本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料的制備領(lǐng)域，具體涉及一種生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

創(chuàng)傷、腫瘤切除、畸形矯正及感染等原因使骨喪失骨質(zhì)后容易造成骨缺損。目前，治療骨缺損最主要的方法是骨移植，包括自體骨和異體骨。自體骨移植無(wú)需考慮組織相容性及免疫排斥反應(yīng)，但供骨來(lái)源有限；異體骨來(lái)源廣泛，但存在免疫排斥和感染血源性病毒等風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要研究和開(kāi)發(fā)新型人工骨修復(fù)材料以滿(mǎn)足臨床需求。

骨組織的主要成分是膠原和羥基磷灰石?；诜律嵌?，采用與天然骨成分相似的有機(jī)和無(wú)機(jī)物制備骨修復(fù)材料已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。生物活性玻璃作為典型的硅酸鹽材料，具有良好的生物相容性、骨引導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，在骨缺損修復(fù)具有廣泛的應(yīng)用。明膠是膠原部分水解得到的產(chǎn)物，生物相容性良好，同時(shí)鏈上帶負(fù)電的羧基基團(tuán)可作為成核位點(diǎn)，控制和誘導(dǎo)羥基磷灰石形成。生物活性玻璃/明膠復(fù)合材料在組成上與人骨組織類(lèi)似，并具有良好的生物相容性和誘導(dǎo)成骨作用等生物學(xué)特性，在一定程度上滿(mǎn)足骨修復(fù)材料的要求。

目前，制備生物活性玻璃/明膠復(fù)合材料的常用方法是將一定量的生物活性玻璃粉體加入至明膠溶液中，攪拌均勻后倒入模具中，冷凍干燥成型，隨后用交聯(lián)劑進(jìn)行化學(xué)處理，再進(jìn)行冷凍干燥，最后得到復(fù)合支架材料。然而，通過(guò)上述方法制備的復(fù)合骨修復(fù)材料存在以下問(wèn)題：（1）制備工藝復(fù)雜，需經(jīng)過(guò)成型、冷凍干燥和化學(xué)交聯(lián)等多個(gè)步驟；（2）支架成型后需要通過(guò)化學(xué)交聯(lián)提高穩(wěn)定性，但交聯(lián)劑（如戊二醛）容易殘留在支架中，造成細(xì)胞毒性；（3）復(fù)合支架含水率較低，不利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。

改性明膠是由明膠側(cè)鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)所得，在紫外光引發(fā)下發(fā)生自由基聚合反應(yīng)形成水凝膠，改善了明膠力學(xué)性能差和降解速率快等缺點(diǎn)。明膠水凝膠具有良好的生物相容性和優(yōu)異的加工性，同時(shí)與細(xì)胞外基質(zhì)具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞黏附、增殖和分化提供良好的微環(huán)境。有研究者通過(guò)在明膠水凝膠中添加無(wú)機(jī)納米粒子（納米金顆粒、二氧化硅和羥基磷灰石等），以提高復(fù)合水凝膠的生物活性和成骨作用。

本發(fā)明采用光聚合反應(yīng)原理制備生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠支架材料。該復(fù)合水凝膠具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)能力；生物活性玻璃均勻分散在三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，與改性明膠緊密結(jié)合，硅、鈣和磷等離子溶出產(chǎn)物可緩慢釋放；高含水率可保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的正常運(yùn)輸；制備過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)需使用化學(xué)交聯(lián)劑，在骨組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)和材料的不足，提供一種生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠及其制備方法，獲得具有良好生物活性和骨誘導(dǎo)能力的復(fù)合水凝膠，可用于非承重部位骨缺損的治療，實(shí)現(xiàn)骨組織的修復(fù)與再生。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

1）將改性明膠和光引發(fā)劑2-羥基-4’-（2-羥乙氧基）-2甲基苯丙酮（IRGACURE 2959）充分溶解于磷酸鹽緩沖溶液中，得到改性明膠預(yù)聚物溶液；

2）在改性明膠預(yù)聚物溶液中加入生物活性玻璃粉體，超聲分散和磁力攪拌，得到分散均勻的混合漿料；

3）將混合漿料倒入聚四氟乙烯模具中，在紫外光照射引發(fā)自由基聚合反應(yīng)，將反應(yīng)后的產(chǎn)物在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹以去除未反應(yīng)的單體和光引發(fā)劑，得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠。

進(jìn)一步地，步驟1）所述改性明膠的甲基丙烯酰胺基取代度為40%-80%。

進(jìn)一步地，步驟1）中改性明膠預(yù)聚物在改性明膠預(yù)聚物溶液中的濃度為7-15 w/v%，優(yōu)選為10 w/v%。

進(jìn)一步地，步驟1）所述的光引發(fā)劑在磷酸鹽緩沖溶液中的濃度為0.1-1 w/v%。

進(jìn)一步地，步驟2）所述的生物活性玻璃粉體為采用有機(jī)模板結(jié)合溶膠-凝膠法制備的微/納米球形粉體。

進(jìn)一步地，步驟2）所述超聲分散30min和磁力攪拌4 h。

進(jìn)一步地，步驟2）所述的生物活性玻璃粉體在混合漿料中的濃度為1-10 w/v%。

進(jìn)一步地，步驟3）所述紫外光的波長(zhǎng)為 254-400 nm，強(qiáng)度為 5-20 mW/cm² ，照射時(shí)間為 1-20 min。優(yōu)選波長(zhǎng)為365 nm，強(qiáng)度為 5m W/cm2。

由以上所述的制備方法得到的一種生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠。該生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠可應(yīng)用于非承重骨缺損部位的治療，促進(jìn)骨組織的修復(fù)與再生。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明選取生物活性玻璃和改性明膠兩種材料進(jìn)行復(fù)合，在紫外光照射下發(fā)生自由基聚合反應(yīng)形成復(fù)合水凝膠。該復(fù)合水凝膠具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)能力；合成材料來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉；制備方法簡(jiǎn)單方便，且無(wú)需使用化學(xué)交聯(lián)劑。

（2）本發(fā)明的復(fù)合水凝膠中生物活性玻璃均勻嵌入改性明膠水凝膠形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，與改性明膠通過(guò)物理方式（氫鍵）緊密結(jié)合，使硅、鈣和磷等離子緩慢釋放。且復(fù)合水凝膠含水率較高（80%以上），可保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運(yùn)輸。

（3）改性明膠作為良好的細(xì)胞載體，在室溫、短時(shí)間內(nèi)即可成膠，可聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和生長(zhǎng)因子等構(gòu)建功能化的骨組織工程。

（4）本發(fā)明的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠可應(yīng)用于骨缺損修復(fù)、藥物緩釋載體和骨組織工程等領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1a、圖1b是本發(fā)明實(shí)施例1所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖1c、圖1d是本發(fā)明實(shí)施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖1e、圖1f 是本發(fā)明實(shí)施例3所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠在不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的紅外圖譜；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1、2、3所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的含水率圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后的活死染色圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機(jī)模板結(jié)合溶膠-凝膠法制得，具體合成過(guò)程如下：先將40 g十二胺加入至250 ml去離子水和800 ml無(wú)水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入202 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入24 ml磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入137 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃燒結(jié)3 h ，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為40%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側(cè)鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)所得，具體合成過(guò)程如下：先將2 g明膠加入至20 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入0.25 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應(yīng)4 h；反應(yīng)完后轉(zhuǎn)至40 ℃恒溫水浴鍋中，加入40 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉(zhuǎn)移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應(yīng)的甲基丙烯酸酐和無(wú)機(jī)鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預(yù)凍，冷凍干燥后得到改性明膠（取代度為 40%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠具體合成過(guò)程如下：先將1 g改性明膠（取代度為40%）和0.01 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在 60℃恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入0.1 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h ，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm²的紫外光照射20 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠。所得復(fù)合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應(yīng)的單體和光引發(fā)劑。

實(shí)施例2

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機(jī)模板結(jié)合溶膠-凝膠法制得，具體合成過(guò)程如下：先將4 g十二胺加入至25 ml去離子水和80 ml無(wú)水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入20.2 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入2.4 ml 磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入13.7 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃燒結(jié)5 h，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為60%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側(cè)鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)所得，具體合成過(guò)程如下：先將20 g明膠加入至200 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入10 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應(yīng)4 h；反應(yīng)完后轉(zhuǎn)至40℃恒溫水浴鍋中，加入500 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉(zhuǎn)移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應(yīng)的甲基丙烯酸酐和無(wú)機(jī)鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預(yù)凍，冷凍干燥后得改性明膠（取代度為60%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠具體合成過(guò)程如下：先將1 g改性明膠（取代度為60%）和0.05 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃ 恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入0.5 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射10 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠。所得復(fù)合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應(yīng)的單體和光引發(fā)劑。

實(shí)施例3

（1）生物活性玻璃粉體的制備步驟：

生物活性玻璃粉體由有機(jī)模板結(jié)合溶膠-凝膠法制得，具體合成過(guò)程如下：先將8 g十二胺加入至50 ml去離子水和160 ml無(wú)水乙醇的混合溶液中，在40℃ 水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入40.4 ml正硅酸乙酯，攪拌30 min；加入4.8 ml磷酸三乙酯，攪拌30 min；加入27.4 g四水硝酸鈣；將得到的乳白色溶液繼續(xù)攪拌3 h；最后將玻璃溶膠離心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于馬弗爐650℃ 燒結(jié)3 h，即得生物活性玻璃粉體。

（2）改性明膠（取代度為80%）的制備步驟：

改性明膠由明膠側(cè)鏈的活性氨基與甲基丙烯酸酐反應(yīng)所得，具體合成過(guò)程如下：先將5 g明膠加入至50 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌，制成10%明膠溶液；待明膠完全溶解，加入5 ml甲基丙烯酸酐，繼續(xù)反應(yīng)4 h；反應(yīng)完后轉(zhuǎn)至40℃恒溫水浴鍋中，加入100 ml磷酸鹽緩沖溶液稀釋終止反應(yīng)，繼續(xù)攪拌30 min；隨后轉(zhuǎn)移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反應(yīng)的甲基丙烯酸酐和無(wú)機(jī)鹽；最后將溶液置于-80℃冰箱中預(yù)凍，冷凍干燥后得改性明膠（取代度為80%）。

（3）生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠具體合成過(guò)程如下：先將1 g改性明膠（取代度為80%）和0.1 g光引發(fā)劑IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸鹽緩沖溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中攪拌至完全溶解；隨后加入1 g生物活性玻璃粉體，超聲分散30 min，磁力攪拌4 h，使生物活性玻璃均勻分散在溶液中；最后將混合漿料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射1 min，得到生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠。所得復(fù)合水凝膠在磷酸鹽緩沖溶液中溶脹24 h以除去未反應(yīng)的單體和光引發(fā)劑。

對(duì)實(shí)施例1、2、3所得的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠進(jìn)行性能表征，所得掃描電鏡圖如圖1a、圖1b、圖1c、圖1d、圖1e、圖1f所示，三種生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠均呈現(xiàn)窩蜂狀的連通多孔結(jié)構(gòu)，孔徑范圍為200-500 μm，且生物活性玻璃顆粒均勻嵌入在復(fù)合水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)中。圖2為實(shí)施例2所得生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的紅外圖譜，其中a曲線為10%改性明膠的紅外譜圖，呈現(xiàn)出典型的明膠蛋白所特有的酰胺峰，其中包括在1702 cm^-1酰胺I帶的C=O 伸縮峰，在1540 cm^-1酰胺II帶的N-H伸縮振動(dòng)峰。b曲線為生物活性玻璃的紅外圖譜，1091，802和474 cm^-1處分別為生物活性玻璃中典型的Si-O-Si非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，Si-O的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰以及Si-O-Si的對(duì)稱(chēng)彎曲振動(dòng)峰。c曲線為復(fù)合水凝膠的紅外圖譜，同時(shí)出現(xiàn)生物活性玻璃和改性明膠的特征峰，可證明復(fù)合水凝膠中同時(shí)存在生物活性玻璃和改性明膠。其它實(shí)施例的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的紅外圖譜與圖2相似，均能證明復(fù)合水凝膠中同時(shí)存在生物活性玻璃和改性明膠。圖3顯示實(shí)施例1、2、3的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠均具有較高的含水率（80%以上），可保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的運(yùn)輸。圖4為小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)施例2的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠培養(yǎng)24 h的活死染色圖，可見(jiàn)細(xì)胞能在水凝膠表面黏附，呈梭形狀，具有較好的細(xì)胞活力。其它實(shí)施例的生物活性玻璃-改性明膠復(fù)合水凝膠的活死染色情況與實(shí)施例2相似，均可見(jiàn)細(xì)胞能在水凝膠表面黏附，呈梭形狀，具有較好的細(xì)胞活力。