本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

疫苗是一種主要由蛋白、多糖或核酸等成分基于傳統(tǒng)方法或基因工程等生物技術(shù)加工而成的生物制品，用于人類疾病的預(yù)防和治療。根據(jù)制備疫苗的技術(shù)和疫苗成分，疫苗分為傳統(tǒng)疫苗和新型疫苗或高技術(shù)疫苗。傳統(tǒng)疫苗包括滅活、減毒活疫苗和從微生物及其衍生物分離提取的亞單位疫苗，如蛋白疫苗和多糖疫苗。新型疫苗包括基因工程亞單位疫苗、重組載體活疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、遺傳重配疫苗及合成肽疫苗。疫苗的最終目的是促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生長期、有效的抗病原體感染的能力，然而當(dāng)前的眾多疫苗其免疫效力差強(qiáng)人意，因此需要佐劑增強(qiáng)其體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

納米材料作為一種新型佐劑，能夠模擬大多數(shù)生物活性物質(zhì)如病毒，細(xì)菌及其它病原體等的天然球形結(jié)構(gòu)，在高效包載抗原及免疫增強(qiáng)劑，增強(qiáng)抗原穩(wěn)定性，促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）對抗原的攝取與加工，調(diào)控抗原在細(xì)胞內(nèi)的遞送，促進(jìn)抗原的交叉呈遞，引起更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)等方面具有重要的作用。因此，基于納米生物材料的疫苗佐劑將成為突破傳統(tǒng)疫苗瓶頸的有力手段，促進(jìn)重大疾病相關(guān)的疫苗研制與免疫治療的發(fā)展與進(jìn)步。然而，常規(guī)的納米佐劑仍然存在免疫原性弱、抗原負(fù)載率低、生物安全性不明確、納米佐劑的物理化學(xué)性質(zhì)與疫苗免疫應(yīng)答之間的關(guān)系不明確等問題。

中國專利CN201410519465.8公開了一種陽離子聚合物納米免疫佐劑的制備方法，引入帶正電核的聚乙烯亞胺（分子量為2000 g/mol），利用疏水相互作用形成mPEG-PCL-PEI三嵌段聚合物納米體系。關(guān)于表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種表面胍基修飾的納米佐劑材料及其制備方法與應(yīng)用。該納米佐劑可以負(fù)載各類蛋白、多肽或核酸抗原。本發(fā)明具有免疫原性強(qiáng)、抗原負(fù)載率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、體內(nèi)外免疫應(yīng)答強(qiáng)等優(yōu)點，可用于免疫疫苗的制備。

本發(fā)明提供的一種表面胍基修飾的納米佐劑材料（含有胍基的共聚物）為:

聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯），其中ε-CL (ε-己內(nèi)酯)與BMPCL (γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內(nèi)酯)的聚合度范圍分別為30~35和3~3.5，胍基-乙基-甲基丙烯酸酯的聚合度為3~105。

所述共聚物為三嵌段共聚物，主鏈結(jié)構(gòu)為聚乙二醇與聚己內(nèi)酯嵌段共聚物，聚己內(nèi)酯側(cè)鏈含有胍基。

本發(fā)明的納米佐劑材料的制備方法包括以下步驟：

1)將干燥的聚乙二醇單甲醚（mPEG）加入Schlenk管中，稱取定量的ε-己內(nèi)酯（ε-CL）、γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內(nèi)酯（BMPCL）與辛酸亞錫加入反應(yīng)管中，在氮氣保護(hù)下于120-130℃油浴中，攪拌反應(yīng)10-20小時。待反應(yīng)冷卻后，加入二氯甲烷溶解產(chǎn)物，然后將溶液滴加至冷乙醚中，過濾，取沉淀，真空干燥，得到聚乙二醇與聚己內(nèi)酯嵌段共聚物大分子引發(fā)劑mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)。

2)將步驟1）制備的mPEG-P(CL-co-BMPCL)，單體2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯（tBMA），以及二聯(lián)吡啶溶于丁酮。將上述混合物反復(fù)進(jìn)行三次除氧后，加入溴化亞銅，在無氧和60℃條件下反應(yīng)24小時。在純水中反復(fù)透析提純，冷凍干燥獲得聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯-g-聚（2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b- PCL-g-PtBMA）。

3)將mPEG-b-PCL-g-PtBMA溶于三氟乙酸，室溫攪拌2-5小時。在真空條件下將三氟乙酸旋蒸掉，然后加入N,N-二甲基甲酰胺溶解產(chǎn)物，將所獲溶液滴加到冷乙醚中，過濾，取沉淀。用無水乙醚洗滌兩次，真空干燥獲得聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯-g-聚（氨基-乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b-PCL-g-PAEM）。

4)將PEG-b-PCL-g-PAEM溶于碳酸氫鈉水溶液中，加入S-乙基異硫脲氫溴酸鹽，室溫下攪拌反應(yīng)48-96小時。然后在純水中透析提純，冷凍干燥后獲得聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）（mPEG-b-PCL-g-PGEM，PECG）。

聚乙二醇單甲醚的分子量為2000 g/mol，聚己內(nèi)酯的分子量范圍為3420-3990 g/mol，聚（γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內(nèi)酯（BMPCL））的分子量范圍為834-973 g/mol，聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）的分子量范圍為516-18060 g/mol。

本發(fā)明所述的納米佐劑材料的制備步驟1）中，單體ε-CL與聚乙二醇單甲醚的摩爾比為30~35:1；BMPCL與ε-CL的摩爾比為1:10；辛酸亞錫的投料量為單體摩爾總數(shù)的0.05%。

本發(fā)明所述的納米佐劑材料的制備步驟2）中，單體tBMA與大分子引發(fā)劑mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)的摩爾比為3~105:1。

本發(fā)明所述的納米佐劑材料的制備步驟3）中，三氟乙酸的體積（mL）與mPEG-b-PCL-g-PtBMA的質(zhì)量（g）比例為5:1。

本發(fā)明所述的納米佐劑材料的制備步驟4）中，S-乙基異硫脲氫溴酸鹽與mPEG-b-PCL-g-PAEM的摩爾比為6~7:1。

本發(fā)明所述的表面胍基修飾的納米佐劑為聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯-g-聚（胍基-乙基-甲基丙烯酸酯）共聚物在水溶液中自組裝形成的納米顆粒。

本發(fā)明所述的表面胍基修飾的納米佐劑的應(yīng)用形式為納米佐劑與蛋白抗原、多肽抗原、核酸、免疫增強(qiáng)劑中任意一種或幾種的復(fù)合物溶液或凍干粉制劑。

本發(fā)明提供了所述的表面胍基修飾的納米佐劑具有積極的突出的有益效果：

本發(fā)明所述的納米佐劑能夠高效負(fù)載蛋白、多肽、核酸類抗原和免疫增強(qiáng)劑，所形成的抗原與納米佐劑的復(fù)合物具有長期的穩(wěn)定性。冷凍干燥后能夠均勻的分散于水、PBS、或氯化鈉溶液中。

本發(fā)明所述的納米佐劑可以有效的刺激小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（BMDC）成熟，促進(jìn)其表面CD80，CD86，CCR7等標(biāo)志物分子的表達(dá)。

本發(fā)明所述的納米佐劑，能夠促進(jìn)外源抗原被抗原遞呈細(xì)胞的交叉呈遞效果。

本發(fā)明所述的納米佐劑經(jīng)皮內(nèi)免疫接種可引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為淋巴結(jié)中的相關(guān)免疫細(xì)胞因子大量分泌。

本發(fā)明所述的納米佐劑的材料合成與納米疫苗制備方法簡單、操作簡便、重復(fù)性好，適合于大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明：

圖1：PECG共聚物的合成路線圖。

圖2：PECG共聚物核磁共振氫譜圖。

圖3：PECG納米佐劑的粒徑(a)與形貌圖(b)。

圖4：PECG自組裝納米粒促BMDCs成熟圖。

圖5：PECG納米佐劑促抗原交叉呈遞效果圖。

圖6：PECG納米佐劑體內(nèi)皮下免疫后淋巴結(jié)中細(xì)胞因子表達(dá)情況。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步詳細(xì)闡述本發(fā)明。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的通用設(shè)備、材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)的制備

將1.0 g無水聚乙二醇單甲醚（分子量2000 g/mol）、18.24 g ε-己內(nèi)酯、4.87 g γ-(2-溴-2-甲基丙酸酯)-ε-己內(nèi)酯，以及58 μL辛酸亞錫加入容器中，氮氣保護(hù)下，于130 ℃攪拌反應(yīng)12小時。冷卻后，加入二氯甲烷溶解，滴加至冰乙醚中沉淀，過濾、干燥得到共聚物mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)。

實施例2：mPEG-b-PCL-g-PtBMA的制備

將mPEG-b-P(CL-co-BMPCL)（0.626 g），2-[（叔丁氧基羰基）氨基]乙基-甲基丙烯酸酯（1.52 g）以及二聯(lián)吡啶（0.0365 g）溶于3 mL丁酮中。將上述混合溶液在液氮中冷卻，反復(fù)充氮氣與抽真空三次，然后加入溴化亞銅（0.0144 g），進(jìn)一步抽真空后，于60 ℃條件下攪拌反應(yīng)12小時。將產(chǎn)物封裝到透析袋中(截留分子量3500 Da)，在超純水中透析，冷凍干燥后得到mPEG-b-PCL-g-PtBMA共聚物。

實施例3：mPEG-b-PCL-g-PAEM的制備

將mPEG-b-PCL-g-PtBMA（1.0 g）溶于5 mL三氟乙酸，室溫攪拌5小時。在真空條件下將三氟乙酸旋干，然后加入5 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，將所獲溶液滴加到冷乙醚中，過濾，真空干燥獲得mPEG-b-PCL-g-PAEM。

實施例4：mPEG-b-PCL-g-PGEM的制備

將mPEG-b-PCL-g-PAEM（1.0 g）溶于10 mL 0.1M碳酸氫鈉溶液中，加入摩爾數(shù)為胍基兩倍的S-乙基異硫脲氫溴酸鹽，上述反應(yīng)室溫攪拌48小時。將所獲溶液封裝到透析袋中，透析(截留分子量3500 Da) 72小時，冷凍干燥得到mPEG-b-PCL-g-PGEM，其核磁譜圖如圖2所示。

實施例1-4的制備過程見圖1。

實施例5：mPEG-b-PCL-g-PGEM（PECG）納米佐劑的自組裝

稱量20 mg PECG共聚物溶解于2 mL三氟乙醇，逐滴加入置于磁力攪拌器上內(nèi)含10 mL PBS (pH=7.2, 0.01 M)的燒杯中。持續(xù)攪拌24 h，揮發(fā)掉三氟乙醇，將溶液體積補加到10 mL。通過馬爾文激光粒度儀和透射電子顯微鏡分別檢測PECG組裝體的粒徑大小與形貌（圖3）。

實施例6：PECG納米佐劑促BMDCs成熟

將1 mL BMDCs（密度為2×10⁶/mL）懸液加入6孔板，然后加入2 mL cRPMI1640培養(yǎng)基。將PECG納米粒加入鋪有小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞 (bone marrow-derived cells, BMDCs)的孔板中，最終濃度為20 μg/mL。將6孔板轉(zhuǎn)移至5% CO₂，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集各組細(xì)胞后離心（1500 rpm，5 min），取上清，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。PBA（含有0.1% BSA的PBS溶液）洗細(xì)胞（1200 rpm，5 min）兩次，1 mL/次。收集細(xì)胞，使用1 mL PBA重懸各組細(xì)胞，在離心管中分別加入熒光素標(biāo)記抗體兔抗鼠CCR7-PE單克隆抗體，兔抗鼠CD86-PE單克隆抗體，兔抗鼠CD40-PE單克隆抗體及其同型對照各1 μL，置于冰浴中30 min。PBA洗細(xì)胞（1200 rpm，5 min）兩次，各離心管中加入1.0 mL 2%多聚甲醛溶液，冰浴中固定30 min。PBA洗細(xì)胞（1200 rpm，5 min）兩次，1.0 mL PBA重懸細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測各組BMDCs活化相關(guān)信號分子CD86，CD40，CCR7的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。

實施例7：PECG納米佐劑促進(jìn)抗原體外交叉呈遞

將BMDCs以6×10⁴/孔的密度鋪于U型底96孔板中，置于5% CO₂，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，將裸抗原（雞卵清蛋白OVA）或封裝有OVA的PECG納米粒溶液加入96孔板中，濃度為50 μg/mL，以SINFEKL肽段及培養(yǎng)基分別作為陽性與陰性對照。繼續(xù)培養(yǎng)5小時后，使用DPBS輕柔洗細(xì)胞3次，然后將培養(yǎng)于含55 μM β-巰基乙醇，1 mM丙酮酸的cRPMI164培養(yǎng)基中的B3Z細(xì)胞（密度，5×10⁵）加入96孔板中。共培養(yǎng)24小時后，離心（500 rcf，7 min），棄上清，每孔加入150 μL CPRG裂解緩沖液（0.15 M氯酚紅-β-D-吡喃半乳糖，0.1% Trion-X-100，9 mM氯化鎂，100 μM巰基乙醇），避光孵育20小時。而后，將U型96孔板中的液體轉(zhuǎn)移至平底96孔板中，測定570 nm波長處的吸光值，結(jié)果如圖5所示。

實施例8：PECG納米佐劑的體內(nèi)免疫應(yīng)答

以6-8周，雌性BALB/C小鼠為動物模型，皮下注射PECG納米粒，間隔7天注射一次，共免疫三次。第三次免疫2周后，使用密度梯度離心法分離小鼠回流淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞，與PECG納米粒共孵育48小時后，使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6的濃度，結(jié)果如圖6所示。