本發(fā)明涉及一種含脲橋的苯甲酰胺類衍生物即3-溴-N-((2-胺基甲酰基苯基)胺基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在過去幾十年，雜環(huán)化合物擁有廣泛和多樣的生物活性，特別是吡啶和吡唑化合物。許多文獻(xiàn)都報(bào)道了吡唑類化合物表現(xiàn)出廣泛的生物活性，包括抗結(jié)核活性，抗腫瘤活性，殺菌活性，抗炎活性，抗氧化活性，抑制膽堿酯酶活性，殺蟲活性等。吡唑環(huán)存在于許多合成藥物或殺蟲劑中。此外，吡啶類衍生物也展現(xiàn)出優(yōu)秀的生物活性，比如殺菌活性，除草活性，殺蟲活性等。目前許多文獻(xiàn)也報(bào)道了吡唑連吡啶結(jié)構(gòu)，而酰胺類化合物在新農(nóng)藥的創(chuàng)制中占有重要地位，而其對(duì)抗癌藥物中的作用未見相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明目的是提供一種含脲橋的苯甲酰胺類衍生物即3-溴-N-((2-胺基甲酰基苯基)胺基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。

所述的一種含脲橋的苯甲酰胺類衍生物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述含脲橋的苯甲酰胺類衍生物為3-溴-N-((2-胺基甲?；交?胺基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺類化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

式(I)中：R₁為甲基、鹵素或氫，R₂為氫或鹵素，R₃為C1～C9的烷基。

所述的應(yīng)用，其特征在于R₁為甲基、氫或氯；R₂為氫、溴或氯；R₃選自甲基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、環(huán)己基、正丁基或叔丁基。

所述的應(yīng)用，其特征在于R₁為甲基，R₂為氯，R₃為叔丁基。

所述的應(yīng)用，其特征在于癌細(xì)胞為肺癌、肝癌和腸癌。

所述的含脲橋的苯甲酰胺類衍生物的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

1)把草酰氯滴入式(Ⅱ)所示的3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸和有機(jī)溶劑A的懸浮液中，然后加入兩滴DMF，反應(yīng)混合物室溫反應(yīng)10-13h，減壓脫溶得到酰氯殘液，把酰氯殘液溶于有機(jī)溶劑B中，在冰鹽冷卻下，慢慢滴加到4.5-5.5倍量的氨水和水的混合物中，有大量白色固體生成，在冰水冷卻下攪拌30min，抽濾得到產(chǎn)品如式(Ⅲ)所示的化合物3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺；

2)把取代鄰氨基苯甲酸和二氯亞砜混合，加熱回流反應(yīng)2-2.2h，反應(yīng)完畢后脫去溶劑得到酰氯殘液，把酰氯殘液溶于有機(jī)溶劑C中，在冰鹽冷卻下，加入NH₂-R₃，攪拌30min脫溶得如式(Ⅳ)所示的取代鄰氨基苯甲酰胺NH₂-R₃中的R₃為C1～C9的烷基；

3)向圓底燒瓶中加入步驟1)得到的3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺和有機(jī)溶劑D，攪拌均勻后，加入草酰氯回流11-12h，減壓脫去過量的草酰氯及有機(jī)溶劑D得中間體異氰酸酯粗品，把異氰酸酯粗品溶于有機(jī)溶劑E中，在室溫下滴加入步驟2)得到的取代鄰氨基苯甲酰胺的乙腈溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10-12h，有大量白色固體析出，抽濾的固體，用乙醇洗滌固體或重結(jié)晶能得到目標(biāo)產(chǎn)物3-溴-N-((2-胺基甲?；交?胺基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺類化合物，

所述的含脲橋的苯甲酰胺類衍生物的制備方法，其特征在于步驟1)中的3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸和草酰氯的物質(zhì)的量之比為1:1～5，優(yōu)選為1:2；所述有機(jī)溶劑A與有機(jī)溶劑B相同，均選自甲醇、乙醇、THF、二氯甲烷、二氯乙烷、DMF和乙腈中的一種或多種混合物，有機(jī)溶劑A優(yōu)選為二氯甲烷，有機(jī)溶劑B優(yōu)選為THF；有機(jī)溶劑A的用量以3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸的物質(zhì)的量計(jì)為0.1～1mmol/ml，優(yōu)選為0.2mmol/ml；有機(jī)溶劑B的用量以3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸的物質(zhì)的量計(jì)為1～10mmol/ml，優(yōu)選為1mmol/ml；水的量以3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸的物質(zhì)的量計(jì)為0.1～1mmol/ml，優(yōu)選為0.1mmol/ml。

所述的含脲橋的苯甲酰胺類衍生物的制備方法，其特征在于步驟2)中取代鄰氨基苯甲酸、二氯亞砜和NH₂-R₃的物質(zhì)量之比為1：1～5：1～2，優(yōu)選為1：2：1；所述有機(jī)溶劑C選自甲醇、乙醇、THF、二氯甲烷、二氯乙烷、DMF和乙腈中的一種或多種混合物，優(yōu)選為THF；有機(jī)溶劑C的用量以取代鄰氨基苯甲酸的物質(zhì)的量計(jì)為1～10mmol/ml，優(yōu)選1mmol/ml。

所述的含脲橋的苯甲酰胺類衍生物的制備方法，其特征在于步驟3)中3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺、草酰氯和取代鄰氨基苯甲酰胺的物質(zhì)的量之比為1：1～5：1～2，優(yōu)選為1:2:1；所述有機(jī)溶劑D和有機(jī)溶劑E均選自甲醇、乙醇、THF、二氯甲烷、二氯乙烷、DMF和乙腈中的一種或多種混合物，有機(jī)溶劑D優(yōu)選為1,2-二氯乙烷；所述有機(jī)溶劑優(yōu)選為乙腈；有機(jī)溶劑D的用量以3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺的物質(zhì)的量計(jì)為0.1～1mmol/ml；優(yōu)選為0.2mmol/ml；有機(jī)溶劑E的用量以3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺的物質(zhì)的量計(jì)為0.1～1mmol/ml；優(yōu)選為0.5mmol/ml。

本發(fā)明的反應(yīng)過程如下：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一種3-溴-N-((2-胺基甲?；交?胺基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺類化合物在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明得到的11個(gè)化合物中對(duì)肺癌、肝癌和腸癌均有一定活動(dòng)，化合物I-8對(duì)肝癌表現(xiàn)出的活性為45.29％，化合物I-9對(duì)腸癌表現(xiàn)出的活性為33.95％，為新抗癌藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1

(1)3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺式(Ⅲ)的合成：

把草酰氯(10mmol)滴入3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酸(Ⅱ)(5mmol)和二氯甲烷(50mL)的懸浮液中，然后加入兩滴DMF。反應(yīng)混合物室溫反應(yīng)12h，減壓脫溶得到酰氯的殘液。把酰氯殘液溶于10mL THF中，在冰鹽冷卻下，慢慢滴加到5倍量的氨水和100mL水的混合物中，有大量白色固體生成，在冰水冷卻下攪拌30min，抽濾得到產(chǎn)品式(Ⅲ)所示3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率84.2％。

(2)取代鄰氨基苯甲酰胺式(Ⅳ)的合成：

把3-甲基-2-氨基苯甲酸(5mmol)和二氯亞砜(10mmol)混合，加熱回流反應(yīng)2h，反應(yīng)完畢后脫去溶劑得到酰氯的殘液。把酰氯殘液溶于(10ml)THF中，在冰鹽冷卻下，加入NH₂-CH(CH₃)₂(5mmol)，攪拌30min脫溶得(Ⅳ)2-氨基-N-異丙基-3-甲基苯甲酰胺，收率58％。

(3)目標(biāo)化合物式(I)的合成：

向50mL圓底燒瓶中加入3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺(1.5g,5mmol)，25mL 1,2-二氯乙烷，攪拌均勻后，加入草酰氯(1.3g,10mmol)，回流12h，減壓脫去過量的草酰氯及溶劑得中間體異氰酸酯的粗品。把上述粗品溶于10mL乙腈中，在室溫下滴加入(Ⅳ)2-氨基-N-異丙基-3-甲基苯甲酰胺(5mmol)的乙腈(30mL)溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，有大量白色固體析出，抽濾的固體，用乙醇洗滌固體或重結(jié)晶得到(I-1)所示3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-N-((2-(異丙基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1H-吡唑-5-甲酰胺的純品，收率77.8％。

3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-N-((2-(異丙基氨基甲?；?-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.184-186℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.01(d,6H,J＝6.8Hz,CH(CH₃)₂),2.16(s,3H,CH₃),3.84-3.92(m,1H,NHCH),7.21-7.32(m,3H,Ar－H),7.65(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.4Hz,pyridyl—H),8.03(d,1H,J＝7.6,NHCH),8.26(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.55(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.80(br,1H,CONHCO),11.35(br,1H,NHCO).

實(shí)施例2

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-2-氨基苯甲酸，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-2)所示3-溴-N-((4-氯-2-(異丙基氨基甲酰基)苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，83.6％。

3-溴-N-((4-氯-2-(異丙基氨基甲?；?苯基)氨基甲酰基)-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.204-206℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.03(d,6H,J＝6.4Hz,CH(CH₃)₂),3.80-3.88(m,1H,CH(CH₃)₂),7.51-7.52(m,2H,Ar－H),7.60(s,1H,pyrazolyl—H),7.68(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.13(d,1H,J＝9.6Hz,Ar－H),8.25(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.46(d,1H,J＝8.0Hz,NHCH),8.54(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),11.06(br,1H,CONHCO),11.41(br,1H,NHCO).

實(shí)施例3

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-CH₃，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-3)所示3-溴-N-((4-氯-2-甲基-6-(甲基氨基甲?；?苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，68.3％。

3-溴-N-((4-氯-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.201-206℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:2.16(s,3H,CH₃),2.63(d,3H,J＝4.4Hz,NHCH₃),7.32(d,1H,J＝2.4Hz,Ar－H),7.45(d,1H,J＝2.4Hz,Ar－H),7.64(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.27(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.36(q,1H,J＝4.4Hz,NHCH₃),8.56(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.93(br,1H,CONHCO),11.39(br,1H,NHCO).

實(shí)施例4

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-CH₃CH₂CH₃，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-4)所示3-溴-N-((4-氯-2-甲基-6-(正丙基氨基甲?；?苯基)氨基甲酰基)-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，86.4％。

3-溴-N-((4-氯-2-甲基-6-(正丙基氨基甲?；?苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.186-189℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:0.81(t,3H,J＝7.6Hz,CH₂CH₃),1.39(q,2H,J＝7.2Hz,CH₂CH₃),2.16(s,3H,CH₃),3.02-3.07(m,2H,NHCH₂),7.28(d,1H,J＝2.4Hz,Ar－H),7.45(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.64(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.27(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.34(t,1H,J＝4.8Hz,NHCH₂),8.56(d,1H,J＝4.4Hz,pyridyl—H),9.82(br,1H,CONHCO),11.39(br,1H,NHCO).

實(shí)施例5

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-5)所示3-溴-N-((4-氯-2-(異丙基氨基甲?；?-6-甲基苯基)氨基甲酰基)-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率82,3％。

3-溴-N-((4-氯-2-(異丙基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.202-203℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.01(d,6H,J＝6.4Hz,CH(CH₃)₂),2.16(s,3H,CH₃),3.82-3.91(m,1H,CH(CH₃)₂),7.25(s,1H,Ar－H),7.43(s,1H,Ar－H),7.65(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.15(d,1H,J＝7.6Hz,NHCH),8.26(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.55(d,1H,J＝4.4Hz,pyridyl—H),9.77(br,1H,CONHCO),11.41(br,1H,NHCO).

實(shí)施例6

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-CHCH₂CH₂，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-6)所示3-溴-N-((4-氯-2-(環(huán)丙基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率80.6％。

3-溴-N-((4-氯-2-(環(huán)丙基氨基甲?；?-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.195-198℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:0.36-0.40(m,2H,CH₂CH₂),0.58-0.63(m,2H,CH₂CH₂),2.15(s,3H,CH₃),2.62-2.68(m,1H,CH),7.27(s,1H,Ar－H),7.44(s,1H,Ar－H),7.66(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.27(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.37(d,1H,J＝4.0Hz,NHCH),8.56(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.78(br,1H,CONHCO),11.42(br,1H,NHCO).

實(shí)施例7

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-CH₂CH₂CH₂CH₃，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-7)所示3-溴-N-((2-(正丁基氨基甲酰基)-4-氯-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率73.6％。

3-溴-N-((2-(正丁基氨基甲?；?-4-氯-6-甲基苯基)氨基甲酰基)-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.191-193℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:0.82(t,3H,J＝7.2Hz,CH₂CH₃),1.20-1.29(m,2H,CH₂CH₃),1.33-1.39(m,2H,CH₂CH₂CH₃),2.16(s,3H,CH₃),3.09(q,2H,J＝6.8Hz,NHCH₂),7.27(d,1H,J＝2.4Hz,Ar－H),7.44(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.65(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.26(d,1H,J＝7.6Hz,pyridyl—H),8.32(t,1H,J＝5.6Hz,NHCH₂),8.56(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.81(br,1H,CONHCO),11.39(br,1H,NHCO).

實(shí)施例8

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-C(CH₃)₃，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-8)所示3-溴-N-((2-(叔丁基氨基甲酰基)-4-氯-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率79。5％。

3-溴-N-((2-(叔丁基氨基甲酰基)-4-氯-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.187-189℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.19(s,9H,C(CH₃)₃),2.15(s,3H,CH₃),7.18(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.39(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.67(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),7.82(s,1H,NHC(CH₃)₃),8.25(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.54(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.73(br,1H,CONHCO),11.43(br,1H,NHCO).

實(shí)施例9

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，NH₂-CH(CH₃)₂換成5mmol的NH₂-Cy，其他操作同實(shí)施例1，獲得(I-9)所示3-溴-N-((4-氯-2-(環(huán)己基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率80.5％

3-溴-N-((4-氯-2-(環(huán)己基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.205-210℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.04-1.72(m,10H,cyclohexyl－H),2.15(s,3H,CH₃),3.54-3.61(m,1H,cyclohexyl－H),7.25(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.43(d,1H,J＝2.0Hz,Ar－H),7.66(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.14(d,1H,J＝7.6,NHCH),8.26(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.55(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.76(br,1H,CONHCO),11.40(br,1H,NHCO).

實(shí)施例10

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的5-溴-3-甲基-2-氨基苯甲酸，獲得(I-10)所示3-溴-N-((4-溴-2-(異丙基氨基甲?；?-6-甲基苯基)氨基甲酰基)-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率81.9％。

3-溴-N-((4-溴-2-(異丙基氨基甲酰基)-6-甲基苯基)氨基甲?；?-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.186-188℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.01(d,6H,J＝6.4Hz,CH(CH₃)₂),2.15(s,3H,CH₃),3.82-3.91(m,1H,CH(CH₃)₂),7.37(s,1H,Ar－H),7.56(s,1H,Ar－H),7.65(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),8.15(d,1H,J＝7.6Hz,NHCH),8.26(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.55(d,1H,J＝4.8Hz,pyridyl—H),9.77(br,1H,CONHCO),11.41(br,1H,NHCO).

實(shí)施例11

將實(shí)施例1步驟(2)中3-甲基-2-氨基苯甲酸換成5mmol的3,5-二氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸，獲得(I-11)所示3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-N-((2,4-二氯-6-(異丙基氨基甲?；?苯基)氨基甲酰基)-1H-吡唑-5-甲酰胺，收率75.8％。

3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-N-((2,4-二氯-6-(異丙基氨基甲?；?苯基)氨基甲?；?-1H-吡唑-5-甲酰胺m.p.192-194℃；¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:1.01(d,6H,J＝6.8Hz,CH(CH₃)₂),3.83-3.92(m,1H,CH(CH₃)₂),7.44(s,1H,Ar－H),7.65(s,1H,pyrazolyl—H),7.69(dd,1H,J＝4.8,8.0Hz,pyridyl—H),7.80(s,1H,Ar－H),8.17(d,1H,J＝7.6Hz,NHCH),8.27(d,1H,J＝8.0Hz,pyridyl—H),8.56(d,1H,J＝4.4Hz,pyridyl—H),9.83(br,1H,CONHCO),11.58(br,1H,NHCO).

實(shí)施例12抗癌活性測試

實(shí)驗(yàn)原理：

四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一種能接受氫原子的染料。活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的formazon，而死細(xì)胞則無此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。

試驗(yàn)方法：

1、選用對(duì)數(shù)生長期的貼壁A549、Bel7402和HCT-8三種腫瘤細(xì)胞，分別用胰酶消化后，用10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成15000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種190μl，37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h。

2、實(shí)驗(yàn)組加樣品10μl，每孔終體積為200μl，用1640培養(yǎng)液補(bǔ)足。37℃，5％CO₂培養(yǎng)3d。

3、棄上清液，每孔加入100μl新鮮配制的0.5mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入150μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型振蕩器混勻，在酶標(biāo)儀上測定波長544nm處的光密度值。

結(jié)果評(píng)定：

腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％)＝(OD對(duì)照-OD實(shí)驗(yàn))/(OD對(duì)照-OD空白)X 100％

陽性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：抑制率大于50％。

活性測試結(jié)果見表1

表1目標(biāo)化合物抗癌活性

從表中可以看出所有目標(biāo)化合物對(duì)肺癌表現(xiàn)出弱活性，除(I-8)對(duì)肝癌表現(xiàn)出中等活性(45.29％)外，其他化合物都表現(xiàn)出弱活性，(I-7)對(duì)肝癌沒有活性。(I-9)對(duì)腸癌表現(xiàn)出較弱活性(33.95％)，其他化合物均沒有什么活性。