑LY294002購(gòu)自購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；棕櫚酸(PA)購(gòu)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中心；DAPI購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；STZ(鏈脲菌素)購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒購(gòu)自瑞典Mercodia公司。

其他生化試劑包括甲醇、乙醇、冰醋酸、氯仿、異丙醇及多聚甲醛、二甲基亞砜、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉等均購(gòu)自北京化工廠(chǎng)，均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為雙蒸水。

實(shí)施例

1、血竭素及其衍生物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性的影響

首先釣取Pdx1啟動(dòng)子并克隆入pGL3中，從而構(gòu)建出pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒。HEK293T細(xì)胞以5×10⁴的密度接種于24孔板中。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將Pdx1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Pdx1或空載pGL3與pCMV-β-gal質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后棄去舊的培養(yǎng)基，換成新鮮的10％FBS DMEM培養(yǎng)基。24h后，改用加有10μg/mL化合物的含3％血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～24h，之后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的熒光值比值的相對(duì)倍數(shù)值，即為所有化合物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性促進(jìn)或抑制的效果。熒光素酶(firefly luciferase)的活性與β半乳糖苷酶(β-gal)的活性之比，剔除了樣本轉(zhuǎn)染效率的差異，可比較客觀地反映樣本間啟動(dòng)子活性的差異。不同樣品的熒光素酶相對(duì)活性為每一樣品熒光素酶活性與每一樣品β半乳糖苷酶活性的比值。結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明所提及的血竭素及其衍生物均可不同程度地促進(jìn)Pdx1啟動(dòng)子的活性；如表1所示，血竭素及其衍生物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性的影響。

表1血竭素及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物對(duì)Pdx1啟動(dòng)子活性的影響

在本實(shí)施例中，Pdx1啟動(dòng)子區(qū)的釣取包括如下步驟：

步驟一、引物設(shè)計(jì)

從NCBI Genbank中找出Pdx1的基因組序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約2000bp的基因調(diào)控序列。用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并利用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)。Pdx1啟動(dòng)子的引物序列如下：上游端引物為：5'-ATTACTCGAGCGTCGCCAAGTCAACCCTCGG-3'(SEQ ID NO.2)；下游端引物為：5'-TTAAGCTTGGGGATTTGGCACTGTGTGGCGTTC-3'(SEQ ID NO.3)。

步驟二、細(xì)胞全基因組提取

將6孔板中一孔密度約為90％的HEK293T細(xì)胞收集，并用PBS洗滌后，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，4℃和4000rpm，離心5min；棄上清，在離心管中加入700μL DNA裂解液，混勻后，加入3.5μl蛋白酶K(20mg/mL)，使終濃度達(dá)到100μg/mL，50℃恒溫水浴2h；加入700μL等體積的飽和酚至樣品裂解液中，溫和、充分混勻3min，12000rpm離心5min；取上層水相至另一1.5mL離心管中，加等體積酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)，顛倒混勻，12000rpm離心5min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24/1)，顛倒混勻，12000rpm離心5min(如水相仍不清澈，可重復(fù)此步驟)；取上層水相至新的離心管，加入1/10體積的3M醋酸鈉、2.5倍體積無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻；室溫靜置10min左右，待絮狀物出現(xiàn)后，12000rpm離心10min；棄上清，用1mL 75％乙醇洗滌沉淀，12000rpm離心5min；棄上清，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀近透明后加入適量體積的無(wú)菌水，室溫溶解30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟三、PCR擴(kuò)增Pdx1啟動(dòng)子

以上述細(xì)胞基因組DNA為模板，利用SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA片段，即為人Pdx1基因啟動(dòng)；PCR反應(yīng)條件為：95℃，5min；95℃，45sec；55℃，45sec；72℃，3min，30個(gè)循環(huán)；72℃，8min。

步驟四、PCR產(chǎn)物的電泳及回收

上述PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后將切下的目的膠塊放入提前準(zhǔn)備好的雙層離心管中(內(nèi)部離心管底部扎孔)一起離心，8000rpm離心5min，棄去上面的離心管，在下面的離心管中加入等體積的平衡酚，充分混勻。-20℃冷凍30min，室溫溶解。12000rpm，離心5min，將上層水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。加入等量的平衡酚/氯仿(1:1)，混勻，12000rpm離心5min。取上清至新離心管，加入1/10體積的3M醋酸鈉，2.5倍體積的無(wú)水乙醇或等體積的異丙醇，混勻，-20℃放置1h。12000rpm，離心10min，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀。至沉淀完全晾干后，加10μl無(wú)菌水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟五、PCR產(chǎn)物的TA克隆

將上述回收產(chǎn)物與TA克隆載體連接，方法按Promega TA克隆試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，4℃過(guò)夜后，將10μL連接產(chǎn)物放入裝有100μLDH5α感受態(tài)菌液的EP管中用200μL移液器輕輕吹打幾次混勻，冰浴30min；42℃熱激90s后，立即轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴3min；在超凈臺(tái)中加入無(wú)抗生素LB培養(yǎng)液800μL，37℃振蕩培養(yǎng)30min；5000rpm，離心1min，棄上清，留大約50μL上清重新懸浮菌體沉淀，涂布于含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)皿上，先于37℃正置培養(yǎng)1h,然后倒置培養(yǎng)12～16h。

步驟六、重組質(zhì)粒的篩選

在細(xì)菌超凈臺(tái)中向無(wú)菌的15mL菌管中加入4mL含有Amp抗生素的液體培養(yǎng)基，挑取單克隆于菌管中，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)10h。堿裂解法提取質(zhì)粒，用XhoI和HindIII酶切鑒定，將酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

步驟七、Pdx1-pGL3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將上述TA克隆細(xì)菌進(jìn)行大量擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，用XhoI和HindIII酶切，回收2Kb片段；同時(shí)將pGL3用XhoI和HindIII酶切，回收酶切后的質(zhì)粒，將回收后的片段和pGL3質(zhì)粒用TAKARA的連接酶I進(jìn)行連接，連接方法按TAKARA Ligation Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，16℃連接4小時(shí)后，將連接產(chǎn)物按上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化并擴(kuò)大培養(yǎng)后，將細(xì)菌涂至具有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，37℃孵箱培養(yǎng)過(guò)夜。挑單個(gè)菌落接種到2ml的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和HindⅢ酶切鑒定，將酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

2、血竭素及其衍生物通過(guò)經(jīng)典胰島素信號(hào)通路對(duì)Pdx1表達(dá)的影響

釣取Pdx1啟動(dòng)子并克隆入pGL3中，從而構(gòu)建出pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒。向INS-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pGL3-Pdx1報(bào)告質(zhì)粒，然后分別加入各種試劑如血竭素及其衍生物(10μg/mL)，ERK抑制劑U0126(10μM)，Akt抑制劑LY294002(10μM)等。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)加入10μg/mL的血竭素或其衍生物后，報(bào)告基因活性升高。當(dāng)加入抑制劑U0126或LY294002后，報(bào)告基因活性明顯降低，說(shuō)明血竭素及其衍生物通過(guò)激活ERK與Akt兩條信號(hào)通路參與Pdx1的表達(dá)調(diào)控。

3、血竭素及其衍生物對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

(1)胰島β細(xì)胞高糖損傷模型的建立

INS-1細(xì)胞分別用含11.1mM葡萄糖的普通培養(yǎng)基、含25mM葡萄糖的高糖培養(yǎng)基和含33mM葡萄糖的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h、48h、72h及96h。然后于上述四個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前4h每孔加入20μL的MTT，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。之后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入150μLDMSO，震蕩混勻15min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm處的吸光值，即代表該時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力。最終發(fā)現(xiàn)無(wú)論是25mM還是33mM葡萄糖都能在72h和96h使INS-1細(xì)胞大量死亡。INS-1細(xì)胞的高糖損傷模型建立成功。

(2)胰島β細(xì)胞高脂損傷模型的建立

INS-1細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的棕櫚酸(終濃度為150μM，180μM，200μM，220μM，240μM，260μM)培養(yǎng)20h后，每孔加入20μL的MTT，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100μL DMSO，震蕩混勻15min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm處的吸光值，即代表該時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活力。最終發(fā)現(xiàn)200-260μM棕櫚酸均能在24h使INS-1細(xì)胞大量死亡。INS-1細(xì)胞的高脂損傷模型建立成功。

(3)血竭素及其衍生物對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到33mM高糖培養(yǎng)基條件下的胰島β細(xì)胞高糖損傷模型內(nèi)，72小時(shí)后采用MTT法考察不同濃度的血竭素及其衍生物對(duì)高糖損傷INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖3所示，血竭素的濃度在5-20μg/mL能顯著減輕細(xì)胞的糖毒性，對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用；如表2～16所示，血竭素及其衍生物的濃度5-20μg/mL能顯著減輕細(xì)胞的糖毒性，對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用。

表2 TI90對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表3 TI91對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表4 TI92對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表5 TI93對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表6 TI94對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表7 TI95對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表8 TI96對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表9 TI97對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表10 TI98對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表11 TI99對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表12 TI100對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表13 TI101對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表14 TI102對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表15 TI103對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表16 TI104對(duì)高糖損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

(4)血竭素及其衍生物對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

將不同濃度的血竭素及其衍生物加入到200μM棕櫚酸培養(yǎng)條件下的胰島β細(xì)胞高脂損傷模型內(nèi)，24小時(shí)后采用MTT法，考察不同濃度的血竭素及其衍生物對(duì)高脂損傷INS-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。結(jié)果如圖4所示，血竭素濃度在10-20μg/mL能顯著減輕細(xì)胞的高脂毒性，對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用；如表17～31所示，血竭素及其衍生物的濃度10-20μg/mL能顯著減輕細(xì)胞的高脂毒性，對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用。

表17 TI90對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表18 TI91對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表19 TI92對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表20 TI93對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表21 TI94對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表22 TI95對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表23 TI96對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表24 TI97對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表25 TI98對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表26 TI99對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表27 TI100對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表28 TI101對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表29 TI102對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表30 TI103對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

表31 TI104對(duì)高脂損傷胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用

(5)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用

將INS-1細(xì)胞接種到96孔板后中，24h后棄去舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入新培養(yǎng)基，分四組處理：普通培養(yǎng)基組，普通培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素組，33mM高糖培養(yǎng)基組(高脂模型則為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養(yǎng)基+10μg/mL血竭素組(高脂模型則為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續(xù)孵育72h后，用PBS清洗細(xì)胞3遍，然后用4％的多聚甲醛(溶解在PBS中，PH7.4；Sigma)室溫下固定30min。將固定后的細(xì)胞用PBS清洗3次后，37℃避光條件下用DAPI染色20min，然后在Olympus BX50熒光顯微鏡(Olympus,Tokyo,Japan)下觀察細(xì)胞并拍照。結(jié)果表明在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，INS-1細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形，核質(zhì)較均勻，而高糖或高脂環(huán)境中培養(yǎng)的INS-1細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮并破碎，可見(jiàn)凋亡小體，說(shuō)明高糖或高脂培養(yǎng)條件確實(shí)能誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，而血竭素及其衍生物則在一定程度上抑制了高糖或高脂誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，具有抗凋亡作用。

(6)血竭素及其衍生物的抗凋亡作用及與pdx1表達(dá)的關(guān)系

將INS-1細(xì)胞種到96孔板后中，24h后棄去舊培養(yǎng)基，同時(shí)加入新培養(yǎng)基，分四組處理：普通培養(yǎng)基組，普通培養(yǎng)基+10ug/mL血竭素組，33mM高糖培養(yǎng)基組(高脂模型為200μM棕櫚酸組)，33mM高糖培養(yǎng)基+10μg/mL組(高脂模型為200μM棕櫚酸+10μg/mL血竭素組)。繼續(xù)孵育72h后分別收集上述四組細(xì)胞，提取蛋白，然后在12％分離膠-5％濃縮膠的膠板中進(jìn)行蛋白電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、洗滌后，最后用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：INS-1細(xì)胞暴露于高糖或高脂環(huán)境時(shí)Pdx1的表達(dá)急劇下降，而加入了10μg/mL的血竭素及其衍生物后Pdx1的表達(dá)又恢復(fù)到正常水平。由于前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明高糖或高脂條件能誘導(dǎo)INS-1細(xì)胞發(fā)生凋亡，而血竭素及其衍生物則在一定程度上抑制高糖或高脂誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。且文獻(xiàn)報(bào)道Pdx1表達(dá)降低與β細(xì)胞凋亡或因此而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡密切相關(guān)。因此血竭素及其衍生物對(duì)高糖或高脂條件下INS-1細(xì)胞的抗凋亡作用與Pdx1的表達(dá)密切相關(guān)。

4、血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠血糖的影響

(1)糖尿病小鼠模型的建立

在7周大的雄性C57BL/6J小鼠腹腔內(nèi)注射100mg/kg的STZ，同時(shí)高脂飲食(59％基本飼料，20％蔗糖，18％豬油，3％的蛋黃)。2周后，取小鼠尾靜脈血液，測(cè)量空腹6h后小鼠體內(nèi)血糖含量，連續(xù)3天測(cè)得的小鼠空腹血糖≥7.0mmol/L，代表本發(fā)明中患糖尿病的C57BL/6J小鼠造模成功。

(2)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用

首先將C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為以下幾組：正常對(duì)照組：血糖水平正常的C57BL/6J小鼠，用普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病對(duì)照組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射生理鹽水并高脂飲食；實(shí)驗(yàn)組：造模成功的C57BL/6J糖尿病小鼠，腹腔注射低、中、高不同濃度的血竭素(5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg)并高脂飲食。其中實(shí)驗(yàn)組小鼠按加入血竭素及其衍生物的濃度分為3組，和正常對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組一起共分為5組，每組6只小鼠。各組小鼠每隔一天向腹腔注射不同濃度的血竭素及其衍生物或等量的生理鹽水，持續(xù)4周，之后檢測(cè)小鼠體內(nèi)血漿血糖水平。結(jié)果如圖5所示，注射10mg/kg血竭素能顯著降低CB57BL/6J糖尿病小鼠體內(nèi)的血漿血糖水平；如表32～35所示，注射5～20mg/kg血竭素及其衍生物對(duì)CB57BL/6J糖尿病小鼠體內(nèi)的血漿血糖水平影響結(jié)果。

表32 TI90對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響

表33 TI91對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響

表34 TI92對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響

表35 TI93對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響

(3)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠分組同上，然后分別于小鼠眼部取血，5000rpm離心5min，取上清，即為血清。用Mercodia Rat Insulin ELISA試劑盒測(cè)血清的胰島素含量，實(shí)驗(yàn)方法參照說(shuō)明書(shū)。結(jié)果表明：與正常對(duì)照組小鼠相比，糖尿病小鼠的血清胰島素水平顯著下降，但10mg/kg血竭素及其衍生物處理后，糖尿病小鼠的血清胰島素水平又能恢復(fù)到正常水平。結(jié)果如圖6所，10mg/kg的血竭素可以顯著升高糖尿病小鼠體內(nèi)胰島素水平；如表36～40所示，10mg/kg的血竭素及其衍生物可以顯著升高糖尿病小鼠體內(nèi)胰島素水平。

表36 TI90對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表37 TI91對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表38 TI92對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

表39 TI93對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素水平的影響

(4)血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

收集不同組小鼠的胰島組織，稱(chēng)重后，加入組織蛋白提取液，冰上裂解15分鐘后，5000rpm，離心5min，吸取上清于新的EP管中，加入4×蛋白上樣緩沖液30μL；沸水煮10min，室溫冷卻，-80℃保存?zhèn)溆?。電泳時(shí)取出一管加入4×蛋白上樣緩沖液，煮沸10分鐘，冰上致冷，瞬時(shí)離心，上樣電泳。電泳完后關(guān)閉電源，將膠體從電泳槽中取出，根據(jù)目的蛋白大小切膠，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中；依照膠塊的大小剪PVDF膜，將此膜放入甲醇中激活，之后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜緩沖液中；冰浴條件下將蛋白從SDS-PAGE凝膠上轉(zhuǎn)至PVDF膜上，恒壓100V轉(zhuǎn)移2h；用1×TBST洗滌標(biāo)記目的蛋白的PVDF膜2-3次，之后將膜浸入5％脫脂奶粉(用1×TBST配制)封閉液中，室溫封閉1-2h；TBST洗滌PVDF膜3次，每次5-10min；取出PVDF膜，浸入用1×TBST稀釋過(guò)的一抗中，4℃標(biāo)記過(guò)夜或室溫標(biāo)記4h；1×TBST洗滌PVDF膜3次，每次5-10min，室溫標(biāo)記二抗30min；1×TBST洗滌膜5次，每次5min；將PVDF膜用Micro Chemi化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行顯影。

比較糖尿病對(duì)照組與正常對(duì)照組小鼠Pdx1蛋白表達(dá)量的差異，以及當(dāng)糖尿病小鼠經(jīng)血竭素及其衍生物處理后，Pdx1蛋白表達(dá)是否得以恢復(fù)，以判斷血竭素及其衍生物在體內(nèi)是否同樣能促進(jìn)糖尿病小鼠胰島中Pdx1蛋白的表達(dá)，如圖7所示，糖尿病對(duì)照組小鼠Pdx1蛋白的表達(dá)量明顯少于正常對(duì)照組，當(dāng)糖尿病小鼠經(jīng)10mg/kg的TI90處理后，Pdx1蛋白的表達(dá)得以恢復(fù)，如表40～43所示，血竭素及其衍生物對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響，Western Blot結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行量化分析，說(shuō)明血竭素及其衍生物能夠顯著促進(jìn)糖尿病小鼠胰島Pdx1的表達(dá)。

表40 TI90對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

表41 TI91對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

表42 TI92對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

表43 TI93對(duì)糖尿病小鼠胰島Pdx1表達(dá)的影響

盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。

SEQUENCE LISTING

<110> 東北師范大學(xué)

<120> 血竭素、血竭素衍生物或其可用鹽在制備糖尿病藥物中的應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1972

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）HEK293T細(xì)胞

<400> 1

cgtcgccaag tcaaccctcg gcgactcggc agattatctc caagggtcaa cacgccgcgg 60

ccaggcaacc ccctccagcc tgccctcctg atcgatgtgg tcactcgcgg ccagggtgat 120

agggtagagt tctccgcggc cgcagacaat ggactcattg acgcgggcgc acagagatta 180

ggtgcccggg ccccacggcc tttcactctc tgcccccacc aaaactgcag gtggcacttt 240

tccctgaaga aatcaccgaa actctccccg cccgccgccg tgcttccctt ggcctgtctt 300

cggtgacagc aagggcatct acaagccagg gagccacaca tcagagccac acacatgagg 360

ccacaggcca ggaagccaca cacatgagtt ctcacacatc gaagcaaatg ctgagactat 420

accggcctcc cgcaagagaa ggaatctgca gagaagtcca cattcccgac tggctttttt 480

gtcttttaat aaaaataaag agtcctcaga atagagcact caatccgcac ttaaaacaca 540

aatatttcca gtaggaagaa agaaatacat taagattgac tctcaaaggt ctggatgttg 600

gtgcgttgtt taggaaaggc ggagcagtga tttttctctg gcttggttct ttgtggttca 660

agctctctct tgctgagacg tttctgcaaa gctgtctagt ttttctaaaa cccacggtgg 720

cgtttcgaga aacgtcctca tttcgggagt atccagtcag aggctggtca ggccgccagg 780

cctagcggat catgcccagg cagggggttg gacgtcaccg ccacccggag gtcatccatc 840

cgcgtcagtg ggtgcagaaa aagtggccct gtttaagtca ggaccccaga atgcccagaa 900

gttactgaat ggtttgaagc caagcacaga tgttatcatg gaaaatgcag cgtttttatt 960

tctttttcta aatatgtaac tcttcctcca cttccccctc tcctgcttgc cttatttcaa 1020

ttgcaagcag aagagagtga gtgttctctg ccggcaaact ccgccagggt cccggcccgt 1080

agagagtcgt caagggtctg gaacccccgt gccaacacct gcccctgctt cgcagcccca 1140

agaggaaggc cgcgtctttc cccctcgctg tattgggaag ctacgttccg ggctggccaa 1200

atgggcccca attttccaaa acccaaattt gtaataccct tcaatttttt aaaaaaaaga 1260

atttaaaaaa gtctctgtga atgcttcaga agttaccgtt tacaccccag aagtacttgc 1320

agcacatcca caagtaaaaa cacacaacga atgccagagt ttcgtgtgtt ttttaaccga 1380

catctttgtg gctgtgaaca aacttcataa ataaaataga atcaaatgct tctgacctag 1440

agagctgggt ctgcaaactt tttttttatc gtattccgca acagttaaat aaaaaattaa 1500

aaactcaaca tgtctccttg taaactacat caattaacaa acacactatg tccattatca 1560

aatataatag aaaaaatata ggaaaataga aaatagaaaa atataggaaa atagaaactt 1620

ttaagccacg gtgaaaatgt ttctataaat gagtggttct aatgttttcg tgagcgccca 1680

ttttggggag caccgccagc tgcccgttca ggagtgtgca gcaaactcag ctgagagaga 1740

aaattggaac aaaagcaggt gctcgcgggt acctgggcct agcctcttag tgcggccagc 1800

caggccaatc acggcccccg gctgaaccac gtggggcccc gcggagccta tggtgcggcg 1860

gccggcccgc cggtccgcgc tggctgtggg ttccctctga gatcagtgcg gagctgtcaa 1920

agcgagcagg ggtggcgccg ggagtgggaa cgccacacag tgccaaatcc cc 1972

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到人Pdx1啟動(dòng)子的編碼序列的上游引物

<400> 2

attactcgag cgtcgccaag tcaaccctcg g 31

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成，以用作得到人Pdx1啟動(dòng)子的編碼序列的下游引物

<400> 3

ttaagcttgg ggatttggca ctgtgtggcg ttc 33