本發(fā)明涉及一種中藥技術(shù)領(lǐng)域，且特別涉及一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

小兒病毒性心肌炎是小兒疾病中發(fā)病率較高的一種，是由多種病毒感染所致心肌損害引起的心肌局限性或彌漫性炎性病變。各年齡均可發(fā)病，尤以3歲以上的小兒多見，發(fā)病無季節(jié)性，輕重各異，病程長短不一。由于病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此，目前西醫(yī)尚無特效治療方法，臨床多采用心肌細(xì)胞營養(yǎng)劑、抗病毒藥物及免疫抑制劑等對癥治療。

在中醫(yī)領(lǐng)域，本病屬胸痹、心悸、怔忡、溫病等范疇，中醫(yī)認(rèn)為心氣虛則鼓動無力，血脈瘀阻；心陰虛則心脈失養(yǎng)而致病，臨床上以“虛、滯、瘀”的表現(xiàn)多見。正氣不足、邪毒侵心是導(dǎo)致病毒性心肌炎發(fā)生的重要因素。而氣陰兩虛是本病發(fā)生的內(nèi)在因素。外感邪毒則是誘發(fā)或加重本病的外在因素。氣陰兩虛極易感受溫?zé)嵝岸荆岸緝?nèi)侵勢必耗傷氣陰。然而在中醫(yī)治療中，多數(shù)組方用藥復(fù)雜，以“毒瘀互結(jié)，氣陰兩虛”為重點(diǎn)的藥物較少，同時此類藥物一般為湯劑，不便于兒童服用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，此中藥組合物具有解毒活血、益氣養(yǎng)陰的作用，特別適用毒瘀互結(jié)，氣陰兩虛證的患者兒童。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，該制備方法簡單易行，利于工業(yè)化生產(chǎn)，制備出來的中藥組合物便于小兒服用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：黃芪15～50份，麥冬10～30份，板藍(lán)根10～30份，丹參10～30份，及甘草5～10份。

本發(fā)明提出一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小時，得到提取液，將提取液濃縮至在60℃時相對密度為1.05～1.20的濃縮液，將濃縮液與藥用輔料混合。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法的有益效果是：該中藥組合物遵循中醫(yī)學(xué)的配伍規(guī)律及“君臣佐使”的組方規(guī)律。以“解毒活血、益氣養(yǎng)陰”為主。對于治療毒瘀互結(jié)，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。其中黃芪、麥冬為君，黃芪補(bǔ)心氣之虧虛，麥冬養(yǎng)陰生津，臣以丹參活血化瘀，佐以板藍(lán)根清熱解毒，使以甘草調(diào)和諸藥，補(bǔ)脾益氣復(fù)脈。其次，該組合物的藥味少，藥性強(qiáng)，且藥效專，治療小兒病毒性心肌炎具有針對性。

該中藥組合物的制備方法，主要以煎煮和濃縮為主，簡單易行，可操作性強(qiáng)。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實(shí)施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物及其制備方法進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明實(shí)施例提供的一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：黃芪15～50份，麥冬10～30份，板藍(lán)根10～30份，丹參10～30份，及甘草5～10份。

優(yōu)選地，按重量份數(shù)計，黃芪為30份，麥冬為20份，板藍(lán)根為20份，丹參為20份，及甘草為10份。

該中藥組合物以“解毒活血、益氣養(yǎng)陰”為主。對于治療毒瘀互結(jié)，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。其中黃芪、麥冬為君，黃芪補(bǔ)心氣之虧虛，麥冬養(yǎng)陰生津，臣以丹參活血化瘀，佐以板藍(lán)根清熱解毒，使以甘草調(diào)和諸藥，補(bǔ)脾益氣復(fù)脈。

具體地，小兒病毒性心肌炎是由病毒感染引起的以局限性或彌漫性心肌炎性病變?yōu)橹鞯募膊?，其親心性的特點(diǎn)導(dǎo)致了心肌炎的發(fā)生，體現(xiàn)了其“損傷臟腑功能”之特性。與中醫(yī)毒邪“內(nèi)損、暴烈、頑固、危重”之特性相切合。早期毒傷心絡(luò)，傷心體損心用，致氣陰兩虛，氣陰兩虛為本，邪毒侵襲為標(biāo)，此期標(biāo)實(shí)為主；中期由毒致瘀，由瘀化毒，加重氣陰虧虛，以瘀為主，虛實(shí)標(biāo)本夾雜；至后期病情遷延氣陰兩虛明顯，由虛生瘀，瘀久生毒，毒瘀互結(jié)，且反復(fù)感受外毒，本虛為主，兼夾毒瘀。因此選用補(bǔ)氣與補(bǔ)陰藥黃芪、麥冬為君藥，黃芪補(bǔ)心氣之虧虛，麥冬養(yǎng)陰生津。臣以丹參活血化瘀。再次，輔以清熱解毒藥板藍(lán)根祛毒邪。最后使以甘草調(diào)和諸藥，補(bǔ)脾益氣復(fù)脈。

優(yōu)選地，黃芪選用炙黃芪，其中炙黃芪有潤燥、補(bǔ)中益氣的功效。甘草選用炙甘草。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，按重量份數(shù)計，原料還包括：黨參10～50份，山藥10～50份，及葛根10～50份。

黨參補(bǔ)脾肺氣，補(bǔ)血，生津。常用于氣虛不能生血，血虛無以化氣。與黃芪配伍，可增強(qiáng)補(bǔ)氣補(bǔ)血的效果。山藥，既補(bǔ)氣，又養(yǎng)陰，與黃芪、麥冬配伍，增強(qiáng)臣藥的作用。葛根，解肌退熱，生津止渴。

進(jìn)一步地，在本發(fā)明較佳實(shí)施例中，原料還包括太子參為10～30份，西洋參為5～20份，與白術(shù)為10～30份中的至少一種。太子參、西洋參與白術(shù)皆為補(bǔ)氣藥，選用三者中的至少一種，可以增強(qiáng)組方補(bǔ)氣的作用。其中，太子參能生津潤肺，西洋參能清熱生津，白術(shù)能燥濕利水，增強(qiáng)組合物“清毒、散毒、通毒”的能力。

優(yōu)選地，按重量份數(shù)計，原料包括黃芪50份，麥冬20份，板藍(lán)根15份，丹參20份，甘草10份，黨參30份，太子參30份，葛根30份，山藥20份，西洋參10份，及白術(shù)30份。

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物的制備方法，其包括：用原料7～9倍重量的水煎煮原料1～3次，每次1～1.5小時，得到提取液，將提取液濃縮至在60℃時相對密度為1.05～1.20的濃縮液，即濃縮液的相對密度為1.05～1.20(60℃)，優(yōu)選地，為了提高提取率，得到更多的藥物有效活性成分，濃縮提取液的步驟進(jìn)行兩次，將提取液第一次濃縮至在60℃時相對密度為1.06～1.12的濃縮液，第二次濃縮是在第一次濃縮得到的濃縮液(即在60℃時相對密度為1.06～1.12)中加入第一次濃縮得到的濃縮液1～3倍量的乙醇，靜置20～24h，過濾，得到乙醇與濾液。

其中濾液的處理方式有兩種，一種是將濾液濃縮至在60℃時相對密度為1.10～1.12的濃縮液，將進(jìn)行過一次或進(jìn)行過兩次的濃縮液干燥、與藥用輔料混合，制成中藥組合物的丸劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑。另一種是將濾液與藥用輔料混合得到中藥組合物的口服液。在乙醇中靜置后，藥用活性成分會繼續(xù)析出。其中，藥用輔料可選用矯味劑、粘合劑、潤滑劑與崩解劑中的任意一種或幾種。進(jìn)一步地，調(diào)節(jié)口服液的pH值至4.0～6.0，得到中藥組合物的合劑。該制備方法操作簡單，流程清楚，同時可制備出多種劑型，供患者選用。

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬20份，板藍(lán)根20份，丹參20份，及炙甘草10份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.10(60℃)的濃縮液，濃縮液噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度100℃)得到干浸膏粉，干浸膏粉中加入適量蔗糖，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝袋，即得中藥組合物的顆粒劑。

實(shí)施例2

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬15份，板藍(lán)根15份，丹參20份，及炙甘草8份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮至相對密度為1.06(60℃)的濃縮液，之后濃縮液中加入等量乙醇攪拌均勻，靜置24小時，濾過，回收乙醇至無醇味，在濾液中加入單糖漿、山梨酸鉀，搖勻，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的口服液。

實(shí)施例3

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪40份，麥冬15份，板藍(lán)根15份，丹參20份，炙甘草8份，黨參20份，太子參20份，葛根24份，及山藥30份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液進(jìn)行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，接著第一濃縮液中加入3倍量乙醇攪勻，靜置24小時，濾過，回收乙醇并進(jìn)行第二次濃縮，得到相對密度為1.10(60℃)的第二濃縮液，第二濃縮液噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度100℃)后得到干浸膏粉，干浸膏粉加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，裝入2號膠囊，即得中藥組合物的膠囊劑。

實(shí)施例4

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：黃芪50份，麥冬20份，板藍(lán)根15份，丹參20份，甘草10份，黨參30份，太子參30份，葛根30份，山藥20份，西洋參10份，及白術(shù)30份。

該中藥組合物的制備方法為：先將上述西洋參、太子參、丹參、山藥混合，粉碎成120目的粉末，備用；用水煎煮黃芪、麥冬、板藍(lán)根、甘草、黨參、葛根與白術(shù)3次，每次加黃芪、麥冬、板藍(lán)根、甘草、黨參、葛根與白術(shù)總重量9倍的水煎煮1.0小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.20(60℃)的濃縮液，加入上述備用粉末及適量煉蜜，混合均勻，制丸條，分粒，搓圓，即得中藥組合物的丸劑。

實(shí)施例5

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：黃芪30份，麥冬20份，板藍(lán)根20份，丹參20份，甘草8份，黨參30份，葛根30份，及山藥20份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液進(jìn)行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，第一濃縮液中加入3倍量乙醇攪勻，靜置20小時，濾過，濾液回收乙醇并進(jìn)行第二次濃縮，得到相對密度為1.12(60℃)的第二濃縮液，將第二濃縮液噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度100℃)后加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，加入15份硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得中藥組合物的片劑。

實(shí)施例6

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪30份，麥冬20份，板藍(lán)根20份，丹參20份，及炙甘草10份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.05(60℃)的濃縮液，靜置，濾過，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸鉀，攪勻，用濃度為10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為4.0，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的合劑。

實(shí)施例7

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪15份，麥冬10份，板藍(lán)根10份，丹參10份，炙甘草5份，黨參10份，葛根10份，山藥10份，及西洋參5份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料2次，每次加原料7倍重量的水，第一次1.5h，第二次1h，濾過，收集提取液，將提取液進(jìn)行第一次濃縮，得到相對密度為1.07(60℃)的第一濃縮液，接著第一濃縮液中加入2倍量乙醇攪勻，靜置22小時，濾過，回收乙醇并進(jìn)行第二次濃縮，得到相對密度為1.11(60℃)的第二濃縮液，將第二濃縮液噴霧干燥(進(jìn)風(fēng)溫度180℃，出風(fēng)溫度100℃)，加入適量微晶纖維素，以乙醇做粘合劑，制粒，干燥，整粒，加入15g硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得中藥組合物的片劑。

實(shí)施例8

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：炙黃芪50份，麥冬30份，板藍(lán)根30份，丹參30份，炙甘草10份，黨參50份，葛根50份，山藥50份，西洋參20份，及白術(shù)30份。

該中藥組合物的制備方法為：用水煎煮上述原料3次，每次加原料8倍重量的水煎煮1.5小時，濾過，收集提取液，將提取液濃縮成相對密度為1.05(60℃)的濃縮液，靜置，濾過，加入5份阿司帕坦，10份山梨酸鉀，攪勻，用濃度為10％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，濾過，灌裝，滅菌，即得中藥組合物的合劑。

實(shí)施例9

一種治療小兒病毒性心肌炎的中藥組合物，主要由原料制成，按重量份數(shù)計，原料包括：黃芪20份，麥冬18份，板藍(lán)根12份，丹參18份，甘草7份，黨參15份，太子參10份，葛根15份，山藥15份，及白術(shù)10份。

該中藥組合物的制備方法為：用原料8倍重量的水煎煮上述原料3次，第一次1小時，第二次40min，第三次20min，合并濾液，得到中藥組合物的湯劑。

對比例1

玉丹榮心丸，由玉竹、炙甘草、五味子、丹參、降香、山楂、蓼大青葉、苦參組成，由上海玉丹藥業(yè)廠生產(chǎn)，1.5g/丸，36丸/盒。國藥準(zhǔn)字：Z10970095。

試驗例一 中藥組合物對EAM模型大鼠治療作用的觀察

1材料與方法

1.1實(shí)驗動物

雄性健康SPF級Lewis大鼠60只，6～7周齡，體重180～210g，購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2實(shí)驗材料

1.2.1實(shí)驗用藥

中藥組合物，根據(jù)實(shí)施例6制成，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，100ml/瓶，1ml含生藥1g；

玉丹榮心丸，由上海玉丹藥業(yè)廠生產(chǎn)，1.5g/丸，36丸/盒。國藥準(zhǔn)字：Z10970095。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1抗原制備

無菌條件下，用濃度為0.01mmol/L的PBS緩沖液將豬心肌肌球蛋白先稀釋為l0mg/ml濃度的溶液。后用無菌的兩支玻璃注射器分別抽取等體積的上述稀釋溶液及完全弗氏佐劑(含有結(jié)核分枝桿菌10mg/ml)。再取一段經(jīng)滅菌的塑料管連接兩支玻璃注射器，使注射器中的兩種溶液充分混合成油包水乳濁液?；旌铣晒Φ臉?biāo)準(zhǔn)：取1杯冰水，將1滴經(jīng)混合后的豬心肌肌球蛋白乳濁液滴入，如呈球形并完全不分散即為混合成功。

1.3.2造模及分組

60只SPF級雄性Lewis大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為2組：正常對照組10只，模型組50只。將50只模型組大鼠造模，方法如下：用豬心肌肌球蛋白和弗氏完全佐劑的混合液0.2ml/只(合計豬心肌肌球蛋白2mg/只)，于實(shí)驗第1天、第8天雙后肢足墊區(qū)皮下注射，造模成功后將50只大鼠隨機(jī)分成5組：EAM模型組，中藥組合物大、中、小劑量組，玉丹榮心丸組，每組10只。給正常對照組大鼠于實(shí)驗第1天、第8天雙后肢足墊區(qū)皮下注射PBS緩沖液0.2ml/只；中藥組合物大、中、小劑量組及玉丹榮心丸組大鼠，于造模后半小時開始給藥。

1.3.3藥物制備及給藥

將中藥組合物臨用前進(jìn)行稀釋，大劑量每毫升相當(dāng)于生藥0.975g，中劑量每毫升相當(dāng)于生藥0.63g，小劑量每毫升相當(dāng)于生藥0.325g。玉丹榮心丸臨用時配成每毫升0.25g混懸溶液，4℃冰箱保存。中藥組合物大劑量組、中劑量組、小劑量組每日分別給予中藥組合物大劑量、中劑量、小劑量1ml/100g；玉丹榮心丸組每日給玉丹榮心丸混懸溶液1ml/100g；正常對照組和EAM模型組每日均給予蒸餾水1ml/100g，均采用灌胃法給藥，日一次，連續(xù)給藥21天。

1.3.4一般情況觀察

觀察大鼠食欲、精神、活動情況，體重變化情況。

1.3.5標(biāo)本采集及保存

免疫后21天，各組大鼠鎖骨下靜脈取血1～2ml，3000r/min離心后收集血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫桓骨蛔⑸湮彀捅韧租c20mg/kg，麻醉后處死，立刻無菌取心臟，冰鹽水沖洗后放入10％中性福爾馬林固定，常溫保存，用于HE染色和免疫組化檢測。

1.3.6 ELISA法檢測血清cTnT和BNP的表達(dá)

本研究應(yīng)用上?；鶢栴D生物科技有限公司檢測試劑盒，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。計算：用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.3.7組織標(biāo)本制備

將心肌組織沿長軸剖開，每隔1cm取材，大小約1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福爾馬林固定4～6h，水洗20～30min，常規(guī)按以下步驟脫水、透明、浸蠟：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蠟(60℃)30min、浸蠟(60℃)75min、浸蠟(60℃)75min。常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。用于后續(xù)的HE染色和免疫組化檢測。

1.3.8蘇木精-伊紅(HE)染色

1.3.8.1鏡檢觀察：在每張切片中隨機(jī)選取5個高倍鏡(×100倍)視野，計算每個視野中炎性細(xì)胞浸潤及壞死的區(qū)域面積占整個視野面積的百分比。無病變的記為0分，病變面積小于25％的記為1分，病變面積在25％～50％間記為2分，病變面積在50％～75％間記為3分，病變面積大于75％的記為4分。

1.3.9統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗結(jié)果用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，大鼠體重采用重復(fù)測量資料的方差分析，其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2實(shí)驗結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察

各組大鼠觀察期間無死亡現(xiàn)象。正常對照組大鼠均健康生長至免疫第21天。造模大鼠于免疫第7天開始出現(xiàn)進(jìn)食及活動減少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型組大鼠上述表現(xiàn)尤為明顯。

2.2體重變化

各組大鼠免疫前體重沒有顯著差別(P＞0.05)，EAM模型組大鼠體重自免疫第7天開始逐漸減輕，至免疫第21天達(dá)最低。中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組大鼠體重于免疫第7天略有下降，后逐漸升高，增高顯著優(yōu)于中藥組合物小劑量組大鼠(P＜0.01)。

2.3各組大鼠心肌組織病理變化

HE染色結(jié)果顯示正常對照組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無變性壞死，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚，間質(zhì)內(nèi)未見炎細(xì)胞浸潤和纖維組織增生；EAM模型組：心肌細(xì)胞大部分被破壞，變性壞死明顯，部分心肌細(xì)胞溶解消失，大量急慢性炎細(xì)胞彌漫浸潤，邊緣可見少量殘存的心肌細(xì)胞，間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生，顯示心肌炎大鼠模型造模成功。藥物干預(yù)后，中藥組合物小劑量組心肌間存在中等量中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤，心肌結(jié)構(gòu)破壞明顯，可見少量成纖維母細(xì)胞增生；中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組均顯示心肌結(jié)構(gòu)基本存在，僅見少量變性壞死，心肌間可見少量中性粒細(xì)胞浸潤，未見明顯成纖維細(xì)胞增生；中藥組合物大劑量組心肌結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞無明顯變性壞死，心肌間有少量不等的灶性炎性細(xì)胞聚集區(qū)。

病理積分比較結(jié)果顯示EAM模型組心肌病理積分高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。中藥組合物中、大劑量組與玉丹榮心丸組心肌病理積分均低于EAM模型組和中藥組合物小劑量組(P＜0.05)，三組之間無顯著差異(P＞0.05)，中藥組合物小劑量組與EAM模型組病理積分無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，見表1。

表1各組病理積分比較表

注：與正常對照組比較，^★P＜0.05；與EAM模型組比較，^△△P＞0.05，^△P＜0.01；與小劑量組比較，^◇P＜0.05；與中劑量組比較^▲P＞0.05；與大劑量組比較^☆P＞0.05。

2.4各組大鼠血清cTnT、BNP表達(dá)

ELISA檢測結(jié)果顯示，EAM模型組大鼠血清cTnT、BNP水平顯著高于正常對照組(P＜0.01)；中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組水平均顯著低于EAM模型組(P＜0.01)、中藥組合物小劑量組(P＜0.01)，三組間無顯著差異。EAM模型組、中藥組合物小劑量組無差異(P＞0.05)，見表2、3。

表2各組大鼠血清cTnT表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表3各組大鼠血清BNP表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

綜合上述結(jié)果可見，中藥組合物大、中劑量干預(yù)后，能顯著改善EAM模型大鼠的體重下降、減輕心肌細(xì)胞的壞死和炎性浸潤、降低反映心肌損傷的cTnT和心衰定量標(biāo)志物BNP的水平，且兩個劑量組之間無顯著性差異，提示該藥物中劑量有較好地對抗EAM模型大鼠心肌損傷的效果。

試驗例二 中藥組合物對EAM模型大鼠Th細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的影響

1材料與方法

1.1實(shí)驗樣本

本實(shí)驗的檢測樣本為試驗例一制備的血清。

1.2主要試劑

ELISA試劑盒均由上海基爾頓生物科技有限公司提供，γ-IFN(批號：RA20594)，IL-2(批號：RA20132)，IL-4(批號：RA20088)，IL-6(批號：RA20069)。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1 ELISA法檢測血清γ-IFN、IL-2、IL-4、IL-6水平。

本研究應(yīng)用上?；鶢栴D生物科技有限公司檢測試劑盒，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

2實(shí)驗結(jié)果

2.1各組大鼠血清γ-IFN和IL-2的表達(dá)

EAM模型組血清γ-IFN、IL-2的表達(dá)顯著高于正常對照組(P＜0.01)；中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組血清γ-IFN、IL-2水平均顯著低于EAM模型組(P＜0.01)，三組間未見顯著差異，中藥組合物小劑量組血清γ-IFN、IL-2表達(dá)與EAM模型組比較無差異(P＞0.05)，見表4、5。

表4各組大鼠血清γ-IFN表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表5各組大鼠血清IL-2表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＞0.05；與大劑量組比較^○P＞0.05。

2.2各組大鼠血清IL-4和IL-6的表達(dá)

EAM模型組血清IL-4、IL-6水平顯著低于正常對照組(P＜0.01)。中藥組合物中大劑量組、玉丹榮心丸組分別與EAM模型組相比較，IL-4、IL-6水平均有不同程度的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。其中中藥組合物大劑量組和玉丹榮心丸組升高幅度明顯，二者之間無顯著性差異(P＞0.05)；二者分別與中劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。中藥組合物小劑量組與EAM模型組比較無明顯差異(P＞0.05)，見表6、7。

表6各組大鼠血清IL-4表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＜0.01；與大劑量組比較^○P＞0.05。

表7各組大鼠血清IL-6表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲▲P＞0.05，^▲P＜0.01；與小劑量組比較^☆P＜0.01；與中劑量組比較^★P＜0.01；與大劑量組比較^○P＞0.05

綜上可見，中藥組合物大中劑量組能降低Th1細(xì)胞分泌的γ-IFN和IL-2，提高Th2細(xì)胞分泌的IL-4和IL-6水平，調(diào)節(jié)EAM模型大鼠出現(xiàn)的Th1/Th2失衡。對于Th1細(xì)胞的影響與玉丹榮心丸比較等效，且中藥組合物大、中劑量組之間無顯著差異。

試驗例三 中藥組合物對EAM模型大鼠IL-2/STAT5通路的影響

1材料與方法

1.1實(shí)驗樣本

本實(shí)驗的檢測樣本為試驗例一制備的石蠟切片。

1.2主要試劑

第一抗體免疫組化試劑盒均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，IL-2(批號：BS-4586R)，IL-2R(批號：BS-2545R)，STAT5(批號：BS-1142R)；第二抗體SP-9001試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號：SP-9001；DAB顯色試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號：ZLI-9032。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1免疫組化法檢測大鼠心肌組織IL-2、IL-2R和STAT5表達(dá)

本研究應(yīng)用北京博奧森生物技術(shù)有限公司檢測試劑盒，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

1.2.1.2圖象分析：

參考R.A.S.的IHS法，在每張切片中隨機(jī)選取5個高倍鏡(400×)視野，計算陽性細(xì)胞數(shù)百分比(A％)，陽性細(xì)胞數(shù)百分比在1％～10％的為1分，11％～50％為2分，51％～80％為3分，81％～100％為4分，再看陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度(B)，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，HIS為A％與B的乘積，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性。用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus管理系統(tǒng)進(jìn)行分析、讀取數(shù)據(jù)、最后存盤。

2實(shí)驗結(jié)果

2.1大鼠心肌組織IL-2、IL-2R的表達(dá)

免疫組化顯示EAM模型組大鼠、中藥組合物中劑量組、玉丹榮心丸組大鼠心肌組織IL-2、IL-2R表達(dá)增強(qiáng)，顯著區(qū)別于正常對照組大鼠(P＜0.01)，中藥組合物中劑量、玉丹榮心丸可抑制IL-2、IL-2R表達(dá)，與EAM模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，但兩組間無明顯差異(P＞0.05)，見表8、9。

表8大鼠心肌組織IL-2表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

表9大鼠心肌組織IL-2R表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

2.2大鼠心肌組織STAT5的表達(dá)

免疫組化顯示EAM模型組大鼠心肌組織STAT5蛋白表達(dá)顯著高于正常對照組大鼠(^△P＜0.01)，提示自身免疫性心肌炎大鼠有JAKs/STAT5通路的激活，中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸組大鼠心肌組織STAT5蛋白表達(dá)明顯低于EAM模型組(^▲P＜0.01)，且兩者無明顯差異(^★P＞0.05)，見表10。

表10大鼠心肌組織STAT5表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.01；與中劑量組比較^☆P＞0.05。

綜上可知，EAM模型大鼠存在IL-2/STAT5通路的激活，實(shí)驗證實(shí)中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸可以抑制IL-2/STAT5通路的激活，且兩者等效。

試驗例四 中藥組合物對EAM模型大鼠心肌纖維化的影響

1材料與方法

1.1實(shí)驗動物及飼養(yǎng)條件

雄性健康SPF級Lewis大鼠40只，6～7周齡，體重180～210g，購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)環(huán)境和條件同試驗例一1.2。

1.2主要試劑和儀器

試劑：豬心肌肌球蛋白(美國Sigma公司)，貨號：M0531；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)，貨號：F588；Masson試劑盒(北京索寶來科技有限公司)，貨號：G1340；MMP-9一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，貨號：BS-4593R；TIMP-1一抗免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，貨號：BS-4600R；第二抗體SP-9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，貨號：SP-9001；DAB顯色試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，貨號：ZLI-9032。

1.3實(shí)驗方法

1.3.1造模及分組

抗原制備方法同試驗例一，將40只SPF級雄性Lewis大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為2組：正常對照組10只，模型組30只，將模型組大鼠按試驗例一造模方法造模，成功后隨機(jī)分成3組，即EAM模型組、中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組，每組10只。正常對照組處理同試驗例一。

1.3.2藥物制備及給藥

藥物制備同試驗例一，中藥組合物中劑量組每日給予中藥組合物1ml/100g；玉丹榮心丸組每日給玉丹榮心丸混懸溶液1ml/100g；正常對照組和EAM模型組每日均給予蒸餾水1ml/100g，均采用灌胃法給藥，日一次，連續(xù)給藥56天。

1.3.3一般情況觀察觀察大鼠食欲、精神、活動情況情況。

1.3.4標(biāo)本制備

免疫第56天，各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉20mg/kg，麻醉后處死，立刻無菌取心臟，將心肌組織沿長軸剖開，每隔1cm取材，大小約1cm×1cm×0.3cm，置于10％中性福爾馬林固定4～6h，水洗20～30min，常規(guī)按以下步驟脫水、透明、浸蠟：70％乙醇(35℃)90min、80％乙醇(35℃)90min、90％乙醇(35℃)90min、95％乙醇(35℃)90min、100％乙醇Ⅰ(35℃)60min、100％乙醇Ⅱ(35℃)60min、二甲苯Ⅰ透明20min、二甲苯Ⅱ透明35min、二甲苯Ⅲ透明35min、浸蠟(60℃)30min、浸蠟(60℃)75min、浸蠟(60℃)75min。常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。用于后續(xù)的HE染色、Masson染色和免疫組化檢測。

1.3.5HE染色步驟同試驗例一。

1.3.6大鼠心肌組織Masson染色本研究采用北京索寶來科技有限公司試劑盒，按照說明書操作。

1.3.7免疫組化法測免疫心肌組織MMP-9/TIMP–1表達(dá)實(shí)驗步驟同試驗例三。

2實(shí)驗結(jié)果

2.1一般狀態(tài)觀察

正常對照組大鼠均健康生長至免疫第56天，EAM模型組大鼠于免疫第28天死亡1只，中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組大鼠至免疫第56天無死亡。造模大鼠于免疫第7天開始出現(xiàn)進(jìn)食及活動減少、互相撕咬、毛色晦暗、呼吸急促。至免疫第21天，EAM模型組大鼠上述表現(xiàn)尤為明顯。

2.2各組大鼠心肌組織變化

HE染色可見正常對照組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，未見壞死、淋巴細(xì)胞浸潤和纖維化改變；EAM模型組：部分心肌細(xì)胞變性壞死，間質(zhì)顯著水腫，多量炎細(xì)胞浸潤，并有纖維細(xì)胞增生和纖維化形成；中藥組合物中劑量組和玉丹榮心丸組變化相似，心肌細(xì)胞變性壞死輕度，均在心肌細(xì)胞間有小灶性炎性細(xì)胞浸潤，纖維化不明顯。

中藥組合物中劑量組與玉丹榮心丸組心肌病理積分均低于EAM模型組(P＜0.05)，兩組之間無明顯差異(P＞0.05)，見表11。

表11各組病理積分比較表

注：與正常對照組比較，^★P＜0.05；與EAM模型組比較，^△P＜0.05；與中劑量組比較^▲P＞0.05。

Masson染色顯示EAM模型組大鼠發(fā)生彌漫性的心肌纖維化，中藥組合物中劑量組心肌有少量灶性纖維化，玉丹榮心丸組比中藥組合物中劑量組心肌成纖維細(xì)胞明顯增多。

2.3大鼠心肌組織MMP–9、TIMP–1的表達(dá)

免疫組化顯示EAM模型組大鼠心肌組織MMP–9表達(dá)較正常對照組大鼠顯著降低，TIMP–1的表達(dá)較正常對照組大鼠明顯升高，提示自身免疫性心肌炎心肌纖維化的發(fā)生是通過影響了MMP–9/TIMP–1的平衡而發(fā)生的。中藥組合物中劑量及玉丹榮心丸可以上調(diào)MMP–9的表達(dá)，下調(diào)TIMP–1的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)MMP–9/TIMP–1的比例，促使失衡趨于平衡，抑制了心肌纖維化，且中藥組合物中劑量的作用明顯優(yōu)于玉丹榮心丸(P＜0.01)，見表12、13。

表12大鼠心肌組織MMP–9的表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＜0.01。

表13大鼠心肌組織TIMP–1的表達(dá)

注：與正常對照組比較，^△P＜0.01；與EAM模型組比較，^▲P＜0.05；與中劑量組比較^☆P＜0.01。

上述實(shí)驗結(jié)果可見中藥組合物對于免疫56天的EAM模型大鼠有抗心肌纖維化作用，能上調(diào)心肌組織MMP–9的表達(dá)，下調(diào)其TIMP–1的表達(dá)，且效果優(yōu)于玉丹榮心丸。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例提供的中藥組合物以“解毒活血、益氣養(yǎng)陰”為主。對于治療毒瘀互結(jié)，氣陰兩虛證的患者兒童有顯著療效。從現(xiàn)代藥理來講，綜合上述試驗例，該中藥組合物能顯著改善免疫21天實(shí)驗性自身免疫性心肌炎模型大鼠的體重下降、減輕心肌細(xì)胞的壞死和炎性浸潤、降低反映心肌損傷的心肌肌鈣蛋白T和心衰定量標(biāo)志物腦鈉素的水平，降低血清γ-干擾素、白介素-2水平，升高白介素-4、白介素-6水平，下調(diào)心肌組織白介素-2、白介素-2受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子5的表達(dá)；對于免疫56天的實(shí)驗性自身免疫性心肌炎模型大鼠有抗纖維化作用，上調(diào)心肌組織基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)，下調(diào)其抑制因子1的表達(dá)。因此該中藥組合物治療小兒病毒性心肌炎具有針對性。該中藥組合物的制備方法簡單易行，可操作性強(qiáng)。

以上所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本發(fā)明的實(shí)施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。