本發(fā)明涉及一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物及制備方法及用途，屬于醫(yī)藥保健品技術應用領域。

背景技術：

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在消化系統(tǒng)中列第三位，僅次于胃癌和食管癌。我國每年大約有36萬新增的肝癌病例，嚴重威脅了國民身體健康和生活質量。目前的治療方案一般采取手術方法，并配合化療。但是肝癌治療中存在的缺點比如早期癥狀不明顯導致一般初次診療就為癌癥晚期，并且治療所用到的化學藥物會引起正常細胞和其他臟器損害。相比之下，中藥抗腫瘤具有獨特的優(yōu)勢，有驅邪、扶正或增效、減毒的作用，所以中藥預防和對抗腫瘤一直是抗肝癌研究的熱點。

大蒜為百合科蔥屬植物，它既是人們喜歡的食物，又是一種廣泛用于治療各種疾病的藥用植物，有“天然保健食品”之稱。大蒜防癌抗癌的歷史悠久，其主要的治療作用集中在含硫化合物成分上，研究和應用較多的是大蒜的脂溶性成分大蒜油和大蒜油的主要有效成分二烯丙基三硫和二烯丙基二硫化合物。含硫化合物具有阻滯腫瘤細胞周期、增效化療藥物等多種抗腫瘤作用。

綠蒜作為一種大蒜衍生產(chǎn)品，國內(nèi)外學者對于綠蒜的綠變機理及其理化性質做了相關研究，證實蒜瓣在醋酸的作用下，細胞膜以及液泡膜的通透性增加，導致位于液泡內(nèi)的蒜酶與細胞質中的底物接觸，從而誘發(fā)一系列化學反應，產(chǎn)生硫代亞磺酸酯，然后硫代亞磺酸酯繼續(xù)與氨基酸或其他的化合物反應綠色物質?，F(xiàn)有報道關于綠蒜的制備方法有傳統(tǒng)的臘八蒜腌制方法，臘八蒜具有抗氧化、抗菌和助消化等活性。然而，對于綠蒜中含硫化合物的含量和藥理作用特別是抗肝癌活性，卻未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的在制備保健品中的用途。

本發(fā)明的技術方案概述如下：

一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取新鮮去皮大蒜瓣，于2-6℃下放置12天-16天，粉碎，常溫放置30-60min，加入1.5-2質量倍的體積濃度為5％-6％的食品級弱酸水溶液，混勻，在40-60℃條件下加熱30-40min，再在70-80℃加熱30-40min，固液分離，得到綠變大蒜；

(2)向綠變大蒜中加入2-5質量倍的體積濃度為70％-80％的乙醇水溶液，在18-25℃條件下浸泡提取，提取2-4次，每次20-24h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加1-3體積倍水混懸，加入混懸液體積1-3倍的有機溶劑萃取，萃取3-4次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

弱酸優(yōu)選醋酸、蘋果酸或檸檬酸。

有機溶劑優(yōu)選正己烷、石油醚和乙酸乙酯中至少一種。

上述方法制備的具有抗肝癌作用的綠蒜提取物。

上述具有抗肝癌作用的綠蒜提取物在制備保健品中的用途。

本發(fā)明的優(yōu)點：

(1)快速制備綠蒜，并用一種或者幾種有機試劑提取，提取物含硫化合物含量為85％以上。

(2)綠蒜提取物能顯著抑制肝癌細胞SMMC-7721的生長，同時針對H22荷瘤小鼠，有較強的抗腫瘤效果，用藥后毒副作用降低，且增強了機體的免疫力。

附圖說明

圖1：綠蒜提取物對H22荷瘤小鼠的瘤體積的影響

圖2：H22荷瘤小鼠腫瘤形狀

圖3：綠蒜提取物對H22荷瘤小鼠的水食效率的影響

圖4：H22荷瘤小鼠腫瘤病理切片，其中的A為模型組、B為陽性對照組、C為低劑量組、D為中劑量組、E為高劑量組。

具體實施方式：

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的闡述，但本發(fā)明并不受限于此，在不脫離本發(fā)明的思想和宗旨的情況下，對本發(fā)明的技術方案所做的任何變化都應落入本發(fā)明權利要求書所限定的范圍內(nèi)。

實施例1

一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取新鮮去皮大蒜瓣，于4℃下放置14天，粉碎，常溫放置45min，加入1.8質量倍的體積濃度為5％的食品級醋酸水溶液，混勻，在50℃條件下加熱35min，再在75℃加熱35min，固液分離，得到綠變大蒜；

(2)向綠變大蒜中加入3質量倍的體積濃度為75％的乙醇水溶液，在20℃條件下浸泡提取，提取3次，每次22h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加2體積倍水混懸，加入混懸液體積2倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

綠蒜提取物含硫化合物含量為89.63％。

對比例

(步驟(1)、(2)、(3)、(4)為現(xiàn)有技術)

一種制備綠色大蒜的方法，包括如下步驟:

(1)將收獲的大蒜蒜頭在8℃冷藏20天進行低溫預處理；

(2)挑選無霉變、無蟲蛀的蒜頭，散瓣脫皮得到蒜米，用清水清洗干凈，粉碎；

(3)取食品級冰醋酸加水，配成醋酸體積濃度為4.5％的溶液為腌漬液；

(4)按照每1kg蒜末與1.2L腌漬液的用量關系將蒜末浸入腌漬液中，加熱至60℃溫育2h，得到綠色大蒜。

(5)(按實施例1步驟(2)進行提取)：

向綠變大蒜中加入3質量倍的體積濃度為80％的乙醇水溶液，在20℃條件下浸泡提取，提取3次，每次24h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加1體積倍水混懸，加入混懸液體積1倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

綠蒜提取物含硫化合物含量為65.33％。

實施例2

一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取新鮮去皮大蒜瓣，于2℃下放置16天，粉碎，常溫放置60min，加入1.5質量倍的體積濃度為6％的食品級蘋果酸水溶液，混勻，在40℃條件下加熱40min，再在70C加熱40min，固液分離，得到綠變大蒜；

(2)向綠變大蒜中加入2質量倍的體積濃度為80％的乙醇水溶液，在25℃條件下浸泡提取，提取4次，每次20h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加2體積倍水混懸，加入混懸液體積1倍的有機溶劑(有機溶劑為正己烷和石油醚按體積比為1：1的混合物)萃取，萃取3次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

綠蒜提取物含硫化合物含量為85.07％。

實施例3

一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取新鮮去皮大蒜瓣，于6℃下放置12天，粉碎，常溫放置30min，加入2質量倍的體積濃度為5％的食品級檸檬酸水溶液，混勻，在60℃條件下加熱30min，再在80℃加熱30min，固液分離，得到綠變大蒜；

(2)向綠變大蒜中加入5質量倍的體積濃度為70％的乙醇水溶液，在18℃條件下浸泡提取，提取2次，每次24h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加3體積倍水混懸，加入混懸液體積2倍的乙酸乙酯萃取，萃取4次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

綠蒜提取物含硫化合物含量為85.72％。

實施例4

一種具有抗肝癌作用的綠蒜提取物的制備方法，包括如下步驟：

(1)取新鮮去皮大蒜瓣，于4℃下放置14天，粉碎，常溫放置50min，加入1.5質量倍的體積濃度為5.5％的食品級醋酸水溶液，混勻，在50℃條件下加熱40min，再在75℃加熱35min，固液分離，得到綠變大蒜；

(2)向綠變大蒜中加入4質量倍的體積濃度為75％的乙醇水溶液，在25℃條件下浸泡提取，提取2次，每次24h，合并提取液，濃縮至浸膏無醇味，加1體積倍水混懸，加入混懸液體積3倍的正己烷萃取，萃取3次，合并萃取液，濃縮至干得到提取物。

綠蒜提取物含硫化合物含量為86.14％。

實施例5

本發(fā)明具有抗肝癌作用的綠蒜提取物對肝癌細胞SMMC-7721抑制率的影響。

實驗目的

檢測具有抗肝癌作用的綠蒜提取物對肝癌細胞SMMC-7721抑制率的影響。

實驗材料

1.受試物：將實施例1、2、3、4所制備的綠蒜提取物，準確稱量各受試物，用二甲基亞砜溶解，配成濃度為0.10mg/ml的貯存液，在-20℃下保存，使用時用二甲基亞砜稀釋成濃度為0.02,0.04,0.06,0.08和0.10mg/ml的溶液。

2.試劑：DMEM培養(yǎng)基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS緩沖液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余試劑均為市售。

3.細胞株：人源性SMMC-7721肝癌細胞購自上海細胞庫。

4.儀器：CO₂培養(yǎng)箱(BPN-80CW)：上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1FD)：蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡(BDS-200)：重慶奧特光學儀器有限公司。酶標儀(DNM-9602)：北京普朗醫(yī)療設備有限公司。

實驗方法：

MTT法檢測受試物對肝癌細胞SMMC-7721抑制率的影響。

1.常規(guī)培養(yǎng)細胞

1.1細胞復蘇

該步驟中，分別對肝癌細胞SMMC-7721進行復蘇操作，具體操作如下：

實驗前，將超凈工作臺的臺面用紫外線照射30min，將水浴鍋加水并預熱至37℃，然后將完全培養(yǎng)基(含10％(v/v)牛血清和1％(v/v)青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)置于水浴鍋預熱。取出凍存的細胞株，迅速將凍存管放入已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并不斷的搖動，使管內(nèi)的液體迅速融化，約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出，用含75％(體積分數(shù))乙醇的棉球擦拭凍存管外壁。吸取凍存管內(nèi)細胞，轉移至15mL離心管中，同時加入5mL預熱完全培養(yǎng)基，1000r/mim離心3min，棄上清液，將離心管內(nèi)加入10mL完全培養(yǎng)基，輕柔吹打成細胞懸液。通過細胞計數(shù)并進行活力測定后，將細胞懸液加入10cm培養(yǎng)皿中，于5％CO₂，飽和濕度、37℃的CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

1.2細胞培養(yǎng)與傳代

采用完全培養(yǎng)基將1.1所得細胞進行培養(yǎng)。將生長狀態(tài)對數(shù)期的細胞的原培養(yǎng)液棄去，加入2-3mL PBS緩沖液，輕柔晃動培養(yǎng)皿，然后棄去。加入0.25％(w/v)的胰酶，放入37℃的CO₂恒溫箱，消化1-2min，再加入3-5ml培養(yǎng)基終止消化，并將貼壁細胞吹打至懸浮，按1:3分裝，于37℃，5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3MTT法測試細胞活力的步驟如下：

(1)收集對數(shù)生長期細胞，在96孔板中每孔加入100μL細胞懸液，每孔細胞數(shù)約為5×10³個/孔,孔邊緣用無菌PBS溶液填充。

(2)37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加入不同濃度的綠蒜提取物，空白對照(新鮮大蒜按實施例1步驟(2)提取獲得)和陽性對照藥(紫杉醇)，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育72h。

(3)棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗一次，然后每孔加入含有0.5mg/ml的MTT 100μL，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。

(4)將96孔板孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸去，然后每孔加100μL二甲基亞砜。用酶標儀進行檢測，檢測波長為490nm。

細胞抑制率(％)＝【1-(受試組OD值/對照組OD值)】×100％

實驗結果：

表1：本發(fā)明得到的受試物對SMMC-7721細胞抑制率的IC₅₀值。

實驗結果表明按實施例制備獲得的綠蒜提取物對肝癌細胞SMMC-7721的生長具有良好的抑制作用。

實施例6

本發(fā)明綠蒜提取物對小鼠肝癌H22移植性腫瘤生長的影響。

實驗目的：

檢測綠蒜提取物對小鼠肝癌H22移植性腫瘤生長的影響。

實驗材料：

1.受試物：實施例1、2、3、4獲得的綠蒜提取物。準確稱量綠蒜提取物，用0.5％的CMC-Na溶液制成濃度為15mg/mL的混懸液，在-20℃下保存，使用時用生理鹽水將提取物物稀釋成3，6和12mg/mL的低中高三個劑量的溶液；環(huán)磷酰胺：江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司(批號15101225)；0.9％氯化鈉注射液(生理鹽水)：河北天成藥業(yè)股份有限公司(批號A15100801)；

2.試劑：DMEM培養(yǎng)基：Gibco(USA)，10％胎牛血清：Gibco(USA)；PBS緩沖液：Solarbio(Beijing)；MTT：Solarbio(Beijing)；其余試劑均為市售。

3.動物及瘤株：雄性昆明種小鼠，體重20±2g，共40只，動物合格證SCXK(京)2014-0004，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。鼠源性H22肉瘤細胞：購自上海細胞庫。

4.儀器：CO₂培養(yǎng)箱(BPN-80CW)：上海一恒科學儀器有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1FD)：蘇州凈化設備有限公司；倒置顯微鏡(BDS-200)：重慶奧特光學儀器有限公司。紫外分光光度計(UV-9200)：北京瑞利分析儀器廠。酶標儀(DNM-9602)：北京普朗醫(yī)療設備有限公司。

實驗方法及結果：

1.受試物對H22實體瘤的抑制作用

取凍存的H22小鼠肝癌細胞，置于37℃恒溫水浴中解凍，離心，收集細胞，用PBS緩沖液洗滌兩次，再用PBS液重懸細胞，經(jīng)ICR小鼠腹腔傳3代以上，腹水長出后，在無菌條件下抽取瘤液，瘤液與生理鹽水按體積比1:1的比例稀釋并充分混合得到細胞懸液。用臺盼蘭染色后，在血細胞計數(shù)器上計數(shù)，其中活細胞數(shù)大于95％，用生理鹽水調整細胞懸液的濃度為1×10⁷個瘤細胞/mL。然后將調整好濃度的細胞懸液按0.2mL/只接種于小鼠右前肢腋窩皮下，構建實體瘤動物模型，得到H22荷瘤小鼠。接種后次日隨機分組，每組8只，受試物組(低中高三個劑量)，模型組(生理鹽水)和陽性對照藥組(25mg/kg)。小鼠灌胃給藥，每天一次，劑量0.01mL/g(給藥體積/小鼠體重)連續(xù)給藥給藥14天，給藥期間，每隔2到3天用游標卡尺測量腫瘤的最大直徑a、最小直徑b，按V＝1/2×a×b²計算瘤體積，繪制小鼠腫瘤生長曲線。實驗結果見表2、圖1；于第15天稱取各小鼠的體重，摘除眼球取血，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤、脾臟、胸腺并稱重，按以下各式計算腫瘤抑制率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。腫瘤拍照。實驗結果見表2-4，腫瘤照片見圖2。

腫瘤抑制率(％)＝(1－給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100％

脾臟指數(shù)(mg/g)＝脾臟重量/體重

胸腺指數(shù)(mg/g)＝胸腺重量/體重

表2實驗各組小鼠給藥期間腫瘤體積

實施例1各組小鼠給藥期間腫瘤體積如表2所示，圖1是各組小鼠的瘤體積隨觀察天數(shù)的變化曲線，結果表明，本發(fā)明的綠蒜提取物能減緩小鼠移植性腫瘤的生長速度，對腫瘤的生長曲線有阻礙作用，且中劑量綠蒜提取物效果明顯。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物能減緩小鼠移植性腫瘤的生長速度，對腫瘤的生長有阻礙作用。

表3.實驗各組小鼠的瘤重及腫瘤的抑制率

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表3所示的實驗數(shù)據(jù)可知，與模型組相比，實施例1的綠蒜提取物物對小鼠H22實體瘤有明顯的抑制作用(P<0.001)，隨著用藥劑量的增加，抑瘤作用增強；中劑量組的抑瘤率接近陽性對照藥且在三個劑量中表現(xiàn)出較強的抑瘤效果。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物對小鼠H22實體瘤有明顯的抑制作用。

表4.實驗各組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs模型組；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001vs陽性對照藥組

由表4的實驗結果可知，實施例1的綠蒜提取物的中劑量提取物可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高了小鼠的固有免疫力。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物的中劑量可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高了小鼠的固有免疫力。

本發(fā)明藥物對荷瘤小鼠生存質量的影響

實驗方法及結果：

每日測定小鼠的體重，攝食量及攝水量。計算小鼠的水食效率。攝食效率＝(增長的體重/攝食量)×100％；攝水效率＝(增長的體重/攝水量)×100％。實驗結果見圖3。

由圖3可知，與陽性對照藥相比，實施例1的綠蒜提取物可以顯著提高荷瘤小鼠的水食效率(P<0.001)，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存質量。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物可以顯著提高荷瘤小鼠的水食效率，很大程度地改善了荷瘤小鼠的生存質量。

本發(fā)明藥物對荷瘤小鼠肝臟中相關酶的影響

實驗方法及結果：

測肝組織勻漿中過氧化氫(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)的活力及丙二醛(MDA)的含量。測定試劑盒購買于南京建成生物工程研究所(貨號依次為：A007-1；A005；A001-3；C009-2；C010-2；A003-1)。各組小鼠肝臟中相關酶的含量如表5所示。

表5實驗各組小鼠肝臟中相關酶的含量

由表5的結果可知，本發(fā)明實施例1的綠蒜提取物可以提高肝臟中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝臟MDA的水平，其中，中劑量的綠蒜提取物效果最佳。另外，本發(fā)明的提取物可以顯著降低肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活力，降低肝毒性，減少肝臟炎癥的產(chǎn)生。與模型組相比，陽性藥組小鼠肝臟中轉氨酶升高，這表明化療藥環(huán)磷酰胺對肝臟有較大的毒性。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物能提高肝臟中抗氧化酶CAT、GSH-Px、SOD的活力，降低肝臟MDA的水平，中劑量綠蒜提取物效果最佳?？梢燥@著降低肝臟中谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的活力，降低肝毒性，減少肝臟炎癥的產(chǎn)生。與模型組相比，陽性藥組小鼠肝臟中轉氨酶升高，這表明化療藥環(huán)磷酰胺對肝臟有較大的毒性。

本發(fā)明的提取物對荷瘤小鼠血清中免疫因子含量的影響

實驗方法及結果：

各組小鼠停藥后次日采用眼球摘除法取血，靜置后離心分離血清，E L I S A法檢測荷瘤小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細胞介素(IF-2)和腫瘤壞死因子(TNF-α)的含量，結果見表6。

表6.實驗各組小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子、白細胞介素2和腫瘤壞死因子α的含量

注：^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001vs模型組；^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001vs陽性對照藥組

由表6可知，本發(fā)明的實施例1綠蒜提取物可以降低腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達，提高白細胞介素2和腫瘤壞死因子α的表達，提高機體免疫力。

實驗證明，實施例2、3、4的綠蒜提取物可以降低腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達，提高白細胞介素2和腫瘤壞死因子α的表達，提高機體免疫力。

實施例1荷瘤小鼠的腫瘤病理切片見圖4(A-E分別代表：模型組、陽性對照藥組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)

給藥組腫瘤細胞生長不如模型組活躍，部分緊密排列，部分較松散，高劑量組表現(xiàn)出多發(fā)灶性及大片狀腫瘤組織壞死，可見較大部分凝固性壞死，腫瘤周邊可見血管、纖維組織增生；少量炎細胞浸潤。

實施例2、3、4的綠蒜提取物對荷瘤小鼠的腫瘤病理切片結果與實施例1結果相似。