本發(fā)明涉及Bcl-2選擇性抑制劑的制備領(lǐng)域，具體涉及一種pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備方法及產(chǎn)物和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

哮喘是一種很嚴(yán)重的呼吸道疾病，它影響了世界范圍內(nèi)數(shù)百萬(wàn)人的健康，并且患者的數(shù)目呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。哮喘是具有多種亞型的呼吸道炎癥疾病，先天性和適應(yīng)性的免疫系統(tǒng)相互作用會(huì)引起炎癥細(xì)胞的募集，氣道高反應(yīng)性，粘液分泌過(guò)多和氣道重塑。

目前，糖皮質(zhì)激素或結(jié)合長(zhǎng)期短效β-激動(dòng)劑支氣管擴(kuò)張劑(LABA或SABA)和白三烯拮抗劑(LTRAs)作為治療哮喘的一線藥物，對(duì)大多數(shù)的哮喘患者都能起到良好的治療效果。然而，仍有一部分的哮喘患者病情不能被有效控制。吸入糖皮質(zhì)、單克隆抗體和針對(duì)特定的細(xì)胞因子/趨化因子拮抗劑已經(jīng)被用于中度到重度的難治性哮喘，然而這樣的治療方案只針對(duì)過(guò)度表達(dá)的特定位點(diǎn)，如IL-4和IL-5等?；诳贵w的治療方案并不是對(duì)所有類型的哮喘都能起效。目前的治療方案，針對(duì)“非嗜酸性粒細(xì)胞型”哮喘無(wú)法進(jìn)行有效控制。

有研究表明，在嗜酸性粒細(xì)胞性和中性粒細(xì)胞性的哮喘類型中，抗凋亡蛋白Bcl-2都被顯著表達(dá)。目前，Bcl-2蛋白在線粒體上過(guò)度表達(dá)已經(jīng)被報(bào)道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Bcl-2的選擇性抑制劑，能引起炎癥細(xì)胞的凋亡并且能有效緩解哮喘癥狀。然而，Bcl-2選擇性抑制劑水溶性極差，并且缺少細(xì)胞內(nèi)靶向性。因此，使得Bcl-2選擇性抑制劑的臨床治療受到了很大的限制，并不能很大程度地發(fā)揮其藥效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備方法及產(chǎn)物和應(yīng)用，該pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑具有良好的哮喘抑制效果，并能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下：

一種pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備方法，包括如下步驟：

1)將兩親性高分子溶于良溶劑中，加入具有pH響應(yīng)性基團(tuán)的修飾劑，攪拌反應(yīng)，透析后，得到pH敏感的兩親性聚合物；

2)將步驟1)中的pH敏感的兩親性聚合物和Bcl-2選擇性抑制劑溶于良溶劑中攪拌反應(yīng)，得到混合溶液；

3)將步驟2)中的混合溶液經(jīng)過(guò)旋蒸，透析，離心后，得到pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑。

上述制備方法得到的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑，包含了具備哮喘治療作用的Bcl-2選擇性抑制劑，同時(shí)通過(guò)pH敏感的兩親性聚合物自組裝形成膠束，以此提高Bcl-2選擇性抑制劑的細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境靶向，提高抑制哮喘的效果。

pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑(以下簡(jiǎn)稱抑制劑)借助其獨(dú)特的納米級(jí)尺寸，提高納米藥物在肺部的擴(kuò)散效率，利用pH響應(yīng)性實(shí)現(xiàn)入胞后電位的增強(qiáng)導(dǎo)致線粒體靶向，發(fā)揮Bcl-2選擇性抑制劑的效果，實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥細(xì)胞的殺傷。首先，通過(guò)氣道內(nèi)滴注納米級(jí)別的藥物能更加良好地在肺部彌散；其次，該抑制劑表面帶正電荷能更有效地被細(xì)胞攝取，隨著溶酶體的pH下降，抑制劑表面正電位上升，由于和線粒體的靜電作用使得運(yùn)載的Bcl-2選擇性抑制劑能更多地與線粒體上的過(guò)表達(dá)Bcl-2蛋白進(jìn)行結(jié)合，從而提高了藥效。

所述具有pH響應(yīng)性基團(tuán)的修飾劑為帶有咪唑、哌啶等基團(tuán)的小分子化合物。

所述pH響應(yīng)性基團(tuán)為咪唑基團(tuán)或哌啶基團(tuán)。pH敏感的兩親性聚合物需要有效地連接上具有pH響應(yīng)性的基團(tuán)，使得具備線粒體靶向的功能性納米化Bcl-2選擇性抑制劑性能得到保證。

所述兩親性高分子選自市售兩親性輔料或合成高分子聚合物。

所述市售兩親性輔料選自泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐溫、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯、司盤、磷脂、聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、白蛋白、脂蛋白、蓖麻油聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪酸聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚和多元醇酯中的一種或多種。

所述合成高分子聚合物是以聚乙二醇、殼聚糖、聚天冬氨酸芐酯、聚醚酰亞胺、聚多巴胺等高分子為骨架進(jìn)行修飾的聚合物。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中良溶劑選自二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮和N,N-二甲基乙酰胺中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中兩親性高分子選自乙二醇天冬氨酸芐酯共聚物、乙二醇谷氨酸共聚物、泊洛沙姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、吐溫、維生素E聚乙二醇琥珀酸酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物、白蛋白和脂蛋白中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中修飾劑選自1-(3-氨丙基)咪唑或1-(3-氨丙基)哌啶。

作為優(yōu)選，所述步驟1)中兩親性高分子與修飾劑的質(zhì)量投料比為1:5～10。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中Bcl-2選擇性抑制劑選自ABT-737、ABT-263、GX15-070、TW-37、ABT-199、GDC-0199、BDA-366、A-1155463、AT101或HA14-1。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中Bcl-2選擇性抑制劑和pH敏感的兩親性聚合物的質(zhì)量投料比為1:2～20。進(jìn)一步優(yōu)選為1:2～3，為了將Bcl-2選擇性抑制劑更好的組裝在膠束內(nèi)，需要控制pH敏感的兩親性聚合物和Bcl-2選擇性抑制劑的比例。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中良溶劑選自二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺和甲醇中的一種或幾種。

本發(fā)明還提供一種如上述的制備方法制備得到的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑。該納米化抑制劑能借助其納米尺寸，實(shí)現(xiàn)其在肺部的優(yōu)良分布；又能借助其pH敏感性對(duì)炎癥細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境做出響應(yīng)進(jìn)而提高藥物對(duì)炎癥細(xì)胞線粒體的靶向性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞凋亡。作為優(yōu)選，所述pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的粒徑為1～600nm。

本發(fā)明還提供一種如上述的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑在用于制備治療哮喘疾病藥物中的應(yīng)用。

同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

(1)本發(fā)明所涉及的制備方法體系溫和，條件可控，所制備的材料均具有良好的生物相容性，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化可能性。

(2)本發(fā)明所得的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑能夠有效減少炎癥細(xì)胞、炎癥相關(guān)因子的數(shù)量，抑制支氣管旁炎癥細(xì)胞的招募、粘液生產(chǎn)和氣道高反應(yīng)性。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中的咪唑修飾的乙二醇天冬氨酸芐酯共聚物的核磁共振氫譜圖；

圖2為實(shí)施例1中的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的TEM照片；

圖3為應(yīng)用例中哮喘小鼠模型的造模示意圖；

圖4為應(yīng)用例中不同制劑處理完后，肺部灌洗液中總炎癥細(xì)胞數(shù)的數(shù)量變化分析圖；

圖5為為應(yīng)用例中不同制劑處理完后，肺部灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量的變化分析圖；

圖6為本應(yīng)用例中不同制劑處理完后，肺部灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)的數(shù)量變化分析圖；

圖7為本應(yīng)用例中不同制劑處理完后，肺部灌洗液中炎癥因子IL-4的變化分析圖；

圖8為本應(yīng)用例中不同制劑處理完后，肺部灌洗液中炎癥因子IL-5的變化分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1

1)pH敏感的兩親性聚合物的合成：將0.2g的乙二醇天冬氨酸芐酯共聚物溶于5ml的N,N-二甲基甲酰胺中，滴入1g的1-(3-氨丙基)咪唑。在氬氣的保護(hù)狀態(tài)下，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液滴入4℃的0.1N鹽酸溶液中，之后在0.01N鹽酸溶液中透析，凍干，得到咪唑修飾的乙二醇天冬氨酸芐酯共聚物。對(duì)制備得到的pH敏感的兩親性聚合物進(jìn)行NMR結(jié)構(gòu)表征，如圖1所示。

2)pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備：將Bcl-2選擇性抑制劑ABT-199 5mg和步驟1)得到的咪唑修飾的乙二醇天冬氨酸芐酯共聚物10mg溶于3ml二甲基亞砜和1ml甲醇中，攪拌，旋蒸除去甲醇。之后將溶液進(jìn)行透析兩天，離心除去多余的聚合物，得到了pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑。

對(duì)制備得到的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑進(jìn)行TEM表征，如圖2所示。

實(shí)施例2

1)pH敏感的兩親性聚合物的合成：將0.2g的十八胺天冬氨酸芐酯共聚物溶于5ml的二甲基亞砜中，滴入1g的1-(3-氨丙基)哌啶。在氬氣的保護(hù)狀態(tài)下，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液滴入4℃的0.1N鹽酸溶液中，之后在0.01N鹽酸溶液中透析，凍干，得到哌啶修飾的十八胺天冬氨酸芐酯共聚物。

2)pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備：將Bcl-2選擇性抑制劑ABT-199 5mg和步驟1)得到的哌啶修飾的十八胺天冬氨酸芐酯共聚物15mg溶于3ml二甲基亞砜和1ml甲醇中，攪拌，旋蒸除去甲醇。之后將溶液進(jìn)行透析兩天，離心除去多余的聚合物，得到了pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑。

實(shí)施例3

1)pH敏感的兩親性聚合物的合成：將0.2g的乙二醇谷氨酸芐酯共聚物溶于5ml的二甲基亞砜中，滴入1g的1-(3-氨丙基)咪唑。在氬氣的保護(hù)狀態(tài)下，室溫?cái)嚢?2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液滴入4℃的0.1N鹽酸溶液中，之后在0.01N鹽酸溶液中透析，凍干，得到咪唑修飾的乙二醇谷氨酸芐酯共聚物。

2)pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑的制備：將Bcl-2選擇性抑制劑ABT-199 5mg和步驟1)得到的咪唑修飾的乙二醇谷氨酸芐酯共聚物15mg溶于3ml二甲基甲酰胺和1ml甲醇中，攪拌，旋蒸除去甲醇。之后將溶液進(jìn)行透析兩天，離心除去多余的聚合物，得到了pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑。

應(yīng)用例：pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑用于減輕哮喘小鼠氣道內(nèi)炎癥細(xì)胞和炎癥因子。

小鼠過(guò)敏性哮喘模型的建立與結(jié)果分析：利用雄性C57BL/6小鼠造模，在第0天至第14天連續(xù)用1％的卵清蛋白/明礬霧化造模40分鐘。之后連續(xù)霧化造模并連續(xù)給藥Bcl-2選擇性抑制劑及pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑(按照本實(shí)施例1方法制得)，造模過(guò)程如圖3所示。最后一次卵清蛋白/明礬造模后24小時(shí)，處死小鼠，收集肺部灌洗液。之后統(tǒng)計(jì)分析灌洗液中，各類炎癥細(xì)胞和炎癥因子的數(shù)量，進(jìn)行分析，如圖4-8。

如圖4所示通過(guò)不同制劑處理完后，肺部灌洗液中總炎癥細(xì)胞數(shù)的數(shù)量變化分析圖?？梢钥闯鐾ㄟ^(guò)Bcl-2選擇性抑制劑和具有pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑都展現(xiàn)出很好的抑制效果，并且在相同濃度下的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑效果更好。

如圖5所示通過(guò)不同制劑處理完后，肺部灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)的數(shù)量變化分析圖?？梢钥闯鐾ㄟ^(guò)Bcl-2選擇性抑制劑和具有pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑都展現(xiàn)出很好的抑制效果，并且在相同濃度下的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑效果更好。

如圖6所示通過(guò)不同制劑處理完后，肺部灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)的數(shù)量變化分析圖?？梢钥闯鐾ㄟ^(guò)Bcl-2選擇性抑制劑和具有pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑都展現(xiàn)出很好的抑制效果，并且在相同濃度下的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑效果更好。

如圖7所示通過(guò)不同制劑處理完后，肺部灌洗液中與哮喘相關(guān)的炎癥因子IL-4變化分析圖?？梢钥闯鐾ㄟ^(guò)Bcl-2選擇性抑制劑和具有pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑都展現(xiàn)出很好的抑制效果，并且在相同濃度下的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑效果更好。

如圖8所示通過(guò)不同制劑處理完后，肺部灌洗液中與哮喘相關(guān)的炎癥因子IL-5變化分析圖?？梢钥闯鐾ㄟ^(guò)Bcl-2選擇性抑制劑和具有pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑都展現(xiàn)出很好的抑制效果，并且在相同濃度下的pH敏感的納米化Bcl-2選擇性抑制劑效果更好。

以上所述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改，補(bǔ)充和等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。