本發(fā)明涉及植物提取物及其應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種人參提取物的提取方法。

背景技術(shù)：

人體皮膚內(nèi)黑色素分為褐黑素和真黑素兩種，前一種為棕黑色，后一種為紅棕色，皮膚顏色由這兩種色素比例所決定。當(dāng)皮膚受到紫外線照射后，最外層的角質(zhì)細(xì)胞為保護(hù)皮膚，產(chǎn)生黑色素生成刺激因子(α-MSH)與黑色素細(xì)胞中的特異性受體結(jié)合，從而啟動(dòng)系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終引起黑色素合成的關(guān)鍵酶——酪氨酸酶合成，進(jìn)而氧化酪氨酸生成黑色素生成的前體物質(zhì)多巴、多巴醌。在半胱氨酸/谷胱甘肽存在條件下多巴醌生成半胱胺多巴并進(jìn)一步氧化聚合生成可溶性的微紅-黃的褐黑素，而當(dāng)半胱氨酸耗盡，多巴醌自發(fā)脫羧，氧化聚合生成不可溶的棕-黑色真黑素，超出皮膚的清除能力，并沉積在皮膚表面引起皮膚變黑。目前，美白劑主要采取干擾黑色素生成的過(guò)程，降低色素沉著而達(dá)到美白功效。

我國(guó)對(duì)美白化妝品的研究和使用有著悠久的歷史，隨著人們生活質(zhì)量的提高，公眾對(duì)美白化妝品的需求量也與日俱增。伴隨著“回歸大自然”倡導(dǎo)的呼聲“綠色”的呼聲，從天然植物中尋找和提取功能性物質(zhì)，逐漸成為當(dāng)前化妝品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

擁有“百草之王”美譽(yù)的人參理所當(dāng)然地成為了研究者制備美白產(chǎn)品的研究對(duì)象。人參的成分復(fù)雜多樣，含有皂苷、糖類(lèi)、揮發(fā)油、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、脂肪酸、無(wú)機(jī)元素等多種有效成分，其具有美白護(hù)膚功效由來(lái)已久，且已被全世界廣泛認(rèn)可，無(wú)論是在韓國(guó)、日本等亞洲國(guó)家，還是在歐美國(guó)家，含有人參成分的化妝品均受到廣大消費(fèi)者的青睞。

雖然，現(xiàn)有技術(shù)中已有關(guān)于人參美白活性成分的研究報(bào)道，如轉(zhuǎn)化后稀有皂苷F1以及人參葉中稀有皂苷Rh6、R4降低黑色素含量，以及人參葉中對(duì)香豆酸具有體外抑制酪氨酸酶活性，但關(guān)于這些美白功效成分的提取方法的研究卻很少見(jiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種人參提取物的提取方法，該方法提取得到的提取物具有良好的美白功效。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種人參提取物的提取方法，包括如下步驟：

步驟1：取人參須根，經(jīng)水提醇沉、干燥，得到人參粗提物；

步驟2：取所述人參粗提物進(jìn)行熱轉(zhuǎn)化；

步驟3：取所述熱轉(zhuǎn)化后的人參粗提物復(fù)溶，過(guò)濾，收集濾液，經(jīng)D101或AB8型大孔樹(shù)脂，依次采用水和乙醇進(jìn)行洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓去除乙醇，干燥，獲得人參提取物。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的提取方法中，步驟2所述熱轉(zhuǎn)化具體為：置于40-70℃真空干燥條件下48-120小時(shí)。更優(yōu)選地，所述熱轉(zhuǎn)化具體為：置于50-60℃真空干燥條件下64-96小時(shí)。

優(yōu)選地，步驟3所述乙醇的洗脫濃度為10-70％。

優(yōu)選地，步驟1所述水提具體為：按照人參須根和去離子水的質(zhì)量比為1:5-1:15的比例加入去離子水浸泡過(guò)夜，加熱至100℃提取1-3小時(shí)，提取1-4次，合并上清液。

優(yōu)選地，步驟1所述醇沉具體為：采用50％-85％的乙醇進(jìn)行沉淀。

優(yōu)選地，步驟1所述水提后、醇沉前還包括濃縮至18～25℃時(shí)相對(duì)密度為1.005-1.150的步驟。

本發(fā)明還提供了上述提取方法獲得的人參提取物在制備抑制酪氨酸酶活性的化妝品、保健品或藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述提取方法獲得的人參提取物在制備具有美白功效的化妝品、保健品或藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種人參提取物的提取方法，該方法提取得到的人參提取物濃度為0.25mg/mL時(shí)對(duì)酪氨酸酶的抑制活性與3mg/mL的經(jīng)典美白成分熊果苷相當(dāng)，當(dāng)人參提取物濃度為0.125mg/mL與熊果苷3.00mg/mL時(shí)刺激B16細(xì)胞后，黑色素含量相當(dāng)。以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的提取方法獲得的人參提取物能夠有效地抑制酪氨酸酶的活性，顯著降低黑色素的含量，美白護(hù)膚的功效明顯優(yōu)于熊果苷。

附圖說(shuō)明

圖1示本發(fā)明實(shí)施例1～4制備的人參提取物人參對(duì)于小鼠黑色素瘤B16內(nèi)酪氨酸酶活性的影響；其中，數(shù)據(jù)均表示為數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)，***表示P＜0.001；

圖2示本發(fā)明實(shí)施例1～4制備的人參提取物對(duì)于小鼠黑色素瘤B16內(nèi)黑色素含量的影響；其中，數(shù)據(jù)均表示為數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)，***表示P＜0.001；

圖3示本發(fā)明實(shí)施例1不同熱轉(zhuǎn)化時(shí)間獲得的人參提取物的體外酪氨酸酶活性的變化；其中，數(shù)據(jù)均表示為數(shù)值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n＝3)，***表示P＜0.001。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種人參提取物的提取方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的人參提取物的提取方法中，所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1

取人參干燥須根切成小塊，按著1:10的比例加入去離子水浸泡過(guò)夜，加熱至100℃提取2小時(shí)，提取3次，合并上清液，濃縮至22℃時(shí)相對(duì)密度為1.100，冷卻后用乙醇濃度為75％沉淀，收集上清液，減壓去除乙醇，干燥，即得人參粗提物。將人參粗提物放入40℃真空干燥箱內(nèi)熱轉(zhuǎn)化72小時(shí)。將熱轉(zhuǎn)化后的人參粗提物用去離子水復(fù)溶后，加入預(yù)處理的D101型大孔樹(shù)脂，水洗脫后，采用10％濃度乙醇洗脫至無(wú)色，收集洗脫液，減壓去除乙醇，干燥，獲得人參提取物。

實(shí)施例2

取人參干燥須根切成小塊，按著1:15的比例加入去離子水浸泡過(guò)夜，加熱至100℃提取1小時(shí)，提取2次，合并上清液，濃縮至18℃時(shí)相對(duì)密度為1.112，冷卻后用乙醇濃度為75％沉淀，收集上清液，減壓去除乙醇，干燥，即得人參粗提物。將人參粗提物放入50℃真空干燥箱內(nèi)熱轉(zhuǎn)化48小時(shí)。將熱轉(zhuǎn)化后的人參粗提物復(fù)溶后，加入預(yù)處理的D101大孔樹(shù)脂，水洗脫后，采用40％濃度乙醇洗脫至無(wú)色，收集洗脫液，減壓去除乙醇，干燥，獲得人參提取物。

實(shí)施例3

取人參干燥須根切成小塊，按著1:5的比例加入去離子水浸泡過(guò)夜，加熱至100℃提取3小時(shí)，提取3次，合并上清液，濃縮至25℃時(shí)相對(duì)密度為1.150，冷卻后用乙醇濃度為75％沉淀，收集上清液，減壓去除乙醇，干燥，即得人參粗提物。將人參粗提物放入60℃真空干燥箱內(nèi)熱轉(zhuǎn)化48小時(shí)。將熱轉(zhuǎn)化后的人參粗提物復(fù)溶后，加入預(yù)處理的AB8型大孔樹(shù)脂，水洗脫后，采用30％濃度乙醇洗脫至無(wú)色，收集洗脫液，減壓去除乙醇，干燥，獲得人參提取物。

實(shí)施例4

取人參干燥須根切成小塊，按著1:10的比例加入去離子水浸泡過(guò)夜，加熱至100℃提取2小時(shí)，提取2次，合并上清液，濃縮至20℃時(shí)相對(duì)密度為1.040，冷卻后用乙醇濃度為75％沉淀，收集上清液，減壓去除乙醇，干燥，即得人參粗提物。將人參粗提物放入65℃真空干燥箱內(nèi)熱轉(zhuǎn)化24小時(shí)。將熱轉(zhuǎn)化后的人參粗提物復(fù)溶后，加入預(yù)處理的AB8型大孔樹(shù)脂，水洗脫后，采用50％濃度乙醇洗脫至無(wú)色，收集洗脫液，減壓去除乙醇，干燥，獲得人參提取物。

實(shí)施例5人參提取物的美白活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

(一)人參提取物對(duì)體外酪氨酸酶活性影響

取本發(fā)明實(shí)施例1～4制備的人參提取物，用PB緩沖液配置成50.00mg/ml樣品溶液，稀釋為1.5mg/ml、3mg/ml、6mg/ml、12mg/ml、24mg/ml5個(gè)濃度，將人參提取物溶液及相應(yīng)試劑按表1所示體積準(zhǔn)確加入96孔板中，混勻，37℃孵育25min，492nm檢測(cè)吸光度值。

表1體外酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)加樣表

按如下公式所述計(jì)算方法，分別計(jì)算實(shí)施例1～4獲得的人參提取物不同樣品濃度下樣品對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率，以抑制率作為縱坐標(biāo)，樣品稀釋倍數(shù)對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IC50值，結(jié)果如表2所示。

表2人參提取物體外酪氨酸酶活性影響

由表2可知，本發(fā)明實(shí)施例1～4獲得的人參提取物對(duì)體外酪氨酸酶活性具有顯著地抑制作用。

(二)人參提取物對(duì)小鼠黑色素瘤B16內(nèi)酪氨酸酶活性的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的B16細(xì)胞(濃度為6.00×10⁴～8.00×104個(gè)/mL)接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后換為含α-MSH及0.25mg/mL實(shí)施例1～4提供的人參提取物完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，以Ar(美白劑熊果苷濃度為3.00mg/mL)作陽(yáng)性藥物。收集細(xì)胞，用1％Triton X-100溶液，于4℃裂解2h，并于10,000rpm離心10min，收集上清液，Bradford法檢測(cè)蛋白含量。取細(xì)胞蛋白裂解液(蛋白總量為80.00μg)及80.00μL 5.00mML-多巴(L-DOPA)加入96孔板中，補(bǔ)充PB緩沖液(0.01M)至200.00μL，混合均勻，37℃孵育30min，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)492nm吸光度值。通過(guò)492nm吸光度值的變化計(jì)算酪氨酸酶的相對(duì)活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，本發(fā)明實(shí)施例1～4提供的人參提取物可以顯著降低α-MSH刺激B16細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活力，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系。當(dāng)提取物濃度為0.25mg/mL時(shí)抑制活性與3mg/mL熊果苷相當(dāng)，表明本發(fā)明提供的提取方法獲得的人參提取物能夠有效地抑制酪氨酸酶的活性，

(三)人參提取物對(duì)于小鼠黑色素瘤B16內(nèi)黑色素含量的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的B16細(xì)胞(濃度為6.00×10⁴～8.00×10⁴個(gè)/mL)于96孔中培養(yǎng)24h。用含α-促黑激素(α-MSH)及)0.125mg/mL實(shí)施例1～4提取方法獲得的人參提取物完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，熊果苷(Ar)(3.00mg/mL)為陽(yáng)性藥物。收集細(xì)胞，每組細(xì)胞加入100.00μL 1.00mol/L NaOH(含10.00％DMSO)，于80℃水浴裂解2h,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)405nm處的吸光度值。通過(guò)建立黑色素含量和吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算黑色素的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖3可知，本發(fā)明實(shí)施例1～4提取方法獲得的人參提取物作用于α-MSH刺激B16細(xì)胞后可顯著降低細(xì)胞內(nèi)黑色素的含量，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)關(guān)系。且當(dāng)人參提取物濃度為0.125mg/mL與美白劑熊果苷3.00mg/mL時(shí)刺激B16細(xì)胞后黑色素含量相當(dāng)，表明，本發(fā)明實(shí)施例1～4提供的提取方法獲得的人參提取物能夠顯著降低黑色素的含量，美白護(hù)膚的功效明顯優(yōu)于熊果苷。

(四)不同熱轉(zhuǎn)化時(shí)間獲得的人參提取物的體外酪氨酸酶活性的變化

取實(shí)施例1制備的人參粗提物，等量3份放入真空干燥箱中，分別于恒溫干燥24h、48h、72h后，然后按照實(shí)施例1熱轉(zhuǎn)化后的步驟進(jìn)行提取，獲得人參提取物，按照“人參提取物對(duì)體外酪氨酸酶活性影響”中的方法，對(duì)體外酪氨酸酶活性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，本發(fā)明實(shí)施例1～4提供的人參提取物對(duì)體外酪氨酸酶活性的抑制作用隨著加熱時(shí)間的增加而增強(qiáng)。

結(jié)論：由表2、圖1～3的試驗(yàn)結(jié)果可知，本發(fā)明提供的制備方法提供的人參提取物能夠有效地抑制體外酪氨酸酶的活性和小鼠黑色素瘤B16內(nèi)酪氨酸酶的活性，并顯著降低黑色素的含量，美白護(hù)膚的功效明顯優(yōu)于經(jīng)典美白成分熊果苷。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。