本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種板藍根吲哚醛在抗流感病毒及制備流感病毒介導(dǎo)的炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流感是一種由流感病毒感染引起的急性呼吸道傳染病，具有發(fā)病快、傳染性強等特點，曾多次造成世界范圍的大流行，嚴(yán)重危害人類和動物生命健康。流感病毒感染初期，病毒誘導(dǎo)天然免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量促炎反應(yīng)細胞因子參與機體免疫應(yīng)答，但過量的炎癥因子可導(dǎo)致大量細胞凋亡、毛細管通透性提高、白細胞滲出、肺水腫和氣道堵塞等炎癥連鎖反應(yīng)(即“細胞因子風(fēng)暴”)，細胞因子風(fēng)暴會加重肺組織損傷，嚴(yán)重時會導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)。

許多研究結(jié)果表明，高致病性流感病毒感染導(dǎo)致死亡的原因更多的是因為病毒感染誘導(dǎo)宿主過度的免疫反應(yīng)造成的病理損傷，而非病毒復(fù)制所致的直接細胞損傷。因此，在病毒感染致病過程中，若能及時調(diào)節(jié)宿主的炎癥免疫反應(yīng)，最大限度地減少免疫過度導(dǎo)致的肺損害，則可顯著減緩病毒感染引起的癥狀，減少人或動物的死亡。目前臨床上批準(zhǔn)用于抗流感病毒藥物兩類藥物(M2離子通道抑制劑和神經(jīng)氨酸酶抑制劑)均以流感病毒的重要蛋白為作用靶點，對宿主無調(diào)節(jié)作用，因此沒有直接抑制流感病毒誘導(dǎo)的炎癥的作用。而臨床上中醫(yī)藥具有多成分、多環(huán)節(jié)的作用特點，不僅具有直接抗病毒作用，還能調(diào)節(jié)病毒引起免疫病理損傷的復(fù)雜過程，在流感的治療中具有獨特的優(yōu)勢。吲哚醛是板藍根的主要單體成分之一，既往臨床經(jīng)驗及大量實驗研究證明板藍根在流感治療中具有良好效果，并且，板藍根中的有效成分具有調(diào)節(jié)宿主免疫的功能。

因此，從板藍根中分離制備篩選出有效的抑制流感病毒以及抗流感病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的有效成分，探究其獨特的作用機制，對于抗流感病毒藥物研發(fā)以及我國中藥的發(fā)展具有重大的意義。

目前從板藍根中分離和提純得到的吲哚醛的結(jié)構(gòu)式為：

關(guān)于吲哚醛在抑制流感病毒以及抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生中的應(yīng)用未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供吲哚醛的新應(yīng)用，即吲哚醛在抗流感病毒或者制備由流感病毒介導(dǎo)的炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用，為臨床治療流感性疾病提供新的途徑。

進一步的，所述吲哚醛對流感病毒的增殖具有抑制作用，具體如抑制人流感病毒H1N1(PR8標(biāo)準(zhǔn)株)，還具有抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生的作用，具體如抑制人流感病毒H1N1(PR8標(biāo)準(zhǔn)株)感染人氣道上皮細胞(16HBE)后炎癥因子的表達，本發(fā)明也進一步提供吲哚醛在制備上述作用藥物中的應(yīng)用。炎癥因子包括但不限于IL-6、IP-10、RENTES。

所述流感病毒包括但不局限于甲、乙型流感病毒和禽流感病毒；所述甲、乙型流感病毒和禽流感病毒包括但不局限于人流感H1N1亞型(PR8標(biāo)準(zhǔn)株)，新型甲型H1N1亞型，H3N2亞型以及IFN B型，以及禽流感病毒H9N2亞型。

進一步的，所述吲哚醛可為從天然植物板藍根中提取的。

進一步的，所述藥物可制成藥學(xué)上允許的任意劑型，其劑型例如為片劑、膠囊等。

本發(fā)明還提供一種用于治療流感或由流感病毒介導(dǎo)的炎癥的藥物，所述藥物其活性成分包括前文所述的吲哚醛。

本發(fā)明為臨床治療流感病毒性疾病提供一種安全有效、毒副作用小的藥物。

本發(fā)明采用空斑減少試驗法在治療模式下驗證提取自板藍根的吲哚醛對流感病毒復(fù)制的抑制作用，以磷酸奧司他韋為陽性對照藥。觀察吲哚醛對MDCK細胞的毒性以及對流感病毒復(fù)制的抑制作用，利用MTT法測得提取自板藍根的吲哚醛的半數(shù)有毒濃度(TC₅₀)為335.57μg/mL?？瞻邷p少試驗結(jié)果顯示吲哚醛在25-100μg/mL范圍內(nèi)顯著的抑制了甲型流感H1N1增殖。

本發(fā)明對吲哚醛作用于宿主細胞抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子產(chǎn)生的作用進行了探討，采用ELISA的方法研究藥物抑制流感病毒刺激人氣道上皮細胞(16HBE)后炎癥因子的表達。結(jié)果顯示吲哚醛在100μg/mL顯著的降低了流感病毒H1N1(PR8)刺激16HBE細胞24小時后的炎癥因子水平。吲哚醛在濃度為100μg/mL時既可以抑制流感病毒在MDCK細胞中的復(fù)制，也可以抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子的表達；在濃度為50μg/mL和25μg/mL時對炎癥因子的表達沒有抑制作用，但是能有效的抑制流感病毒的復(fù)制。

附圖說明

圖1顯示的是吲哚醛在MDCK細胞上的對H1N1(PR8)流感病毒復(fù)制的抑制作用；

圖2A-2D顯示的是藥物對人氣道上皮細胞(16HBE)藥物毒性和藥物作用24小時后抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子的蛋白表達。

具體實施方式

為更好理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明內(nèi)容作進一步說明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實例。

實施例1吲哚醛單體成分分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定

吲哚醛分離流程：

乙酸乙酯部分30g，以硅膠(200-300目)拌樣，揮干后進行硅膠柱層析(200-300目，10×20cm)，用石油醚-乙酸乙酯作流動相梯度洗脫(1:1-0:1,v/v)，最后用甲醇洗脫。每500ml接一組份，各洗脫液分別減壓回收溶劑，以TLC進行檢測，合并組成相似的洗脫液，共得到8個部分Fr.A-Fr.H。

各組份再以分析性HPLC檢測合并Fr.B～Fr.D。Fr.B～Fr.D棕褐色膏狀物，約7.8g，以硅膠(200-300目)拌樣，揮干后進行硅膠柱層析(200-300目)，用石油醚-乙酸乙酯作流動相梯度洗脫(10:1-8:1-3:1-3:2-0:1,v/v)。每100ml接一組份，各洗脫液分別減壓回收溶劑，以TLC進行檢測，合并組成相似的洗脫液，得到7個組份，F(xiàn)r.1～Fr.7。

Fr.3用甲醇溶解拌硅膠(200～300目)，揮干后上硅膠柱(200～300目)，以石油醚-乙酸乙酯做流動相梯度洗脫(3:1-3:2-3:2,v/v)，最后用甲醇沖柱，石油醚-乙酸乙酯(3:1)洗脫部分用制備型高壓液相分離，以甲醇-水做流動相梯度洗脫，得到28個組份，以分析型高壓液相檢查，從15～17組份得到淡黃色結(jié)晶，經(jīng)甲醇重結(jié)晶后得到化合物B14(3-吲哚醛，4.3mg)

吲哚醛結(jié)構(gòu)測定：

淡黃色結(jié)晶(甲醇)，mp113～115℃。核磁氫譜顯示有6個質(zhì)子信號，均處于低場。¹H-NMRδ:8.18(1H,d,J＝1.6Hz),7.50(1H,d,J＝1.6Hz),7.30(2H,m)為苯環(huán)AA’BB’偶合系統(tǒng)的質(zhì)子信號。δ9.90(1H,s)為尖銳的單峰符合醛基質(zhì)子信號化學(xué)位移數(shù)值，δ8.12(1H,s)對應(yīng)吲哚環(huán)上的質(zhì)子信號。根據(jù)參考文獻[1]鑒定為3-吲哚醛。([1]左麗,李建北,徐景等.板藍根的化學(xué)成分研究.中國中藥雜志,2007,32(8):688-691.)

下面提供的試驗例對吲哚醛所具有的新功效加以證實，用于進一步闡明本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。

試驗例1吲哚醛體外抗流感病毒活性

1.1.材料

1.1.1藥物陽性對照藥：磷酸奧司他韋：購自美國GIBCO公司，貨號Y0001337；實驗藥物--吲哚醛：板藍根生藥材由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供，采自黑龍江大慶及安徽阜陽板藍根GAP基地，由中國科學(xué)院華南植物院葉華國研究員鑒定為菘藍Isatis infigotica Fort.的根，即板藍根。將其按照實施例1進行提取、純化、鑒定，獲得吲哚醛提取物。

1.1.2細胞狗腎細胞(MDCK)引自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；該菌種保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：C201561；分類學(xué)命名：狗腎細胞(MDCK NS1)；保藏地址：中國武漢市武漢大學(xué)；郵政編碼：430072，保藏日期：2015年05月21日。

人喉癌細胞引自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；該菌種保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：C201562；分類學(xué)命名：人喉癌細胞(Hep-2NS2)；保藏地址：中國武漢市武漢大學(xué)；郵政編碼：430072，保藏日期：2015年05月21日。

1.1.3流感病毒株甲型H1N1流感病毒PR8株(A/PR/8/34，H1N1)、甲型H3N2流感病毒Aichi株(A/Aichi/2/68，H3N2)均購自美國經(jīng)典培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)；新甲型H1N1流感病毒株(A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1，Genebank No.HM014332.1)、乙型流感病毒(B/Guangzhou/GIRD08/09)為本室臨床分離株，甲型流感病毒H7N3(A/Duck/Guangdong/1994，H7N3)、H9N2(A/Chicken/Guangdong/1996，H9N2)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院陳建新教授惠贈。上述毒株流感病毒通過接種于9日齡的雞胚尿囊腔中擴增，35℃孵育2d，收獲尿囊液。用MDCK細胞滴定病毒，以細胞病變抑制法(CPE)判定這些毒株的半數(shù)感染量(TCID₅₀/100μL)作為病毒原始滴度。

1.1.4試劑DMSO(美國SIGMA公司)；MEM(美國GIBCO公司)批號：8114414；胎牛血清(美國GIBCO公司)批號：10099；PBS(美國GIBCO公司)批號：20150122；1mg/ml TPCK批號：20140220購自廣州捷倍斯生物科技有限公司。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2)購自Genebase。

1.2.實驗方法

1.2.1藥物溶解吲哚醛，以DMSO溶解配制成工作母液(濃度500mg/mL)，置4℃保存；陽性藥物磷酸奧司他韋用DMEM培養(yǎng)液溶解，過濾后置4℃保存。

1.2.2.藥物毒性實驗(MTT法)

按每孔約2.5×10⁴MDCK細胞接種到96孔板，24h后待細胞長成單層后，棄去培養(yǎng)液，加入不同稀釋度的藥物100μL/孔，空白對照和正常細胞對照孔加入100μL/孔MEM，37℃，5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)36-48小時，每孔加MTT溶液(5mg/mL)20μL，置37℃，5％CO₂溫箱中繼續(xù)孵育4小時。吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加100μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值。

按照下列公式計算抑制率，并用Reed-Muench法計算50％毒性濃度為藥物半數(shù)有毒濃度(TC₅₀)。

抑制率＝[(正常組平均OD值－空白組平均OD值)－(給藥組平均OD值－空白組平 均OD值)]/(正常組平均OD值－空白組平均OD值)×100％。

1.2.3.藥物體外抗流感病毒活性試驗

如圖1所示，以細胞空斑減少試驗法研究吲哚醛對甲型H1N1流感病毒(PR8)的抑制作用。長滿單層的96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的MDCK細胞吸附病毒2小時，同時設(shè)定陽性藥物和細胞對照。細胞吸附病毒2h后，將藥物稀釋于2X MEM中(除病毒和細胞對照外)，混合1.6％瓊脂，使其室溫冷卻至40℃，加入終濃度為1.5μg/mL的TPCK胰酶，然后將混合液加入細胞板中，在37℃5％CO₂環(huán)境下倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天，當(dāng)出現(xiàn)白色斑點后，加入稀釋好的中性藍染料37℃作用4小時或者過夜，吸取染料后計算空斑數(shù)，并計算出藥物對流感病毒的IC₅₀。

1.2.4吲哚醛對不同亞型流感病毒的體外抑制作用

以細胞病變抑制法(Cytopathic Effect Reduction Method)研究吲哚醛對不同亞型流感病毒的抑制作用。長滿單層的96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的MDCK細胞吸附病毒2小時，同時設(shè)定陽性藥物和細胞對照。細胞吸附病毒2h，加入不同濃度藥物(除病毒和細胞對照外)在37℃5％CO₂環(huán)境下培養(yǎng)。

細胞出現(xiàn)病變程度按以下6級標(biāo)準(zhǔn)記錄：-為細胞生長正常，無病變出現(xiàn)；±為細胞病變少于整個單層細胞的10％；+為細胞病變約占整個單層細胞的25％；++為細胞病變約占整個單層細胞的50％；+++為細胞病變約占整個單層細胞的75％：++++為細胞病變約占整個單層細胞的75％以上。用Reed-Muench法計算半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)，并以選擇指數(shù)SI表示(SI＝TC₅₀/IC₅₀),SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示無效。

1.3.實驗結(jié)果

1.3.1細胞毒性

利用MTT法測得受試藥物的半數(shù)有毒濃度(TC₅₀)為335.57μg/mL；見表1。

1.3.2吲哚醛對不同亞型流感病毒的體外抑制作用

空斑減少試驗結(jié)果顯示：吲哚醛對甲型流感病毒H1N1(PR8)有抑制作用，藥物在25μg/mL-100μg/mL都顯著地減少了流感病毒空斑的形成。如圖1所示。

1.3.3藥物體外抑制流感病毒藥效

細胞病變抑制試驗實驗結(jié)果表明：吲哚醛在治療模型下對多種亞型流感病毒，包括甲型，乙型流感病毒，甲型流感病毒包括人流感病毒和禽流感病毒均有抑制作用，詳見表1。

表1吲哚醛體外對不同亞型流感病毒藥效作用

注：選擇指數(shù)(SI)，SI>2表示低毒高效；SI：1～2表示高毒低效；SI<1表示無效。

試驗例2吲哚醛在氣道上皮細胞中抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)實驗

2.1實驗材料

2.1.1藥物受試樣品：吲哚醛。

2.1.2細胞人氣道上皮細胞(16HBE)購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

2.1.3病毒株普通甲型H1N1流感病毒(A/PR/8/34,H1N1)購自ATCC，以Reed-Muench法測定其感染復(fù)數(shù)(M.O.I)，以M.O.I＝1作為病毒滴度感染細胞。

2.1.4試劑DMEM培養(yǎng)基(批號：8114176)；PBS(批號：20150122)，胎牛血清(批號：10099)均購自GIBCO公司；TPCK(批號：20140220)購自廣州捷倍斯公司。ELISA試劑盒購買自RayBio公司，Cat ELH-IP-10；ELH-CCL-5。

2.2實驗方法

2.2.1 16HBE細胞培養(yǎng)

將正常人氣道上皮細胞(16HBE)接種于100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，用10％DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，5％CO₂，飽和濕度條件下在細胞孵育箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長進入對數(shù)增殖期時，收集細胞。對收集的細胞進行計數(shù)后，以每孔2×10⁵個/mL的密度接種于直徑15.6mm的24孔板細胞培養(yǎng)皿中，24小時后顯微鏡下觀察細胞貼壁、生長良好。換1％DMEM高糖培養(yǎng)基將細胞饑餓培養(yǎng)24小時后進行下一步病毒和藥物刺激實驗，加刺激物時，將細胞培養(yǎng)基換成不含胎牛血清的培養(yǎng)基。

2.2.2病毒和藥物刺激

細胞貼壁24小時后，PBS沖洗2遍，用不含血清的DMEM將甲型流感病毒H1N1(PR8)稀釋至M.O.I＝1，每孔加入0.5mL病毒液，37℃貼壁2小時。用不含胎牛血清但是含0.4ug/mL TPCR酶的DMED稀釋藥物，每孔加入1mL，作用24小時后收集細胞上清液。

2.2.3檢測藥物對16HBE細胞毒性試驗(MTT法)

16HBE細胞以每孔2×10⁵個/mL的密度接種于直徑6.94mm的96孔板細胞培養(yǎng)皿中，24小時后顯微鏡下觀察細胞貼壁、生長良好。不含血清的DMEM2倍梯度稀釋藥物，作用48 小時后，MTT法(同上述)檢測藥物毒性。

2.2.4細胞培養(yǎng)基中炎癥因子蛋白ELISA方法檢測

按照ELISA試劑盒產(chǎn)品說明書操作：

1)試劑取出平衡至室溫，加入樣品，室溫孵育2.5小時或者4℃過夜；

2)Washing buffer沖洗4次；

3)加入稀釋好的biotinylated antibdy100μL室溫作用1小時；

4)Washing buffer沖洗5次，加入稀釋好的Streptavidin solution100μL,室溫作用45分鐘；

5)加入TMB顯色液，室溫反應(yīng)30分鐘；加入500μL的Stop Solution終止反應(yīng)，全波長酶標(biāo)儀讀數(shù)(450nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中炎癥因子蛋白的含量。

2.3實驗結(jié)果

2.3.1藥物對16HBE細胞藥物毒性

MTT法檢測藥物作用于16HBE細胞48小時后，400μg/mL濃度對細胞毒性大，100μg/mL對細胞略有毒性，但是50μg/mL濃度以下對16HBE細胞無毒性。見圖2A所示。

2.3.2藥物作用24小時后抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子的表達

吲哚醛在濃度為100μg/mL顯著地抑制炎癥因子(如IL-6，IP-10，RENTES等)的產(chǎn)生，在藥物濃度為100μg/mL時，對IL-6蛋白能減低約70％的表達量，對IP-10蛋白的表達量也有約65％的減低，200μg/mL的吲哚醛降低了RENTES蛋白50％的表達量(和病毒組相比)(如圖2B，圖2C，圖2D所示)。結(jié)果表明：檢測藥物--吲哚醛能有效的抑制流感病毒介導(dǎo)的炎癥因子的產(chǎn)生。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，故凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。