本發(fā)明屬于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，涉及一種藥物新劑型藥物微球的制備方法及其應(yīng)用，特別涉及一種pH響應(yīng)的靶向控釋微球，其制備方法、藥物應(yīng)用，該藥物微球用于預(yù)防、緩解和/或治療結(jié)腸類(lèi)疾病，包括腸易激綜合征，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆病，直腸癌等病癥。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)的不斷發(fā)展進(jìn)步，工作、生活壓力增大，作息飲食不規(guī)律，長(zhǎng)期的精神焦慮，緊張不安等，往往導(dǎo)致免疫失調(diào)以及菌群紊亂等健康問(wèn)題。中醫(yī)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎屬于泄瀉，腸癖等范疇，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其屬于自身免疫性疾病或伴有感染，以腹痛，腹瀉，粘液便，膿血便等為臨床表現(xiàn)，以結(jié)腸黏膜的慢性炎癥變化及潰瘍形成為病理特征。目前關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎的具體病因，病機(jī)尚不明確，因此尚缺乏有效的治療措施。主要采用糖皮質(zhì)激素類(lèi)，非甾體抗炎藥物或免疫抑制劑對(duì)其進(jìn)行治療，但效果不佳。

淫羊藿苷是小檗科植物淫羊藿的主要有效成分，具有抗衰老、抗腫瘤、抗結(jié)腸炎等藥理作用。但是淫羊藿苷水溶性差，自身生物利用度低，這些因素限制了其在臨床上的應(yīng)用。為了保證藥物的有效濃度，避免藥物的毒副作用，達(dá)到有效的治療劑量，中藥現(xiàn)代緩控釋制劑應(yīng)運(yùn)而生?？诜Y(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)(oral colon specific delivery system，OCDDS)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種定位給藥系統(tǒng)，即指使用適當(dāng)?shù)姆椒?，避免藥物在胃、十二指腸、空腸和回腸前端釋放，直接運(yùn)送到人體回、盲腸部位后釋放而發(fā)揮局部或全身治療作用的一種釋藥系統(tǒng)，具有對(duì)結(jié)腸局部環(huán)境的特異性響應(yīng)、設(shè)計(jì)合理以及制備工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。

殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，是唯一的天然堿性多糖，具有廣泛的生物活性而備受醫(yī)藥研究者關(guān)注。殼聚糖分子中的D-葡萄糖單元上氨基的正電荷與消化道黏膜上唾液酸殘基的負(fù)電荷之間的靜電引力使得其易于粘附在胃腸道黏膜表面。而且殼聚糖分子中的糖苷鍵能被結(jié)腸酶降解，故可作為結(jié)腸定位釋藥材料的使用。另外海藻酸鹽可以實(shí)現(xiàn)鈉離子與鈣離子之間的交換，從而有利于溶脹和海藻酸鹽在結(jié)腸內(nèi)的降解。根據(jù)多糖類(lèi)材料可以改善靶向特異性、符合患者的治療需求以及能夠被結(jié)腸生理環(huán)境降解的特點(diǎn)，選用交聯(lián)劑對(duì)包裹殼聚糖的微球進(jìn)行交聯(lián)固化。殼聚糖不同分子鏈上的胺基與醛基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，生成的亞胺基及希夫 堿結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了交聯(lián)殼聚糖在酸性條件下的穩(wěn)定性，可以降低殼聚糖本身的氫鍵作用，降低其生物粘附性。戊二醛交聯(lián)能夠?qū)崿F(xiàn)殼聚糖微球不在胃部滯留，通過(guò)胃腸運(yùn)動(dòng)到達(dá)結(jié)腸，從而發(fā)揮治療結(jié)腸炎癥的作用。

盡管結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚，但是炎性細(xì)胞因子在介導(dǎo)結(jié)腸炎形成的過(guò)程中所起的作用是毋庸置疑的。其中促炎因子IL-1β、TNF-α等是公認(rèn)的介導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)病的細(xì)胞因子，另外，當(dāng)炎性因子誘導(dǎo)i-NOS表達(dá)成功后，前列腺素會(huì)促進(jìn)白細(xì)胞轉(zhuǎn)至炎癥部位并促使NO的產(chǎn)生，從而引起炎癥反應(yīng)以及COX-II的表達(dá)使得機(jī)體本身產(chǎn)生炎癥以及疼痛感。而且也有研究指出炎癥的形成以及COX-II的表達(dá)在結(jié)腸致癌過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

傳統(tǒng)結(jié)腸疾病給藥方式主要有口服和直腸給藥兩種途徑，口服給藥由于結(jié)腸的特殊生理結(jié)構(gòu)，藥物難以到達(dá)結(jié)腸部位，直腸給藥雖然能夠使藥物在局部釋放，但是對(duì)于結(jié)腸上端疾病并不能有效發(fā)揮作用，本發(fā)明將淫羊藿苷載入到殼聚糖/海藻酸鈣緩控釋微球制備的口服結(jié)腸定位釋藥系統(tǒng)用于消化性潰瘍的治療，目前未見(jiàn)其報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有治療結(jié)腸疾病的藥物存在技術(shù)的不足，提供一種pH響應(yīng)的用于治療結(jié)腸疾病的控釋微球及其制備方法，本發(fā)明的控釋微球具有良好的pH響應(yīng)性，能夠靶向給藥，本發(fā)明方法制備的結(jié)腸靶向控釋微球主要用于預(yù)防、緩解和/或治療結(jié)腸類(lèi)疾病，包括腸易激綜合征，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆病，直腸癌等相關(guān)病癥的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于治療結(jié)腸疾病的控釋微球的制備方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟：

1)配制乳化水相

向海藻酸鈉溶液中加入碳酸鈣、淫羊藿苷，攪拌，使碳酸鈣、淫羊藿苷混懸于海藻酸鈉溶液中，制得碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液(即乳化水相)；

2)配制乳化油相

將乳化劑加入到液體石蠟中，攪拌，混勻，制成乳化劑-石蠟溶液(即乳化油相)；

3)乳化處理

在攪拌狀態(tài)下，將碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液與乳化劑-石蠟溶液混合，進(jìn)行乳化處理，形成乳化體系；接著加入酸引發(fā)劑，進(jìn)行酸引發(fā)處理，生成淫羊藿苷-海藻酸鈣微球；

4)將淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到成膜殼聚糖溶液中，混合均勻，進(jìn)行復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反 應(yīng)，殼聚糖包裹在淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的表面，制成殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球；

5)將殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與交聯(lián)劑混合，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，即得淫羊藿苷控釋微球。

其中，步驟1)中所述碳酸鈣的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為0.2-2:100，優(yōu)選為0.5-1.5:100，進(jìn)一步優(yōu)選為1:100，即每100ml海藻酸鈉溶液中加入0.2-2g納米級(jí)碳酸鈣或每1L海藻酸鈉溶液中加入2-20g碳酸鈣；所述淫羊藿苷的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為1-3：100，優(yōu)選為1.5-2.5：100，進(jìn)一步優(yōu)選為2.25:100，即每100ml海藻酸鈉溶液中加入1-3g淫羊藿苷或每1L海藻酸鈉溶液中加入10-30g淫羊藿苷。

特別是，所述碳酸鈣選擇納米級(jí)碳酸鈣。

其中，所述海藻酸鈉溶液的濃度為0.5-2％(w/v)，優(yōu)選為1-2％，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5％。

特別是，所述海藻酸鈉溶液按照如下步驟制備而成：將海藻酸鈉加入到純水中，混合，加熱并保持在45±5℃條件下，攪拌，使海藻酸鈉充分溶解，即得，其中，海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量與水的體積之比為0.5-2:100，即海藻酸鈉溶液的濃度為0.5％-2％(w/v)。

其中，步驟2)中所述乳化劑選擇司盤(pán)80或/和吐溫80。

特別是，所述乳化劑與液體石蠟的體積之比為0.5-2:100，優(yōu)選為0.5-1.5:100，進(jìn)一步優(yōu)選為1.0:100。

其中，步驟3)中所述乳化處理溫度為35-45℃，優(yōu)選為37℃；乳化處理時(shí)間為30-60min，優(yōu)選為40-50min。

特別是，所述碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液與乳化劑-石蠟溶液的體積之比為1:4-6，優(yōu)選為1:5。

尤其是，所述攪拌速率為200-500rpm，優(yōu)選為300rpm。

其中，所述酸引發(fā)劑選擇冰醋酸、鹽酸、硫酸、磷酸，優(yōu)選為冰醋酸。

特別是，所述酸引發(fā)劑為冰醋酸與液體石蠟的混合溶液，其中冰醋酸與酸引發(fā)劑的體積之比為1：8-12，優(yōu)選為1:10。

尤其是，所述酸引發(fā)劑中冰醋酸的體積與碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液中碳酸鈣的重量之比為5：1-3，優(yōu)選為5:1，即碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液中每含1-3g碳酸鈣則添加的酸引發(fā)劑中的冰醋酸5ml，或者碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉混懸液中每含1-3kg碳酸鈣則添加的酸引發(fā)劑中的冰醋酸5L。

其中，所述酸引發(fā)處理溫度35-45℃，優(yōu)選為37℃；酸引發(fā)處理時(shí)間為10-20min，優(yōu) 選為15min。

特別是，還包括對(duì)酸引發(fā)處理后的混合體系進(jìn)行靜置處理，混合體系上下分層，取下層沉淀，即得所述的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球。

尤其是，采用體積比濃度為0.5-2％(v/v)的Tween80水溶液清洗沉淀，以去除多余的液體石蠟；然后再用純水洗滌，收集淫羊藿苷-海藻酸鈣微球。

其中，步驟4)中所述成膜殼聚糖溶液為殼聚糖-醋酸溶液。

特別是，所述殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的濃度為0.5％-2％(w/v)，優(yōu)選為1％。

尤其是，所述成膜殼聚糖溶液按照如下步驟配制而成：將殼聚糖加入到冰醋酸水溶液中，混勻后，加熱升溫并保持在45±5℃條件下，攪拌，使殼聚糖充分溶解，待其冷卻后調(diào)節(jié)殼聚糖-醋酸溶液的pH為5-6，備用.

其中，所述殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的質(zhì)量與冰醋酸水溶液的體積之比為0.5-2:100，即殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的濃度為0.5％-2％(w/v)，優(yōu)選為1:100。

特別是，所述冰醋酸水溶液體積百分比濃度為0.5-2％(v/v)，優(yōu)選為1％。

尤其是，調(diào)節(jié)殼聚糖-醋酸溶液的pH為5.5。

其中，所述復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)的時(shí)間≥20min，優(yōu)選為20-40min。

特別是，淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與膜殼聚糖溶液的體積之比為1:5-15，優(yōu)選為1:8。

尤其是，還包括將復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)后的反應(yīng)體系進(jìn)行離心處理，然后對(duì)離心沉淀物進(jìn)行水清洗。

其中，步驟5)中所述交聯(lián)劑選擇戊二醛水溶液、PBS緩沖液中的一種，優(yōu)選為戊二醛水溶液。

特別是，所述戊二醛水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-1％，優(yōu)選為0.5％。

尤其是，所述殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與交聯(lián)劑的體積之比為1:5-20，優(yōu)選為1:10。

其中，所述交聯(lián)反應(yīng)的溫度<10℃，優(yōu)選為4-10℃，進(jìn)一步優(yōu)選為4-8℃，更進(jìn)一步優(yōu)選為4℃；交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1.5-3h，優(yōu)選為2h。

特別是，還包括加入交聯(lián)終止劑，終止所述的交聯(lián)反應(yīng)。

其中，所述交聯(lián)終止劑選擇甘氨酸溶液。

特別是，所述甘氨酸溶液的摩爾濃度為0.5-2mol/L，優(yōu)選為1mol/L。

尤其是，所述加入的甘氨酸溶液與戊二醛溶液的體積之比為2-4:1，優(yōu)選為2:1。

特別是，還包括對(duì)交聯(lián)反應(yīng)終止后的混合體系進(jìn)行離心處理，接著對(duì)離心沉淀物用純水進(jìn)行清洗，然后進(jìn)行干燥，即得。

本發(fā)明另一方面提供一種按照上述方法制備而成的淫羊藿苷控釋微球。

本發(fā)明再一方面提供一種按照上述方法制備而成的淫羊藿苷控釋微球在制備治療結(jié)腸疾病中的應(yīng)用，在制備治療結(jié)腸疾病的藥物或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明制備的淫羊藿苷生物控釋微球具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的淫羊藿苷生物控釋微球?yàn)閜H響應(yīng)控釋微球，具有良好的pH響應(yīng)性，在胃部低pH環(huán)境下不發(fā)生明顯的降解，藥物釋放量較低，在結(jié)腸較高pH環(huán)境下粘附在結(jié)腸表面持續(xù)釋放藥物，能夠促進(jìn)藥物釋放，并延長(zhǎng)藥物的結(jié)腸滯留時(shí)間，增加藥物吸收，改善口服用藥治療結(jié)腸部位疾病的局部生物利用度。體外釋藥研究結(jié)果表明，淫羊藿苷靶向緩控釋微球模擬胃液中釋放2h后累計(jì)釋放率僅10％左右，而模擬結(jié)腸液中累計(jì)釋放率可達(dá)到65％。

2、本發(fā)明方法制備的淫羊藿苷生物控釋微球的核心為淫羊藿苷海藻酸鈣微球，外殼為殼聚糖，同時(shí)具有理想的pH響應(yīng)控釋效果和淫羊藿苷結(jié)腸靶向控釋藥效作用，用于治療結(jié)腸疾病，治療腸易激綜合征，潰瘍性結(jié)腸炎，克隆病，直腸癌等病癥。

本發(fā)明方法制備的淫羊藿苷靶向緩控釋微球能夠顯著改善TNBS/乙醇誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎，能夠有效降低結(jié)腸部位炎性因子IL-1β、IL-6的分泌，降低引起炎癥反應(yīng)的i-NOS、COX-II蛋白表達(dá)水平。

3、本發(fā)明的淫羊藿苷pH響應(yīng)生物控釋微球藥物負(fù)載于微球內(nèi)部核心，藥物載藥量高，藥物的外層包裹殼聚糖，能夠固定藥物，從而減少藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程中的損失。

4、本發(fā)明的淫羊藿苷pH響應(yīng)生物控釋微球的靶向給藥效果明顯，微球在結(jié)腸部位長(zhǎng)時(shí)間停留，提高治療效果。體內(nèi)研究表明微球能夠在結(jié)腸停留超過(guò)12h，更有利于藥物的釋放和發(fā)揮治療作用。

5、本發(fā)明制備的淫羊藿苷靶向緩控釋微球外面為殼聚糖，為pH敏感性陽(yáng)離子型水凝膠材料，具有良好的生物粘附性、生物相容性和生物可降解性，對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，且具有抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合作用等。

6、本發(fā)明方法工藝條件容易控制，制備的產(chǎn)品質(zhì)量可控，適宜工業(yè)化大生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球在模擬胃液中(pH＝1.2)的累計(jì)釋放率圖。

圖2淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球在模擬小腸液和結(jié)腸液(pH＝6.8、pH＝7.4)中的累積釋放率圖。

圖2A為淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣微球在模擬小腸液(pH＝6.8)中的累積釋放率圖。

圖3 FITC熒光標(biāo)記微球小鼠消化道內(nèi)的分布結(jié)果圖，從左至右分別是胃、十二指腸、空腸和結(jié)腸。

圖4淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織IL-1β含量的影響結(jié)果圖。

圖5淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織TNF-α含量的影響結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠(chǎng)商所建議的條件。

以下通過(guò)試驗(yàn)例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明所述淫羊藿苷靶向緩控釋微球用于結(jié)腸炎的治療作用，這些試驗(yàn)例包括了本發(fā)明淫羊藿苷靶向緩控釋微球的制備和藥物釋放試驗(yàn)及本發(fā)明淫羊藿苷靶向緩控釋微球的藥效學(xué)試驗(yàn)。

本發(fā)明實(shí)施例中使用的試劑如下：

實(shí)施例1淫羊藿/苷殼聚糖/海藻酸鈣微球的制備

1、配制溶液

1-1)配制海藻酸鈉溶液

將精確稱(chēng)量的海藻酸鈉加入到純水中，混合，加熱并保持在45±5℃條件下，攪拌，使海藻酸鈉充分溶解，制得海藻酸鈉溶液，待其降至室溫(20-25℃左右)后于4℃冰箱保存，使用前加熱至45℃，備用，其中，海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量與水的體積之比為0.5:100，即海藻酸鈉溶液的濃度為1.0％(w/v)；

1-2)配制成膜溶液(即殼聚糖-醋酸溶液)

將精確稱(chēng)量的殼聚糖加入到0.5％的冰醋酸(v/v，體積百分比濃度)水溶液中，混勻后，加熱升溫并保持在45±5℃條件下，攪拌，使殼聚糖充分溶解，制得殼聚糖-醋酸溶液(即成膜溶液)，待其降至室溫(20-25℃左右)后于4℃冰箱保存，使用前調(diào)節(jié)殼聚糖-醋酸溶液的pH為5.5，備用，其中，殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的質(zhì)量與冰醋酸水溶液的體積之比為0.5:100，即殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的濃度為0.5％(w/v)；

冰醋酸水溶液的體積百分比濃度除了0.5％之外，其他濃度0.5-2.0％均適用于本發(fā)明；本發(fā)明使用前的殼聚糖-醋酸溶液的pH值以5.5為例進(jìn)行說(shuō)明，其他pH值5-6均適用于本發(fā)明。

1-3)配制酸引發(fā)劑

將精確量取的冰乙酸加入到液體石蠟中，攪拌，混合均勻，備用，其中冰乙酸與酸引發(fā)劑的體積之比為1:8-12，優(yōu)選為1:10。

本發(fā)明實(shí)施例中酸引發(fā)劑中冰乙酸與液體石蠟的體積之比以1:10為例進(jìn)行說(shuō)明，其他冰乙酸與液體石蠟的體積之比為1:8-12均適用于本發(fā)明。

2、制備淫羊藿苷-海藻酸鈣微球

2-1)配制水相

用注射器移取步驟1)制備的海藻酸鈉溶液(20ml)置于燒杯，電磁攪拌，在溫度保持為45±5℃條件下加入納米級(jí)碳酸鈣(0.1g)，攪拌均勻后加入淫羊藿苷(0.3g)，攪拌均勻，使得納米級(jí)碳酸鈣及淫羊藿苷混懸于海藻酸鈉溶液中，制得碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉溶液(即水相，20ml)；其中：碳酸鈣的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為0.5:100；淫羊藿苷的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為1.5：100。

2-2)配制油相

用注射器移取表面活性劑Span 80(0.5ml)加入到液體石蠟(100ml)中，于37±5℃水浴條件下，攪拌，使其充分混勻，制得Span-石蠟溶液(油相)備用，其中表面活性劑Span 80與液體石蠟的體積之比為0.5:100；

本發(fā)明實(shí)施例中以表面活性劑Span80為例進(jìn)行說(shuō)明，其他表面活性劑均適用于本發(fā)明，例如Tween80等。

2-3)酸引發(fā)處理

在37±1℃水浴、攪拌速度為300rpm(200-500rpm也適用)的條件下，將水相加入到油相中進(jìn)行乳化處理，攪拌使水相與油相充分混勻，形成乳化體系；

乳化處理45min后立即向乳化體系中加入酸引發(fā)劑液體石蠟-醋酸混合液(5mL，含冰乙酸0.5ml)，進(jìn)行酸引發(fā)處理，形成淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，酸引發(fā)劑中冰乙酸與液體石蠟的體積之比為1:10；酸引發(fā)劑中冰乙酸的體積與水相中碳酸鈣的重量之比為5:1(v/w)；

酸引發(fā)處理15min后停止攪拌，然后靜止放置，混合體系上下分層(即靜置分層)靜置30min后，取下層淫羊藿苷-海藻酸鈣微球沉淀，用體積比0.5％的Tween80水溶液清洗3次沉淀，以去除多余的液體石蠟，接著用純水洗滌，直至清洗干凈，收集淫羊藿苷-海藻酸鈣微球。

本發(fā)明實(shí)施例中水相與油相的體積之比以1:5為例進(jìn)行說(shuō)明，其他水相與油相的體積之比為1:4-6均適用于本發(fā)明；酸引發(fā)劑中冰乙酸與液體石蠟的體積之比以1:10為例進(jìn)行說(shuō)明，其他配比如1：9-11均適用于本發(fā)明

本發(fā)明將冰乙酸與與液體石蠟混合制成的混合液作為酸引發(fā)劑，可以將引發(fā)劑酸與乳化體系混合均勻，冰醋酸迅速均勻地分散到乳化體系中，避免局部酸濃度過(guò)高或過(guò)低，同時(shí)加入的冰醋酸與納米碳酸鈣發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使納米碳酸鈣中鈣以離子的狀態(tài)游離出來(lái)，加入的酸引發(fā)劑液體石蠟-醋酸混合液在乳化體系中形成一個(gè)緩沖溶液體系，使鈣離子能夠緩慢、持續(xù)的釋放，釋放的鈣離子與乳化體系微乳內(nèi)的海藻酸鈉發(fā)生反應(yīng)，形成內(nèi)部交聯(lián)，生成海藻酸鈣均勻分布于形成的微球，從而有利于形成粒徑均勻、結(jié)構(gòu)緊密的微米級(jí)微球。

本發(fā)明乳化處理形成淫羊藿苷-海藻酸鈣微球過(guò)程中，采用冰乙酸引發(fā)納米級(jí)碳酸鈣釋放鈣離子，不僅使得本發(fā)明制備工藝條件反應(yīng)溫和，可控性強(qiáng)，有利于形成粒徑均勻的微米級(jí)微球；而且由于在乳化過(guò)程中由于納米碳酸鈣均勻分布于微乳內(nèi)部，由醋酸引發(fā)釋放鈣離子與海藻酸分子形成凝膠，這樣形成的凝膠屬于內(nèi)部交聯(lián)，使得形成的凝膠微球結(jié)構(gòu)更為緊密，有良好的藥物控釋性能；而其他制備微球通常采用在微乳液形成之后，再添加氯化鈣或其它鈣離子溶液固化形成凝膠，由于微乳液的水相液滴直徑在100微米甚至更大，微乳液外部最先接觸到鈣離子，迅速固化，形成了一個(gè)比較致密的凝膠“殼層”，不利于鈣離子向內(nèi)部遷移，而影響固化效率，使得形成的微球內(nèi)部未能很好固化，而是一個(gè)微囊，這樣會(huì)造成藥物釋放 過(guò)快或者微囊解體突釋藥物，不利于結(jié)腸靶向給藥。

3、殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的制備

將精確量取步驟2)制備的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到成膜溶液殼聚糖-醋酸溶液(pH5.5)中，在攪拌狀態(tài)下使殼聚糖與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，殼聚糖包裹在淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的表面，磁力攪拌40min后，使殼聚糖充分與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，包裹在淫羊藿苷海藻酸鈣微球的表面。反應(yīng)完畢后離心收集微球，用純水清洗微球表面，除去未反應(yīng)的殼聚糖溶液，將微球收集，獲得絡(luò)合反應(yīng)后的殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與成膜溶液的體積比為1:5；所述復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間為40min。

4、淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球的制備

4-1)將殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到交聯(lián)劑溶液(質(zhì)量百分比濃度為0.25％的戊二醛水溶液)中，攪拌、混合均勻，在4℃條件下，于滾軸上振搖，戊二醛與殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，其中，殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與戊二醛溶液的體積之比為1:5；

本發(fā)明實(shí)施例中交聯(lián)反應(yīng)溫度以4℃為例進(jìn)行說(shuō)明，低溫條件下能夠避免戊二醛與殼聚糖發(fā)生劇烈反應(yīng)，使得交聯(lián)反應(yīng)速度更加緩慢平穩(wěn)，形成的微球表面厚度更加均勻一致，其他溫度低于10℃(例如4-8℃)條件下均適用于本發(fā)明。

4-2)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為1.5h后，向反應(yīng)體系中加入交聯(lián)終止劑摩爾濃度為0.5mol/L的甘氨酸溶液去除未反應(yīng)的戊二醛，其中，甘氨酸溶液的用量與戊二醛溶液體積比為2:1；

4-3)將上述溶液通過(guò)離心機(jī)離心得到濕態(tài)的淫羊藿苷控釋微球，然后用純水清洗微球表面，再次離心，反復(fù)3次，最后將得到的淫羊藿苷控釋微球冷凍干燥24h備用。

實(shí)施例2

1、配制溶液

1-1)配制海藻酸鈉溶液

將精確稱(chēng)量的海藻酸鈉加入到純水中，混合，加熱并保持在45±5℃條件下，攪拌使海藻酸鈉充分溶解，制得海藻酸鈉溶液，待其降至室溫后于4℃冰箱保存，使用前加熱至45℃，備用，其中，海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量與水的體積之比為1.5％；

1-2)配制殼聚糖-醋酸溶液(成膜溶液)

將精確稱(chēng)量的殼聚糖加入到1％的冰醋酸(v/v，體積百分比濃度)水溶液中，混勻后，加 熱升溫并保持在45±5℃條件下，攪拌，使殼聚糖充分溶解，制得殼聚糖-醋酸溶液(成膜溶液)，待其降至室溫后于4℃冰箱保存，使用前調(diào)節(jié)殼聚糖-醋酸溶液的pH為5.5，備用，其中，殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的質(zhì)量與冰醋酸水溶液的體積之比為1:100，即殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的濃度為1％；

冰醋酸水溶液的體積百分比濃度除了1％之外，其他濃度0.5-2.0％均適用于本發(fā)明；本發(fā)明使用前的殼聚糖-醋酸溶液的pH值除了5.5之外，其他pH值5-6均適用于本發(fā)明。

1-3)配制酸引發(fā)劑

將精確量取的冰乙酸加入到液體石蠟中，攪拌，混合均勻，備用，其中冰乙酸與酸引發(fā)劑的體積之比為1:10。

2、制備淫羊藿苷-海藻酸鈣微球

2-1)配制水相

用注射器移取步驟1)制備的海藻酸鈉溶液(20ml)置于燒杯，電磁攪拌，在溫度保持為45±5℃條件下加入納米級(jí)碳酸鈣(0.2g)，攪拌均勻后加入淫羊藿苷(0.45g)，攪拌均勻，使得納米級(jí)碳酸鈣及淫羊藿苷混懸于海藻酸鈉溶液溶液中，制得碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉溶液(即水相，20ml)；其中：碳酸鈣的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為1:100；淫羊藿苷的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為2.25：100。

2-2)配制油相

用注射器移取表面活性劑Span 80(1ml)加入到液體石蠟(100ml)中，于37±5℃水浴條件下，機(jī)械攪拌，使其充分混勻，制得Span-石蠟溶液(油相)備用，其中表面活性劑Span80與液體石蠟的體積之比為1:100；

2-3)酸引發(fā)處理

在37±1℃水浴、攪拌速度為300rpm的條件下，將水相加入到油相中進(jìn)行乳化處理，攪拌使水相與油相充分混勻，形成乳化體系；

乳化處理40min后立即向乳化體系中加入酸引發(fā)劑液體石蠟-醋酸混合液(5mL，含冰乙酸0.5ml)，進(jìn)行酸引發(fā)處理，形成淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，酸引發(fā)劑中冰乙酸的體積與水相中碳酸鈣的重量之比為5:2(v/w)；

酸引發(fā)處理15min后停止攪拌，然后靜止放置，混合體系上下分層(即靜置分層)靜置30min后，取下層淫羊藿苷-海藻酸鈣微球沉淀，用體積比1％的Tween80水溶液清洗3次沉淀，以去除多余的液體石蠟，接著用純水洗滌，直至清洗干凈，收集淫羊藿苷-海藻酸鈣微球。3、殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的制備

將精確量取步驟2)制備的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到成膜溶液殼聚糖-醋酸溶液(pH5.5)中，在攪拌狀態(tài)下使殼聚糖與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，殼聚糖包裹在淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的表面，磁力攪拌30min后，使殼聚糖充分與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，包裹在淫羊藿苷海藻酸鈣微球的表面。反應(yīng)完畢后離心收集微球，用純水清洗微球表面，除去未反應(yīng)的殼聚糖溶液，將微球收集，獲得絡(luò)合反應(yīng)后的殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與成膜溶液的體積比為1:8；所述復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間為30min；

4、淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控制微球的制備

4-1)將殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到交聯(lián)劑溶液(質(zhì)量百分比濃度為0.5％的戊二醛溶液)中，攪拌、混合均勻，在4℃條件下，于滾軸上振搖，戊二醛與包裹殼聚糖的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，其中，殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與戊二醛溶液的體積之比為1:10；

4-2)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為2h后，向反應(yīng)體系中加入甘氨酸溶液(摩爾濃度為1mol/L)去除未反應(yīng)的戊二醛，其中，甘氨酸溶液的用量與戊二醛溶液體積比為2：1；

4-3)將上述溶液通過(guò)離心機(jī)離心得到濕態(tài)的淫羊藿苷控釋微球，然后用純水清洗微球表面，再次離心，反復(fù)3次，最后將得到的淫羊藿苷控釋微球冷凍干燥24h備用。

實(shí)施例3

1、配制溶液

1-1)配制海藻酸鈉溶液

將精確稱(chēng)量的海藻酸鈉加入到純水中，混合，加熱并保持在45±5℃條件下，攪拌，使海藻酸鈉充分溶解，制得海藻酸鈉溶液，待其降至室溫后于4℃冰箱保存，使用前加熱至45℃，備用，其中，海藻酸鈉溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量與水的體積之比為2％；

1-2)配制殼聚糖-醋酸溶液(成膜溶液)

將精確稱(chēng)量的殼聚糖加入到2％的冰醋酸(v/v，體積百分比濃度)水溶液中，混勻后，加熱升溫并保持在45±5℃條件下，攪拌，使殼聚糖充分溶解，制得殼聚糖-醋酸溶液(即成膜溶液)，待其降至室溫后于4℃冰箱保存，使用前調(diào)節(jié)殼聚糖-醋酸溶液的pH為5.5，備用，其中，殼聚糖-醋酸溶液中殼聚糖的質(zhì)量與冰醋酸水溶液的體積之比為2％；

冰醋酸水溶液的體積百分比濃度除了2％之外，其他濃度0.5-2.0％均適用于本發(fā)明；本發(fā)明使用前的殼聚糖-醋酸溶液的pH值除了5.5之外，其他pH值5-6均適用于本發(fā)明。

2、制備淫羊藿苷-海藻酸鈣微球

2-1)配制水相

用注射器移取步驟1)制備的海藻酸鈉溶液(20ml)置于燒杯，電磁攪拌，在溫度保持為45±5℃條件下加入納米級(jí)碳酸鈣(0.3g)，攪拌均勻后加入淫羊藿苷(0.5g)，攪拌均勻，使得納米級(jí)碳酸鈣及淫羊藿苷混懸于海藻酸鈉溶液溶液中，制得碳酸鈣-淫羊藿苷-海藻酸鈉溶液(即水相，20ml)；其中：碳酸鈣的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為1.5:100；淫羊藿苷的重量與海藻酸鈉溶液的體積之比為2.5：100。

2-2)配制油相

用于注射器移取表面活性劑Span 80(1.5ml)加入到液體石蠟(100ml)中，于37±5℃水浴條件下，攪拌，使其充分混勻，制得Span-石蠟溶液(油相)備用，其中表面活性劑Span80與液體石蠟的體積之比為1.5:100；

2-3)酸引發(fā)處理

在37±1℃水浴、攪拌速度為300rpm的條件下，將水相加入到油相中進(jìn)行乳化處理，攪拌使水相與油相充分混勻，形成乳化體系；

乳化處理50min后立即向乳化體系中加入酸引發(fā)劑液體石蠟-醋酸混合液(5mL，含冰乙酸0.5ml)，進(jìn)行酸引發(fā)處理，形成淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，酸引發(fā)劑中液體石蠟與冰醋酸的體積之比為10：1；酸引發(fā)劑中冰乙酸的體積與水相中碳酸鈣的重量之比為5:3(v/w)；

酸引發(fā)處理20min后停止攪拌，然后靜止放置，混合體系上下分層(即靜置分層)靜置30min后，取下層淫羊藿苷-海藻酸鈣微球沉淀，用體積比1.5％的Tween80水溶液清洗3次沉淀，以去除多余的液體石蠟，接著用純水洗滌，直至清洗干凈，收集淫羊藿苷-海藻酸鈣微球。

3、殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的制備

將精確量取步驟2)制備的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到成膜溶液殼聚糖-醋酸溶液(pH5.5)中，在攪拌狀態(tài)下使殼聚糖與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，殼聚糖包裹在淫羊藿苷-海藻酸鈣微球的表面，磁力攪拌20min后，使殼聚糖充分與海藻酸鈉發(fā)生復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)，包裹在淫羊藿苷海藻酸鈣微球的表面。反應(yīng)完畢后離心收集微球，用純水清洗微球表面，除去未反應(yīng)的殼聚糖溶液，將微球收集，獲得絡(luò)合反應(yīng)后的殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，其中，淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與成膜溶液的體積比為1:15；所述復(fù)電解質(zhì)絡(luò)合反應(yīng)時(shí)間為20min。

4、淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控制微球的制備

4-1)將殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到交聯(lián)劑溶液(質(zhì)量百分比濃度為1％的戊二醛水溶液)中，攪拌、混合均勻，在8℃條件下，于滾軸上振搖，戊二醛與殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，其中，殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球與戊二醛溶液的體積之比為1:20；

4-2)交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為3h后，向反應(yīng)體系中加入甘氨酸溶液(摩爾濃度為2mol/L)去除未反應(yīng)的戊二醛，其中，甘氨酸溶液的用量與成膜溶液體積比為1:1；

4-3)將上述溶液通過(guò)離心機(jī)離心得到濕態(tài)的淫羊藿苷控釋微球，然后用純水清洗微球表面，再次離心，反復(fù)3次，最后將得到的淫羊藿苷控釋微球冷凍干燥24h備用。

實(shí)施例4淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球體外釋放藥物實(shí)驗(yàn)

根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》一部附錄，“釋放度”測(cè)定的第一種方法“轉(zhuǎn)籃法”測(cè)定，分別以模擬胃液(2h、pH＝1.2)；模擬小腸液(3h、pH＝6.8)；模擬結(jié)腸液(24h、pH＝7.4)為溶出介質(zhì)，溫度為37±0.5℃，轉(zhuǎn)速為50r/min。

分別精密稱(chēng)取實(shí)施例2制備的淫羊藿苷緩控釋微球各2g，共8份，投入8個(gè)干燥的轉(zhuǎn)籃內(nèi)，模擬胃液4份；模擬小腸液、模擬結(jié)腸液4份，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)籃轉(zhuǎn)速50rpm，待其平穩(wěn)后，將轉(zhuǎn)籃降入恒溫的含有200mL溶出介質(zhì)(模擬胃液、模擬小腸液)的溶出杯中，自樣品接觸溶出介質(zhì)起立即計(jì)時(shí)，于不同時(shí)間點(diǎn)分別取樣1mL，其中模擬胃液取樣時(shí)間點(diǎn)為5，10，15，20，25，30，40，50，60，80，100，120min；模擬小腸液取樣時(shí)間點(diǎn)為5，10，15，20，25，30，40，50，60，80，100，120，150，180min；在本發(fā)明制備的淫羊藿苷緩控釋微球在模擬小腸液中釋放藥物3h后將裝有淫羊藿苷控釋微球的轉(zhuǎn)籃從模擬小腸液轉(zhuǎn)移到模擬結(jié)腸液中，進(jìn)行本發(fā)明制備的淫羊藿苷緩控釋微球在模擬結(jié)腸液中的藥物釋放試驗(yàn)，模擬結(jié)腸液的取樣時(shí)間點(diǎn)為：200，260，320，400，600，720，1440，2880min，每次取樣后同時(shí)補(bǔ)加相同體積的模擬液，將取得樣品經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后采用高效液相色普法(HPLC)測(cè)定釋放液中淫羊藿苷的含量。

將淫羊藿苷緩控釋微球首先在模擬小腸液中釋放180min，然后放入模擬結(jié)腸液中繼續(xù)釋放，主要看其在微球到達(dá)結(jié)腸環(huán)境下的釋放情況，由于結(jié)腸的特殊結(jié)構(gòu)，微球在其中停留的時(shí)間較長(zhǎng)，因此我們模擬的時(shí)候也延長(zhǎng)了釋放時(shí)間，延長(zhǎng)到2800min。

淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣微球在模擬胃液中釋放2h后累計(jì)釋放率僅有10％(如圖1)，圖2顯示微球在模擬小腸及結(jié)腸液中的釋放情況，結(jié)果表明本發(fā)明制備的淫羊藿苷控釋微球在模擬小腸及結(jié)腸液中藥物能夠大量釋放，累計(jì)釋放率可達(dá)到65％，在較高pH值的模擬結(jié) 腸液中淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球可以持續(xù)釋放藥物。

圖2中虛線(xiàn)左邊為模擬小腸液(pH 6.8)的藥物釋放情況，釋藥時(shí)間從5-180min；虛線(xiàn)的右邊表示為模擬結(jié)腸液(pH7.4)的藥物釋放情況，釋藥時(shí)間從200-2880min。

圖2A為淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣微球在模擬小腸液中釋放情況，本發(fā)明制備的淫羊藿苷控釋微球在釋放180min后累計(jì)釋放率為10.51％。

實(shí)施例5淫羊藿/苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球體內(nèi)消化道內(nèi)分布

取一定體積的按照實(shí)施例2步驟2制備的淫羊藿苷-海藻酸鈣微球，將淫羊藿苷-海藻酸鈣微球加入到6倍的FITC熒光標(biāo)記的成膜溶液殼聚糖-醋酸溶液(pH5.5)中，磁力攪拌30min，反應(yīng)完畢后，用70％的甲醇溶液洗滌微球至上清在495nm無(wú)吸收，然后用純水清洗微球表面，得到FITC標(biāo)記殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球；其中，所述FITC熒光標(biāo)記的成膜溶液中FITC熒光標(biāo)記的殼聚糖的濃度為10mg/mL；

將FITC標(biāo)記殼聚糖-淫羊藿苷-海藻酸鈣微球分散于10倍的0.5％戊二醛交聯(lián)劑中，4℃條件下置于滾軸上振搖交聯(lián)反應(yīng)2h。用1mol/L的甘氨酸溶液洗去多余未反應(yīng)的戊二醛溶液，最后用純水清洗微球表面，冷凍干燥24h，制得FITC熒光標(biāo)記的淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球，備用。

選取健康的雄性ICR小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，體重20±2g，實(shí)驗(yàn)前禁食24h，自由飲水；將得到的FITC標(biāo)記的淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球，用蒸餾水分散均勻，按照6mg/20g(微球的重量/小鼠重量)小鼠灌胃給予FITC標(biāo)記的淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球，共7組，每組3只小鼠，分別在灌胃后的不同時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、12、16、24、36h)，將實(shí)驗(yàn)組小鼠麻醉后分離胃、十二指腸、空腸、結(jié)腸四部分，2h為第一組，4h為第二組，6h為第三組，12h為第四組，16h為第五組，24h為第六組，36h為第七組，使用小動(dòng)物成像儀觀(guān)察FITC標(biāo)記交聯(lián)微球在小鼠胃腸道的分布情況。

FITC熒光標(biāo)記微球小鼠消化道內(nèi)的分布結(jié)果分析如圖3所示。

為了進(jìn)一步考察本發(fā)明的pH響應(yīng)控釋微球在小鼠消化道內(nèi)的分布情況，給小鼠灌胃FITC標(biāo)記殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球，在灌胃后的不同時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、12、16、24、36h)觀(guān)察微球在胃腸道內(nèi)的分布情況，以觀(guān)察控釋微球的定位情況。從圖3的熒光強(qiáng)度照片可以看出，前12h微球主要聚集在胃部，而自16h開(kāi)始，微球開(kāi)始大量集聚于結(jié)腸，24h時(shí)集聚最多。結(jié)果表明本發(fā)明制備的結(jié)腸定位釋藥微球能夠在給藥16-36h內(nèi)，將淫羊藿苷藥物聚集在結(jié)腸部位，從而達(dá)到靶向性治療結(jié)腸炎癥的目的。

實(shí)施例6淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球的藥效學(xué)評(píng)價(jià)分析

1、TNBS/乙醇誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的建立

TNBS/乙醇誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型為經(jīng)典的潰瘍性結(jié)腸炎模型。選健康雄性SD大鼠，禁食24h后，按0.3mL/100g腹腔注射10％的水合氯醛麻醉，仰臥固定于大鼠實(shí)驗(yàn)板上，將灌胃針由肛門(mén)輕緩插入深約8cm處，按100mg/kg劑量(即4mL/kg)推入5％TNBS/乙醇溶液。灌入結(jié)腸后保持肛門(mén)高位5分鐘，防止藥物流出，隨即將大鼠放回籠內(nèi)，待自然蘇醒。2、試驗(yàn)藥物

本發(fā)明實(shí)施例2制備的淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球；

陽(yáng)性藥物：地塞米松(片劑)，天津力生制藥股份有限公司(0.75mg/片，共100片)

陽(yáng)性藥物：淫羊藿苷提取物(純度>99％)：南京替斯艾么中藥研究所

3、分組與給藥

將造模成功腸炎大鼠隨機(jī)分為7組，每組8只，分別為空白組(Control)、模型組(Model)、陽(yáng)性藥組地塞米松(DEX，0.2mg/kg)、低劑量組(Low-dose,30mg淫羊藿苷微球/kg)、中劑量組(Medium-dose,60mg淫羊藿苷微球/kg)、高劑量組(High-dose,90mg淫羊藿苷微球/kg)、淫羊藿苷組(50mg淫羊藿苷/kg)。造模成功24h后開(kāi)始灌胃給藥，空白組灌胃給予生理鹽水，模型組灌胃給予生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃給予地塞米松(0.2mg/kg)，淫羊藿苷組灌胃給予淫羊藿苷微球，低劑量組(Low-dose,30mg淫羊藿苷微球/kg)、中劑量組(Medium-dose,60mg淫羊藿苷微球/kg)、高劑量組(High-dose,90mg淫羊藿苷微球/kg)、淫羊藿苷組灌胃給以淫羊藿苷(50mg淫羊藿苷/kg)，連續(xù)給藥6天，末次給藥24h后將大鼠處死，取材。

大鼠灌胃劑量參照《中藥藥理研究方法學(xué)》，用成人每日給藥劑量乘以大鼠換算系數(shù)。4、取材及樣本處理

取材前大鼠禁食24h，10％水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后仰臥固定。沿腹中線(xiàn)切開(kāi)腹壁，曝露腹腔組織，小心分離結(jié)腸(從回盲部到肛口)。切斷結(jié)腸，沿腸系膜縱向剖開(kāi)腸段，冰生理鹽水沖洗后，肉眼觀(guān)察結(jié)腸黏膜形態(tài)，取完整結(jié)腸腸段，用濾紙吸除多余水分，平展于玻璃板上，觀(guān)察結(jié)腸外觀(guān)，切開(kāi)結(jié)腸腸腔后迅速觀(guān)察有無(wú)血性?xún)?nèi)容物，檢查腸黏膜有無(wú)充血水腫、糜爛及潰瘍形成，記錄結(jié)腸黏膜損傷程度并照相，稱(chēng)重，將剩余結(jié)腸段分裝于樣本凍存管中，在液氮中速凍及時(shí)轉(zhuǎn)移至-80℃保存待用(取材操作均在冰上進(jìn)行)。

5、藥效學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果

5.1結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)

剖取大鼠肛門(mén)至盲腸末端的結(jié)腸段，清理腸系膜及粘連組織，沿腸系膜縱軸剪開(kāi)，冰磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗腸內(nèi)殘余糞便，干凈后平鋪于濾紙上以吸去水分，并立即觀(guān)察大體黏膜損傷程度。

CMDI評(píng)分表如表1所示。

表1 CMDI評(píng)分表

結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)的測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)Y(jié)腸炎模型大鼠CMDI的影響結(jié)果

結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組比較，模型組結(jié)腸粘膜損傷較嚴(yán)重，CMDI值較高，而給藥組相應(yīng)的CMDI值均出現(xiàn)顯著性地下調(diào)，陽(yáng)性藥物地塞米松也能夠下調(diào)結(jié)腸炎大鼠CMDI值，給藥高劑量組要優(yōu)于陽(yáng)性藥組；陽(yáng)性藥物淫羊藿苷也能夠 下調(diào)結(jié)腸炎大鼠CMDI值，給藥高劑量組要優(yōu)于陽(yáng)性藥組。本發(fā)明控釋微球與陽(yáng)性藥物淫羊藿苷對(duì)照組相比，有效降低了藥物的使用劑量，同時(shí)能夠使藥物通過(guò)控釋微球到達(dá)結(jié)腸部位，藥物能夠在結(jié)腸部位持續(xù)釋放，而口服給予淫羊藿苷藥物較難到達(dá)結(jié)腸部位，控釋微球不僅能夠?qū)崿F(xiàn)靶向治療，還提高藥物的生物利用度，更有效達(dá)到治療效果。

5.2淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織中炎性相關(guān)因子分泌的影響

將結(jié)腸組織樣本采用蛋白裂解液進(jìn)行蛋白提取，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pierce公司)測(cè)定蛋白含量；采用ELISA法測(cè)定結(jié)腸組織樣本中IL-1β和TNF-α的分泌；IL-1β的濃度采用Rat IL-1βELISA試劑盒(美國(guó)PeproTech公司)進(jìn)行測(cè)定；TNF-α的濃度采用Rat TNF-αELISA試劑盒(美國(guó)eBioscience公司)進(jìn)行測(cè)定，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織IL-1β含量的影響測(cè)定結(jié)果如表3、圖4所示；淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織TNF-α含量的影響如表3、圖5所示。

表3.淫羊藿苷/殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織IL-1β含量的影響

IL-1β主要介導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎初期階段炎癥的產(chǎn)生，可以促使炎性細(xì)胞進(jìn)入結(jié)腸內(nèi)部病變位置。由表2及圖4可以看出，與空白組比較，模型組結(jié)腸組織中的IL-1β明顯升高，具有極顯著性差異(P<0.01)；陽(yáng)性藥地塞米松對(duì)照組和微球給藥治療組均能顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生(P<0.01或P<0.05)，其中載藥微球中劑量組在抑制結(jié)腸炎大鼠IL-1β的產(chǎn)生上具有極顯著性差異(P<0.01)。陽(yáng)性藥物淫羊藿苷對(duì)照組和微球給藥治療組均能顯著抑制IL-1β的產(chǎn)生(P<0.01 或P<0.05)，本發(fā)明的控釋微球有效降低了藥物的使用劑量，同時(shí)能夠使藥物通過(guò)控釋微球到達(dá)結(jié)腸部位，藥物能夠在結(jié)腸部位持續(xù)釋放，而口服給予淫羊藿苷藥物較難到達(dá)結(jié)腸部位，控釋微球不僅能夠?qū)崿F(xiàn)靶向治療，還提高藥物的生物利用度，更有效達(dá)到治療效果。

表4.淫羊藿苷殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球?qū)冃越Y(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸組織TNF-α含量的影響

TNF-α主要啟動(dòng)炎性因子，可以刺激單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等合成其他炎性細(xì)胞因子。由表4和圖5可知，與空白組比較，模型組TNF-α含量明顯升高，具有極顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性藥物地塞米松對(duì)照組和載藥微球高、中、低劑量組TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)，載藥微球高劑量組抑制效果最明顯；陽(yáng)性藥物淫羊藿苷對(duì)照組和載藥微球高、中、低劑量組TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)，載藥微球高劑量組抑制效果最明顯。有效降低了藥物的使用劑量，同時(shí)能夠使藥物通過(guò)控釋微球到達(dá)結(jié)腸部位，藥物能夠在結(jié)腸部位持續(xù)釋放，而口服給予淫羊藿苷藥物較難到達(dá)結(jié)腸部位，控釋微球不僅能夠?qū)崿F(xiàn)靶向治療，還提高藥物的生物利用度，更有效達(dá)到治療效果。