技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種中藥組合物及其新用途，特別是涉及一種具有抗癌作用的中藥組合物及其新用途。

背景技術(shù)：

癌癥是危及人類健康的重大疾病，其致死率呈逐年上升的趨勢(shì)，它的發(fā)生和發(fā)展是多因素參與、多基因改變及多階段發(fā)展的復(fù)雜病變過(guò)程。目前對(duì)于癌癥的治療大多采用手術(shù)治療結(jié)合放、化療方法，但是該方法對(duì)病人的創(chuàng)傷大，危險(xiǎn)性高，且費(fèi)用昂貴，但療效卻并不理想。中藥作為我國(guó)傳統(tǒng)防病治病的武器，伴隨著近年來(lái)逐步深入的研究與探索，在癌癥治療中越來(lái)越受到重視。研究表明，在腫瘤防治過(guò)程中，中藥主要是從提高機(jī)體免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療的減毒增效等方面發(fā)揮作用的。

有研究表明,惡性腫瘤并發(fā)靜脈血栓的比率可達(dá)2.74％～12.1％,其中以胰腺癌、肺癌NSCLC和胃腸癌的發(fā)生率最高，不但影響患者的生活質(zhì)量，而且延誤抗腫瘤治療。Donati(RicciS,Ant onuz zoA,Gall L,et al.Gemcitabine monotherapy in eld erly patient s with advanced non small celI lung cancer:a mat icen ter phase study.Lung Cancer,2000,27(2):75 80)研究顯示:在腫瘤患者的死亡原因中,血栓及相關(guān)并發(fā)癥僅次于腫瘤本身位居第二。靜脈血栓栓塞、肺栓塞和輕度的DIC的發(fā)生是常見(jiàn)的表現(xiàn)(Rickles FR,Levine M,Edwards RL.Hemostatic alterations in cancer patients.Cancer Metastasis Rev.1992；11:237–248.Buller HR,van Doormaal FF,van Sluis GL,Kamphuisen PW.Cancer and thrombosis:from molecular mechanisms to clinical presentations.J Thromb Haemost.2007；5(Suppl 1):246–254)。凝血紊亂是惡性腫瘤疾病常見(jiàn)的并發(fā)癥,主要表現(xiàn)為血液高凝導(dǎo)致血栓形成。本發(fā)明制劑既能調(diào)節(jié)氣血陰陽(yáng)和臟腑功能，可以輔助治療腫瘤，并且具有治療腫瘤并發(fā)血栓。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療癌癥的中藥組合物。本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種中藥組合物在抗血栓作用中的新用途。本發(fā)明的目的在于公開(kāi)一種中藥組合物在減少肺臟、肝臟及腸系膜組織血栓的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明所述中藥組合物由如下原料藥制成(按重量份計(jì))：

本發(fā)明所述中藥組合物由如下原料藥制成(按重量份計(jì))：

所述中藥組合物的原料藥優(yōu)選為：

上述中藥原料可按常規(guī)工藝加入常規(guī)輔料制成片劑、膠囊、口服液、丸劑、顆粒劑等臨床可接受的劑型。

以生藥材(原料藥)量計(jì)算，相當(dāng)于10g生藥的所述組合物制劑中大黃素、大黃酚的總量不得少于0.28mg。

人參皂苷Rg1、Re總量計(jì)不低于100μg、人參皂苷Rb1不低于50μg；水蘇堿不低于50μg；吳茱萸堿、吳茱萸次堿總量計(jì)不低于100μg；芍藥苷50μg。

中藥組合物的口服液制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

步驟1：鱉甲加水煎煮2-4次，每次2-4小時(shí)，合并提取液，濾過(guò)，濾液濃縮為鱉甲煎液；

步驟2：當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取5-7小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液，

步驟3：步驟2水蒸氣蒸餾提取剩余的藥渣與其余原藥材加水煎煮2-4次，每次1-3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至清膏1，

步驟4：步驟3的清膏1加乙醇至含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水得清膏2，

步驟5：步驟4中的清膏2步驟1的鱉甲煎液，煮沸，放冷，加步驟2的揮發(fā)油與蒸餾液及口服液的常規(guī)輔料，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置，濾過(guò)，濾液經(jīng)常規(guī)工藝制成口服液；

所述步驟2和/或4的靜置為：0～5℃靜置；

所述步驟5中加入口服液的常規(guī)輔料為：1-5重量份聚山梨酯80、1-5重量份甜蜜素。

所述制備方法還包括步驟6：大黃素、大黃酚的總量的含量測(cè)定；和/或下述鑒別A、B、C任一一種或幾種。

本發(fā)明還提供該組合物口服液的制備方法，該方法包括如下步驟：鱉甲加水煎煮2-4次，每次2-4小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量；

當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取5-7小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮2-4次，每次1-3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置(0～5℃)10-40小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至相對(duì)密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸10-30分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及1-5重量分聚山梨酯80、1-5重量分甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置(0～5℃)24～48小時(shí)，濾過(guò)，濾液加水至1000體積份，灌封，滅菌，即得；所述體積份與重量份的關(guān)系為g/ml。

所述中藥口服液的制備方法優(yōu)選為：

以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮3次，每次2小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)60-80％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至相對(duì)密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及2重量分聚山梨酯80、甜蜜素2重量分，加水?dāng)嚢枋谷芙?，靜置24～48小時(shí)，濾過(guò)，濾液加水至1000體積份，灌封，滅菌，即得。

本發(fā)明所述組合物口服液的制備方法，該方法包括如下步驟：

選取如下原料藥：

鱉甲加9倍水煎煮3次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至160-200ml；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香加12倍水，水蒸氣蒸餾提取6小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液40-60ml，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次加水12倍量煎煮2小時(shí)，第二、三次分別加水10倍、8倍，煎煮各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至50～60℃相對(duì)密度為1.15的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，0～5℃靜置20-30小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至50～60℃相對(duì)密度為1.06的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙猓?～5℃靜置24～48小時(shí)，濾過(guò)，濾液加水，灌封，105℃滅菌60min。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)上述組合物及其制劑在制備抗肺癌性肺血栓藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)上述組合物及其制劑在制備降低腫瘤對(duì)胸腺的損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)上述組合物及其制劑在制備緩解惡性腫瘤引起的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常藥物中的應(yīng)用。所述血細(xì)胞異常為：白細(xì)胞、紅細(xì)胞或血小板數(shù)目異常。所述惡性腫瘤為肺癌。

本發(fā)明口服液在大鼠血栓模型中具有顯著的降低血液高凝狀態(tài)、減少微血栓形成及降低繼發(fā)性纖溶的作用。在高凝狀態(tài)中會(huì)存在繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，從而表現(xiàn)為FDP和D-二聚體水平的升高。本研究中，我們觀察到兩個(gè)治療組的共30個(gè)數(shù)據(jù)中約83.3％(10/12)的數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比有明顯差異。通過(guò)組織病理學(xué)分析，在對(duì)照組及兩個(gè)治療組中均發(fā)現(xiàn)明顯的血管微血栓形成。我們觀察到給予本發(fā)明服液灌胃處理后兩個(gè)治療組大鼠中的肺臟、肝臟及腸系膜組織中微血栓的數(shù)量均明顯減少。

本發(fā)明口服液能顯著降低肺癌的肺血栓發(fā)生率及肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率，說(shuō)明本發(fā)明口服液具有抗肺癌性肺血栓和肺轉(zhuǎn)移形成作用。本發(fā)明口服液對(duì)對(duì)C57鼠肺癌移植實(shí)體瘤及腫瘤性VTE的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次其抑瘤率基本在40％左右。本發(fā)明口服液能夠降低腫瘤對(duì)胸腺的損傷，增強(qiáng)脾臟的腫瘤免疫應(yīng)答，使機(jī)體的免疫功能增強(qiáng)。本發(fā)明口服液能使肺癌荷瘤鼠白細(xì)胞、血小板數(shù)向正常值方向改善，可緩解惡性腫瘤引起的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常。實(shí)驗(yàn)中肺癌荷瘤鼠的白細(xì)胞顯著升高，可能是由于癌細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，刺激骨髓中粒細(xì)胞釋放，使外周白細(xì)胞增多；本發(fā)明使LLC(Lewis肺癌瘤株)荷瘤鼠白細(xì)胞數(shù)下降，可減輕白細(xì)胞升高引起的炎癥反應(yīng)和組織損傷。LLC荷瘤鼠的紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)均明顯降低，可能與血栓形成消耗部分血小板、紅細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞破壞骨髓造血功能，及惡性腫瘤使機(jī)體過(guò)度消耗vitB12、葉酸等有關(guān)，HSOS使LLC荷瘤鼠血小板數(shù)升高，表明其對(duì)機(jī)體有一定保護(hù)作用。

附圖說(shuō)明

圖1：各組大鼠血小板檢測(cè)值；

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對(duì)照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較

圖2-1：正常大鼠肺臟顯微鏡圖；

圖2-2：大鼠肺臟微血栓顯微鏡圖；

圖2-3：正常大鼠肝臟顯微鏡圖；

圖2-4：大鼠肝臟微血栓顯微鏡圖；

圖2-5：正常大鼠腸系膜顯微鏡圖；

圖2-6：大鼠腸系膜微血栓顯微鏡圖

圖3：大鼠肝、肺、腸系膜組織內(nèi)高倍視野下微血栓數(shù)量^*P<0.05與對(duì)照組比較

圖4：小鼠肺血栓光鏡圖，HE×100

圖4-1：橫切面圖，

圖4-2：縱切面圖

圖5：小鼠肺組織癌栓光鏡圖，HE×100

圖6：小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)光鏡圖，HE×100

圖6-1：?jiǎn)蝹€(gè)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，

圖6-2：多個(gè)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)橫切面圖，

圖6-3：多個(gè)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)縱切面圖，

圖6-4：肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)彌漫整個(gè)肺葉橫切面圖，

圖6-5：肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)彌漫整個(gè)肺葉縱切面圖。

圖7：小鼠腫瘤組織微血管顯微鏡圖，SP法×200

圖7-1：模型組小鼠腫瘤組織微血管顯微鏡圖，

圖7-2：給藥組小鼠腫瘤組織微血管顯微鏡圖。

圖8：小鼠脾組織光鏡圖，HE×100

圖8-1：正常組小鼠脾組織光鏡圖，

圖8-2：模型組小鼠脾組織光鏡圖，

圖8-3：給藥組小鼠脾組織光鏡圖。

實(shí)驗(yàn)例1：

1材料與方法

1.1動(dòng)物

使用體質(zhì)量為180-220g的雄性SD大鼠，7～9周齡(由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。在溫度控制室內(nèi)飼養(yǎng)(室溫24±1℃，濕度不得低于40％)，保持12h的明/暗循環(huán)，所有大鼠均提供飲水及食物。空白組、對(duì)照組、治療A組(造模后給予實(shí)施例1口服液)和治療B組(造模前3天及造模后均給實(shí)施例1口服液)各包括10只大鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

角叉菜膠(SIGMA ALDAICH，USA)，電子天平(Sartorius，型號(hào)：BS423S)，顯微鏡，全自動(dòng)血液分析儀(型號(hào)：LH750，美國(guó)Beckman公司)；全自動(dòng)凝血分析儀(型號(hào)：Acl-Top，美國(guó)IL公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將SD大鼠隨機(jī)分為4組，即空白組、對(duì)照組、治療A組和治療B組，每組10只。

1.4制作大鼠血栓模型

取SD雄性大鼠，角叉菜膠用生理鹽水配制成2％(20mg/mL)濃度，皮下注射(20mg/kg)，注射部位為后肢足跖部。注射后置于室溫下，多數(shù)動(dòng)物尾尖部出現(xiàn)暗紅色血栓形成區(qū)，并逐漸向尾根部擴(kuò)大。48～72h后局部從發(fā)紺變?yōu)楹谏?，隨后尾部干細(xì)斷落。評(píng)價(jià)：24h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尾部小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)含有大量纖維素和少量白細(xì)胞及血小板，血管內(nèi)皮細(xì)胞核濃縮呈骰子狀，血管內(nèi)壁中性粒細(xì)胞靠邊。72h可見(jiàn)較大血管呈炎癥改變，伴有混合性血栓形成。

1.5實(shí)驗(yàn)方案

4組大鼠均觀察72小時(shí)。觀察期間，治療A組大鼠皮下注射角叉菜膠后72h內(nèi)均給予實(shí)施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)。治療B組大鼠在注射角叉菜膠前72h即給予實(shí)施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)，注射角叉菜膠后72h內(nèi)亦給予實(shí)施例1口服液灌胃處理(2mL/100g體質(zhì)量，1次/8h)。分別在注射角叉菜膠后24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)取血標(biāo)本行血常規(guī)、凝血(PT、APTT、INR、FIB、PTA)、D-二聚體含量、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(fibrin degradation product，F(xiàn)DP)檢查。在注射角叉菜膠后72h分離出大鼠的肺臟、肝臟及腸系膜組織使用10％的福爾馬林固定。標(biāo)本進(jìn)行脫水后再用石蠟包埋。分別取大鼠左肺上葉、右半肝部及中段小腸系膜進(jìn)行切片，制成切片后(4μm厚)用蘇木精和伊紅染色并進(jìn)行組織病理學(xué)分析，10倍鏡下尋找并選取微血栓數(shù)量最多的視野，在40倍鏡下計(jì)數(shù)微血栓個(gè)數(shù)。由于標(biāo)本或技術(shù)的原因，部分大鼠標(biāo)本檢測(cè)失敗，我們均嚴(yán)格按照隨機(jī)原則重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并補(bǔ)充缺失數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

每組數(shù)據(jù)均用x±s表示。采用SAS 9.1(血液化驗(yàn)指標(biāo))及SPSS 9.1(微血栓個(gè)數(shù))統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)比較組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中對(duì)各組血液化驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后分別采取welch檢驗(yàn)、Kruskal-wallis檢驗(yàn)、SNK檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組微血栓數(shù)量采用Bonferroni檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠血凝指標(biāo)變化

對(duì)照組大鼠三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PT、APTT值均比空白組明顯縮短，PTA檢測(cè)值則明顯升高(表1，P<0.05)；空白組與對(duì)照組的INR值之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；對(duì)照組的48小時(shí)、72小時(shí)FIB值檢測(cè)值與空白組相比明顯升高(表1，P<0.05)。以上結(jié)果表明對(duì)照組大鼠血液處于高凝狀態(tài)。

與空白組相比：兩個(gè)治療組24小時(shí)、48小時(shí)PT檢測(cè)值與其無(wú)差異，而72小時(shí)PT檢測(cè)值則明顯縮短。治療A組、治療B組的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PT結(jié)果均比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(表1，P<0.05)，提示兩個(gè)治療組大鼠的血液高凝狀態(tài)均比對(duì)照組明顯改善。兩個(gè)治療組之間的PT結(jié)果均無(wú)差異。

與空白組相比：只有治療B組的72小時(shí)的APTT檢測(cè)值與之無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1，P>0.05)。治療A組、治療B組的48小時(shí)、72小時(shí)的APTT結(jié)果均比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(表1，P<0.05)。兩個(gè)治療組之間相比，只有治療A組的72小時(shí)APTT值比治療B組明顯延長(zhǎng)。兩個(gè)治療組的INR檢測(cè)值中除治療A組的24小時(shí)的INR值與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，均比對(duì)照組明顯增大(表1，P<0.05)。與空白組相比除治療A組的24小時(shí)檢測(cè)值外均明顯增大。兩個(gè)治療組之間的INR結(jié)果均無(wú)差異。

兩個(gè)治療組中，除治療A組的72小時(shí)FIB值、治療B組的24小時(shí)FIB值外，其余均比對(duì)照組明顯降低(表1，P<0.05)。與空白組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩個(gè)治療組中，只有治療B組72小時(shí)FIB值比治療A組明顯降低。兩個(gè)治療組中只有治療A組的48小時(shí)PTA值與對(duì)照組相比明顯升高，余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1，P>0.05)。兩個(gè)治療組與空白組相比均明顯升高。兩個(gè)治療組之間只有治療A組48小時(shí)PTA值比治療B組明顯升高。

以上結(jié)果表明兩個(gè)治療組大鼠的血液血凝指標(biāo)絕大多數(shù)均比對(duì)照組明顯改善。

表1各組大鼠血凝指標(biāo)結(jié)果

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對(duì)照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較.

注：PT：凝血酶原時(shí)間；APTT：活化部分凝血活酶時(shí)間；INR：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值；FIB：纖維蛋白原；PTA：凝血酶原活動(dòng)度。

2.2各組大鼠纖溶指標(biāo)變化

對(duì)照組大鼠三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FDP、D-二聚體檢測(cè)值與空白組大鼠相比均明顯10升高(表2，P<0.05)，表明對(duì)照組大鼠纖溶明顯亢進(jìn)，亦是血液高凝的表現(xiàn)。治療A組、治療B組的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的FDP結(jié)果均比對(duì)照組明顯減少(表2，P<0.05)。與空白組相比：治療A組24小時(shí)、48小時(shí)的FDP值明顯增大(表2，P<0.05)，余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療B組24小時(shí)、48小時(shí)的FDP值比治療A組明顯減小(表2，P<0.05)。

治療A組、治療B組的48小時(shí)、72小時(shí)的D-二聚體結(jié)果均比對(duì)照組明顯減少(表2，P<0.05)。與空白組相比：兩個(gè)治療組的D-二聚體值與之均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2，P<0.05)。兩個(gè)治療組之間的D-二聚體值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

以上結(jié)果表明兩個(gè)治療組大鼠的血液纖溶指標(biāo)絕大多數(shù)均比對(duì)照組明顯改善。

表2各組大鼠纖溶指標(biāo)結(jié)果

^*P<0.05與空白組比較；^△P<0.05與對(duì)照組比較；^▲P<0.05與治療組A比較.

注：FDP：纖維蛋白降解產(chǎn)物；D-Dimer：D-二聚體。

2.3各組大鼠血小板檢測(cè)值

對(duì)照組大鼠三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PLT檢測(cè)值與空白組大鼠相比均明顯升高(圖1，P<0.05)。治療A組、治療B組的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的PLT結(jié)果均比對(duì)照組明顯減少(圖1，P<0.05)。治療A組24小時(shí)PLT結(jié)果比空白組明顯升高，24小時(shí)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，48小時(shí)結(jié)果則明顯降低。治療B組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果均比空白組明顯降低。兩個(gè)治療組之間相比：治療B組24小時(shí)、48小時(shí)的PLT值比治療A組明顯低。治療B組與空白組、對(duì)照組及治療組A比均具有顯著性差異^*P<0.05。

2.4組織病理學(xué)分析

治療組與對(duì)照組大鼠在注射角叉菜膠72小時(shí)后處死并將其肺臟、肝臟及腸系膜組織制作病理切片。經(jīng)過(guò)H-E染色后進(jìn)行病理學(xué)分析，可以發(fā)現(xiàn)在40倍放大視野下，對(duì)照組大鼠的肺臟、肝臟、腸系膜組織內(nèi)可見(jiàn)廣泛的微血栓形成。在對(duì)照組肺臟中亦可見(jiàn)到毛細(xì)血管出血、間質(zhì)內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。在對(duì)照組肝臟中可見(jiàn)到局部肝細(xì)胞濁腫變性及點(diǎn)片狀壞死。在對(duì)照組腸系膜中可見(jiàn)到局部充血、出血(圖2)。

圖2在各組大鼠經(jīng)歷72h的處理之后，取走肺臟、肝臟和腸系膜組織，進(jìn)行H-E染色后通過(guò)描述的方法進(jìn)行組織學(xué)檢查。箭頭所指處即為血管內(nèi)微血栓形成，相關(guān)資料如圖(放大倍數(shù)，×40)。

我們?cè)?0倍鏡視野下選取微血栓數(shù)量最多的視野，并在40倍鏡下計(jì)數(shù)微血栓的數(shù)量，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)兩個(gè)治療組的肺臟、肝臟及腸系膜組織內(nèi)微血栓的數(shù)量均較對(duì)照組明顯減少，而治療組之間微血栓的數(shù)量則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

實(shí)驗(yàn)例2

1材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與瘤株SPF級(jí)C57BL/6小鼠，雌性，8～12月齡，體重27～30g；新西蘭兔，雄性，2～2.5㎏；四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證：SCXK(川)2008-09、SCXK(川)2008-10。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng) 6-7d；Lewis肺癌瘤株(Lewis lung carcinoma，LLC)，四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2藥品與試劑HSOS(實(shí)施例1制備制劑)；胰酶(美國(guó)Amresco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(美國(guó)Gibco公司)；ADP、膠原、凝血酶(批號(hào)384、385、386)，均為Chronolog corporation提供；血小板洗滌液[21]；改良臺(tái)氏液[22]；VEGF、D-二聚體ELISA試劑盒(上海豐翔生物有限公司，批號(hào)201204)；一抗：CD34兔多克隆抗體(Santa Cruz，13012)，二抗：生物素化山羊抗兔IgG(V0527)、DAB顯色試劑盒(753223A)，均為北京中杉金橋生物有限公司生產(chǎn)；分析純枸櫞酸鈉、EDTA-2Na等。

1.3主要儀器MLR-351CO2培養(yǎng)箱(SANYO公司)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司)；81m-25光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)；CELL-DYN1700血細(xì)胞分析儀(美國(guó))；560CA血小板聚集檢測(cè)儀(美國(guó)Chrono-Log公司)；MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；KEN-006低溫高速離心機(jī)(Kendro儀器公司)；超凈工作臺(tái)、低溫冰箱(REVCO)等。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理超凈工作臺(tái)中，取生長(zhǎng)良好的Lewis肺癌細(xì)胞，傾去上清液，貼壁細(xì)胞用0.25％胰酶消化，細(xì)胞脫落后用10％DMEM完全培養(yǎng)基中和，吹打均勻吸入上述離心管中，1200rpm，離心3min，再用DMEM雙無(wú)培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。

2.2接種荷瘤SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠，體重27～30g。超凈工作臺(tái)中，將制備好的瘤細(xì)胞懸液接種于C57BL/6小鼠左腋皮下，0.2ml/只。

2.3分組與給藥接種后將荷瘤鼠分為2組，分別為模型對(duì)照組、給藥組，50只/組，另設(shè)正常組50只，其中給藥組灌胃給予HSOS 0.25ml·d-1(約為16.7倍人用劑量)，正常組及模型組給予NS，連續(xù)給藥25d。新西蘭兔24只，分為給藥組(HSOS 5ml·kg-1·d-1，約為10倍人用劑量)和正常對(duì)照組(NS 5ml·kg-1·d-1)2組，12只/組，連續(xù)灌胃給藥10d。給藥劑量均經(jīng)過(guò)預(yù)試驗(yàn)。

2.4富血小板血漿(PRP)及洗滌血小板的制備

3.8％枸櫞酸鈉抗凝血(枸櫞酸鈉溶液與血液按1:9體積混合)，以1000rpm離心5min，取上清液，得PRP，沉淀物3500rpm進(jìn)一步離心10min，取上清得PPP，以PPP調(diào)節(jié)PRP血小板數(shù)為400～500×109個(gè)/L，用于測(cè)定ADP、膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。PRP以2000rpm離心8min，傾去上清液得血小板沉淀，用血小板洗滌液洗滌兩次，重懸于改良臺(tái)氏液中，調(diào)節(jié)血小板數(shù)為400～500×109個(gè)/L，用于測(cè)定凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集率。

2.5觀察指標(biāo)

2.5.1血細(xì)胞計(jì)數(shù)第25d給藥1h后，各組取25只小鼠摘眼球取血約0.7ml/只，10％EDTA-2Na抗凝(抗凝劑為血液體積的4％)，取0.25ml全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(重點(diǎn)血小板、白、紅細(xì)胞計(jì)數(shù))。

2.5.2血漿D-二聚體、VEGF水平測(cè)定上述剩余血液3000rpm離心20min，收集上清測(cè)血漿D-二聚體及VEGF水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.5.3血小板聚集率第25d給藥1h后，各組剩余小鼠心臟取血，約1.0ml/只，制備洗滌血小板，改良臺(tái)氏液調(diào)零，500μl洗滌血小板中加入10μl凝血酶(100U·ml-1)，測(cè)定5min內(nèi)血小板最大聚集率。

新西蘭兔第10d給藥1h后，真空采血針耳中動(dòng)脈取血10ml/只，制備洗滌血小板，500μl洗滌血小板中加入2μl凝血酶(100U·ml^-1)，測(cè)定5min內(nèi)血小板最大聚集率。另制備PRP，以PPP調(diào)零，500μl PRP中加入10μl ADP，使其終濃度為5μM,測(cè)定5min內(nèi)血小板最大聚集率；500μl PRP中加入1μl膠原，使其終濃度為2μg·ml-1，測(cè)定5min內(nèi)血小板最大聚集率。

2.5.4血栓數(shù)、癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)荷瘤鼠取血處死后，取大腦、肺、腸系膜、股靜脈和髂外靜脈組織，10％福爾馬林液中固定，石蠟包埋(大腦取不同冠面10制成2個(gè)蠟塊，肺取五葉肺制成2個(gè)蠟塊，股靜脈和髂外靜脈各制成1個(gè)蠟塊，腸系膜制成1個(gè)蠟塊)，切片，HE染色，光鏡下計(jì)數(shù)血栓數(shù)并觀察癌栓及癌轉(zhuǎn)移，若出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移，光鏡下計(jì)數(shù)癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。由于癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)大小不一，計(jì)數(shù)方法如下：按轉(zhuǎn)移灶的大小分級(jí)，Ⅰ級(jí)：直徑﹤0.5mm；Ⅱ級(jí)：直徑0.5～1mm；Ⅲ級(jí)：直徑1～2mm；Ⅳ級(jí)：直徑﹥2mm?？傓D(zhuǎn)移數(shù)計(jì)算公式：總轉(zhuǎn)移15數(shù)＝Ⅰ級(jí)(結(jié)節(jié)數(shù))×1+Ⅱ級(jí)×2+Ⅲ級(jí)×3+Ⅳ級(jí)×4[Johnson L.N.；Winter K.M.；Reid S,et al.Cryopreservation of buffy-coat-derived platelet concentrates in dimethyl sulfoxide and platelet additive solution[J].CRYOBIOLOGY,2011,62(2):100-106]。

2.5.5瘤重、抑瘤率動(dòng)物取腫瘤稱重，按公式計(jì)算出抑瘤率：抑瘤率(％)＝[荷瘤組平均瘤重－給藥組平均瘤重/荷瘤組平均瘤重]×100％。

2.5.6胸腺、脾系數(shù)動(dòng)物取胸腺、脾稱重，計(jì)算臟器系數(shù)：臟器系數(shù)＝臟器重量/去瘤體重；脾制備組織切片觀察組織學(xué)變化。

2.5.7腫瘤組織微血管密度(MVD)免疫組化法測(cè)定腫瘤組織CD34的表達(dá)，腫瘤組織10％多聚甲醛固定，制備石蠟切片。免疫組化染色，SP法：具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。顯微鏡下觀察，棕黃色—黃色表達(dá)于細(xì)胞漿為陽(yáng)性，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，Inc.)測(cè)平均光密度。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±S表示，血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血漿D-二聚體、血漿VEGF、血小板聚集率采用單因素方差分析，檢驗(yàn)方差齊性p>0.05使用LSD法，p<0.05采用Dunnett T3法。瘤重、肺癌轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、腫瘤組織MVD計(jì)數(shù)采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析；血栓發(fā)生率、肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析。p<0.05為差異明顯。*表示與正常組相比，^▲P﹤0.05，表示與模型組相比。

3結(jié)果

3.1 HSOS對(duì)LLC引發(fā)肺血栓的影響經(jīng)組織學(xué)檢查，僅在肺組織切片中觀察到血栓。與中老齡正常對(duì)照組(0/50)相比，模型組的發(fā)生率顯著增高(9/50，p﹤0.01)，而給藥組比模型組的發(fā)生率明顯降低(2/50，p＝0.055)，見(jiàn)圖4，由圖可見(jiàn)，血小板凝集成小梁，小梁間充滿凝固的纖維蛋白和紅細(xì)胞。

3.2 HSOS對(duì)LLC肺轉(zhuǎn)移的影響組織學(xué)檢查僅在肺組織中發(fā)現(xiàn)有癌性病變。光鏡下可見(jiàn)，肺組織血管內(nèi)有腫瘤栓子，血管周圍有癌結(jié)節(jié)且每個(gè)結(jié)節(jié)中均可見(jiàn)癌栓；癌結(jié)節(jié)大小不一，呈單個(gè)和或多個(gè)分布，結(jié)節(jié)明顯擠壓、浸潤(rùn)破壞周圍肺組織，甚至相互融合，彌漫整個(gè)肺葉，見(jiàn)圖5-6。模型組肺部癌轉(zhuǎn)移大結(jié)節(jié)、多結(jié)節(jié)較多，個(gè)別病變彌漫整個(gè)肺葉，給藥組未見(jiàn)有彌漫整個(gè)肺葉的病變發(fā)生。給藥組的平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)小于模型組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＝0.031)，給藥組的肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率低于模型組(44/50vs 36/50，p＝0.046)。

3.3 HSOS對(duì)荷LLC鼠局部實(shí)體瘤的影響表3可見(jiàn)，給藥組與模型組相比，給藥組平均瘤重略小于模型組，抑瘤率為9.7％。

3.4 HSOS對(duì)荷LLC鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)及D-二聚體的影響模型組、給藥組與正常組相比白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高(p﹤0.01)；血漿D-二聚體水平顯著升高(p﹤0.01)；紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)顯著降低(p﹤0.01)；給藥組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(p＝0.027)、D-二聚體水平(p＝0.048)明顯低于模型組，血小板計(jì)數(shù)明顯高于模型組(p＝0.015)，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)給藥組與模型組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.77)，見(jiàn)表3。

3.5 HSOS對(duì)血小板聚集率的影響凝血酶誘導(dǎo)的C57鼠、正常兔血小板聚集率各組均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集率各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；膠原誘導(dǎo)的正常兔血小板聚集率給藥組顯著低于正常組(p﹤0.01)，見(jiàn)表4。

3.6 HSOS對(duì)荷LLC鼠血漿VEGF及腫瘤組織MVD的影響模型組、給藥組與正常組相比，VEGF水平明顯高于正常組(p﹤0.01)，但給藥組明顯低于模型組(p＝0.013)，見(jiàn)表3。經(jīng)Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)定，給藥組陽(yáng)性表達(dá)平均光密度顯著低于模型組(8061.85±3944.75vs13169.88±9989.43,p﹤0.01)，給藥組腫瘤組織MVD低于模型組(見(jiàn)圖7，由圖可見(jiàn)，模型組陽(yáng)性表達(dá)較多，腫瘤組織新生血管密集，而給藥組陽(yáng)性表達(dá)較少，腫瘤組織新生血管減少)。

3.7 HSOS對(duì)荷LLC鼠免疫器官的影響與正常組相比，模型組、給藥組的胸腺系數(shù)均降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p﹤0.05)，但給藥組明顯高于模型組(p＝0.045)；模型組、給藥組的脾系數(shù)明顯高于正常組(p＝0.000)，給藥組又顯著高于模型組(p＝0.022)，見(jiàn)表5。

脾組織學(xué)觀察：正常組脾臟由白髓和紅髓組成，脾小體清晰可見(jiàn)；模型組、給藥組均可見(jiàn)脾淋巴細(xì)胞彌漫性增生，紅髓受擠壓縮小，見(jiàn)圖8。

表3 HSOS對(duì)C₅₇BL/6鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)、D-二聚體及VEGF的影響(n＝25)

表4 HSOS對(duì)不同誘導(dǎo)劑血小板最大聚集率的影響

表5 HSOS對(duì)免疫器官及移植瘤、瘤轉(zhuǎn)移的影響(n＝50)

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施方式均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果

實(shí)施例1：

以上三十四味藥材，鱉甲加水煎煮3次(加9倍水)，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量(約180ml)；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時(shí)(加12倍水)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量(約50ml)，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時(shí)(加水12倍)，第二、三次各1.5小時(shí)(分別加水10倍、8倍)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置(0～5℃)24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至相對(duì)密度為1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液及聚山梨酯80、甜蜜素，加水?dāng)嚢枋谷芙猓o置(0～5℃)24～48小時(shí)，濾過(guò)，濾液加水至規(guī)定量(1000ml)，灌封，滅菌(105℃，60min)，即得。每支10ml。

實(shí)施例2：

制備方法：以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至相對(duì)密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液，經(jīng)常規(guī)工藝制成片劑。

實(shí)施例3：

制備方法：以上三十四味，鱉甲加水煎煮3次，每次3小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至適量；當(dāng)歸、川芎、姜黃、高良姜、肉桂、丁香、阿魏、降香水蒸氣蒸餾提取6小時(shí)，收集揮發(fā)油與蒸餾液適量，藥渣及其余二十五味加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二、三次各1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度約1.15(50～60℃)的清膏，加乙醇使含醇量達(dá)70％，調(diào)節(jié)pH值為7.5～8.0，靜置24小時(shí)，濾過(guò)，濾液回收乙醇，加水至相對(duì)密度約1.06(50～60℃)的清膏，再加入鱉甲煎液，煮沸20分鐘，放冷，加揮發(fā)油與蒸餾液，經(jīng)常規(guī)工藝制成顆粒劑。