本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，特別是涉及一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

納米載藥系統(tǒng)用于惡性腫瘤治療具有廣闊的前景，但在治療過(guò)程中存在著腫瘤細(xì)胞耐藥性導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題。最新研究發(fā)現(xiàn)，載藥納米金剛石(NDs)能有效克服耐藥性、抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。發(fā)表在《Science Translational Medicine》的研究表明，能泵出抗腫瘤藥物的腫瘤細(xì)胞卻無(wú)法將納米金剛石轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外，因此可以幫助結(jié)合在納米金剛石上的藥物滯留在細(xì)胞內(nèi)，這一結(jié)論無(wú)疑為克服耐藥性、增加藥物在腫瘤組織滯留提供了新策略。然而載藥納米金剛石在臨床的應(yīng)用卻受限于其以被動(dòng)靶向方式的遞送。

Xin Wang等人研究了一種載表阿霉素納米金剛石[見“ACS Nano”，8卷12151-12166頁(yè)，(2014年)]，該系統(tǒng)具有很好的抗耐藥性，但利用EPR(enhanced permeability and retention；EPR)效應(yīng)被動(dòng)穿透腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙靶向聚集在腫瘤組織，這一方式導(dǎo)致其腫瘤靶向效率不高。此外，該文獻(xiàn)中報(bào)道的載藥納米金剛石只負(fù)載一種抗腫瘤藥物，單一用藥這一措施大大降低了療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法及其用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中納米金剛石載藥單一、療效較差等問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

1)將納米金剛石與水混合，制得第一溶液。

2)將鹽酸阿霉素與水混合，制得第二溶液。

3)將第一溶液與第二溶液混合，制得第三溶液。

4)將氫氧化鈉水溶液加入到第三溶液中，反應(yīng)完全；加入氫氧化鈉，使反應(yīng)處于堿性環(huán)境中，有利于提高藥物在金剛石表面的物理吸附，增加載藥量。

5)將反應(yīng)液離心，去掉上清液，所得沉淀即為阿霉素-納米金剛石復(fù)合物；

6)將阿霉素-納米金剛石復(fù)合物與水混合，制得第四溶液。

7)將全反式維甲酸與第四溶液混合，再加入異丙醇或二甲亞砜進(jìn)行反應(yīng)，制得第五溶液；

8)將第五溶液離心，收集沉淀，制得所述載藥納米金剛石復(fù)合物，即ATRA-DOX-NDs復(fù)合物。

進(jìn)一步地，步驟1)中，所述第一溶液中納米金剛石的濃度為2-10mg/mL，所述水優(yōu)選為去離子水。

進(jìn)一步地，步驟2)中，所述第二溶液中鹽酸阿霉素的濃度為1-2.5mg/mL。

進(jìn)一步地，步驟3)中，第一溶液中納米金剛石與第二溶液中鹽酸阿霉素的質(zhì)量比為10：(1-5)。

進(jìn)一步地，步驟4)中，加入氫氧化鈉水溶液調(diào)至反應(yīng)液的pH為12-13.6。

進(jìn)一步地，步驟6)中，所述第四溶液中阿霉素-納米金剛石復(fù)合物的濃度為2.5-10mg/mL。

進(jìn)一步地，步驟7)中，全反式維甲酸與第四溶液中阿霉素-納米金剛石復(fù)合物的質(zhì)量之比為(1-5)：15。

進(jìn)一步地，步驟7)中，每mL第五溶液中加入0.2-1.0mL異丙醇或二甲亞砜。異丙醇或二甲亞砜可增加全反式維甲酸在水溶液中的溶解度。其作用是溶解全反式維甲酸，全反式維甲酸的加入量會(huì)直接影響異丙醇的加入量。異丙醇或二甲亞砜的加入量以剛好溶解完全反式維甲酸為宜，如果加入的異丙醇或二甲亞砜過(guò)多，阿霉素-金剛石將會(huì)從溶液中析出來(lái)，如果加入的異丙醇量過(guò)少，那么全反式維甲酸部分沒有溶解，進(jìn)而會(huì)影響載藥量。因此，異丙醇或二甲亞砜的加入量存在一個(gè)臨界點(diǎn)，多加或少加都會(huì)帶來(lái)負(fù)面影響。

本發(fā)明第二方面提供上述方法制得的載藥納米金剛石復(fù)合物。

本發(fā)明第三方面提供上述載藥納米金剛石復(fù)合物在制備靶向治療腫瘤藥物中的用途。

進(jìn)一步地，先對(duì)腫瘤部位進(jìn)行超聲輻照，再尾靜脈注射載藥納米金剛石復(fù)合物溶液，完成給藥后，再次超聲輻照腫瘤部位。通過(guò)超聲輻照腫瘤部位，瞬時(shí)增大腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙和對(duì)納米載藥系統(tǒng)定向推移的作用，實(shí)現(xiàn)該系統(tǒng)主動(dòng)穿透腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，靶向聚集在腫瘤組織。

進(jìn)一步地，兩次超聲輻照的超聲頻率為0.5-1.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.10-0.60W/cm²，超聲時(shí)間為1-10min。

本發(fā)明第四方面提供一種載藥納米金剛石復(fù)合物溶液，所述復(fù)合物溶液包括上述載藥納米金剛石復(fù)合物和水，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的載藥納米金剛石復(fù)合物溶液濃度為每kg動(dòng)物體重中鹽酸阿霉素的劑量為5-10mg。即是說(shuō)，按照每kg生物體重注射5-10mg鹽酸阿霉素的濃度注射對(duì)應(yīng)的載藥納米金剛石復(fù)合物溶液。

如上所述，本發(fā)明的一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法，具有以下有益效果：本發(fā)明解決了現(xiàn)有納米金剛石載藥單一、療效欠佳等問題，本發(fā)明的載藥納米金剛石復(fù)合物溶液，結(jié)合超聲輻照，提高了載藥納米金剛石在腫瘤部位的聚集；兩種藥物的聯(lián)合使用以及超聲的促進(jìn)作用，明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)了荷瘤鼠等生物體的壽命。

附圖說(shuō)明

圖1顯示為本發(fā)明實(shí)施例的載藥納米金剛石的紅外圖。

圖2顯示為本發(fā)明實(shí)施例的載藥納米金剛石的粒徑分布圖。

圖3顯示為本發(fā)明實(shí)施例的藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布圖。

圖4顯示為荷瘤鼠的死亡曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

實(shí)施例1

一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：1)取10mg納米金剛石(簡(jiǎn)稱為NDs)，加入5ml去離子水，在常溫常壓下，使用50w超聲分散約0.5h，得到淺棕色澄清透亮溶液，即第一溶液。

2)稱取2mg鹽酸阿霉素，用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第二溶液。

3)常溫、磁力攪拌下，將第二溶液加入第一溶液中，制得第三溶液。

4)取0.02mol/l的NaOH溶液加入到第三溶液中調(diào)至溶液pH＝12，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)。

5)反應(yīng)溶液離心后，吸去上清液，得到12mg沉淀，即為阿霉素-納米金剛石復(fù)合物。

6)將上述阿霉素-納米金剛石復(fù)合物用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第四溶液。

7)稱取4mgATRA(即全反式維甲酸)并與第四溶液混合，再加入2mL異丙醇，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)，制得第五溶液。

8)將第五溶液離心，收集沉淀，得到載藥納米金剛石復(fù)合物，即ATRA-DOX-NDs。

采用上述載藥納米金剛石復(fù)合物治療腫瘤的具體方法如下：

a)將低強(qiáng)度聚焦超聲定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為0.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.10W/cm²，超聲時(shí)間為1min。

b)通過(guò)裸鼠尾靜脈注射ATRA-DOX-NDs溶液(DOX的濃度為5mg/kg體重，即按照每kg動(dòng)物體重注射5mgDOX的濃度注射對(duì)應(yīng)的ATRA-DOX-NDs溶液)。

c)完成給藥后，超聲再次定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為0.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.10W/cm²，超聲時(shí)間為1min。

實(shí)施例2

一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：1)取10mg納米金剛石(簡(jiǎn)稱為NDs)，加入2ml去離子水，在常溫常壓下，使用100w超聲分散約1.0h，得到淺棕色澄清透亮溶液，即第一溶液。

2)稱取4mg鹽酸阿霉素，用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第二溶液。

3)常溫、磁力攪拌下，將第二溶液加入第一溶液中，制得第三溶液。

4)取0.02mol/L的NaOH溶液加入到第三溶液調(diào)至溶液pH＝13.0，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)。

5)反應(yīng)溶液離心后，吸去上清液，得到14mg沉淀，即為阿霉素-納米金剛石復(fù)合物。

6)將上述阿霉素-納米金剛石復(fù)合物用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第四溶液。

7)稱取2.5mgATRA并與第四溶液混合，再加入1mL二甲亞砜，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)，制得第五溶液。

8)將第五溶液離心，收集沉淀，得到載藥納米金剛石復(fù)合物，即ATRA-DOX-NDs。

采用上述載藥納米金剛石復(fù)合物治療腫瘤的具體方法如下：

a)將低強(qiáng)度聚焦超聲定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為1.0MHz，超聲強(qiáng)度為0.30W/cm²，超聲時(shí)間為5min。

b)通過(guò)裸鼠尾靜脈注射ATRA-DOX-NDs溶液(DOX的濃度為8mg/kg體重)。

c)完成給藥后，超聲再次定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為1.0MHz，超聲強(qiáng)度為0.30W/cm²，超聲時(shí)間為5min。

實(shí)施例3

一種載藥納米金剛石復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟：

1)取10mg納米金剛石(簡(jiǎn)稱為NDs)，加入1ml去離子水，在常溫常壓下，使用150w超聲分散約1.5h，得到淺棕色澄清透亮溶液，即第一溶液。

2)稱取5mg鹽酸阿霉素，用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第二溶液。

3)常溫、磁力攪拌下，將第二溶液加入第一溶液中，制得第三溶液。

4)取0.02mol/L的NaOH水溶液加入到第三溶液調(diào)至溶液pH＝13.6，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)。

5)反應(yīng)溶液離心后，吸去上清液，得到15mg沉淀，即為阿霉素-納米金剛石復(fù)合物。

6)將上述阿霉素-納米金剛石復(fù)合物用2ml去離子水配置為溶液，反應(yīng)避光，超聲助溶至溶液澄清透亮，得到第四溶液。

7)稱取1mgATRA并與第四溶液混合，再加入0.4mL異丙醇，常溫、磁力攪拌下反應(yīng)12小時(shí)，制得第五溶液。

8)將第五溶液離心，收集沉淀，得到載藥納米金剛石復(fù)合物，即ATRA-DOX-NDs。

采用上述載藥納米金剛石復(fù)合物治療腫瘤的具體方法如下：

a)將低強(qiáng)度聚焦超聲定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為1.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.60W/cm²，超聲時(shí)間為10min。

b)通過(guò)裸鼠尾靜脈注射ATRA-DOX-NDs溶液(DOX的濃度為10mg/kg體重)。

c)完成給藥后，超聲再次定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為1.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.60W/cm²，超聲時(shí)間為10min。

對(duì)實(shí)施例1制得的藥品在紅外譜圖、粒徑分布、藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布情況、治療效果等方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：

圖1中，NDs：納米金剛石；DOX·HCl：鹽酸阿霉素；ATRA：全反式維甲酸；DOX-NDs：阿霉素-納米金剛石；ATRA-DOX-NDs：全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石。

關(guān)于圖1中紅外譜圖的圖解如下：通過(guò)對(duì)比納米金剛石、鹽酸阿霉素、全反式維甲酸、阿霉素-納米金剛石、全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石的紅外譜圖，能夠明顯看出在全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石的譜圖中出現(xiàn)了阿霉素和全反式維甲酸的特征峰，表明成功負(fù)載阿霉素和全反式維甲酸。

從圖2的粒徑分布圖可以看出，全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石的粒徑大小在80納米左右，粒徑較小，分布較窄，有利于體內(nèi)的靶向分布。

圖3為激光共聚焦圖，即藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的分布圖，圖解如下：全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石在與癌細(xì)胞作用4個(gè)小時(shí)后，藥物明顯進(jìn)入細(xì)胞核，表示藥物在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行了有效釋放。

本發(fā)明選擇荷瘤鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)裸鼠尾靜脈分別注射DOX-NDs、ATRA-DOX-NDs溶液，觀察上述兩種藥物對(duì)荷瘤鼠腫瘤的治療效果。

采用Ulstrasound+ATRA-DOX-NDs治療荷瘤鼠腫瘤的具體方法如下：

a)將低強(qiáng)度聚焦超聲定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為0.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.10W/cm²，超聲時(shí)間為5min。

b)通過(guò)裸鼠尾靜脈注射ATRA-DOX-NDs溶液(DOX的濃度為5mg/kg體重，即按照每kg動(dòng)物體重注射5mgDOX)。

c)完成給藥后，超聲再次定位輻照裸鼠腫瘤部位，超聲頻率為0.5MHz，超聲強(qiáng)度為0.10W/cm²，超聲時(shí)間為5min。

圖4為荷瘤鼠的死亡曲線圖，圖中，從左向右依次為control：空白對(duì)照組、DOX-NDs：阿霉素-納米金剛石組、ATRA-DOX-NDs：全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石組、Ulstrasound+ATRA-DOX-NDs：超聲+全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石組，各組溶液中阿霉素的注射濃度為5mg/kg體重，通過(guò)對(duì)比可以看出，超聲+全反式維甲酸-阿霉素-納米金剛石組能夠明顯延長(zhǎng)動(dòng)物死亡時(shí)間，展示出優(yōu)良的療效。

實(shí)施例2和實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)施例1類似。

綜上所述，本發(fā)明解決了現(xiàn)有納米金剛石載藥單一、療效欠佳等問題，通過(guò)聯(lián)合用藥，達(dá)到協(xié)同增效的作用，本發(fā)明的載藥納米金剛石復(fù)合物溶液結(jié)合超聲輻照，提高了載藥納米金剛石在腫瘤部位的聚集；兩種藥物的聯(lián)合使用以及超聲的促進(jìn)作用，明顯抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)了荷瘤鼠等生物體的壽命。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。