本發(fā)明屬于核醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

黑色素瘤是目前所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腫瘤，由位于皮膚表皮基底部的黑色素細(xì)胞惡變而成，多由痣或色素斑發(fā)展而來(lái)，一旦進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，則預(yù)后差、死亡率高。90％黑色素瘤發(fā)生于皮膚，最常見(jiàn)于背部、胸腹部和腿部。世界范圍內(nèi)歐美白種人發(fā)病率明顯高于其它膚色人種，且歐美各國(guó)的黑色素瘤發(fā)病率不斷上升。

Melan-A蛋白作為特異性較強(qiáng)的標(biāo)志物，被廣泛獨(dú)用或聯(lián)用于診斷黑色素瘤病理切片染色。Melan-A是一種在黑色素瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，它是由MLANA基因編碼的蛋白[14]，該蛋白質(zhì)片段由9個(gè)氨基酸組成，該蛋白質(zhì)可以被免疫系統(tǒng)T細(xì)胞上的MHC I復(fù)合物識(shí)別，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，Melan-A的高表達(dá)被認(rèn)為與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。早期既有研究指出，在黑色素瘤多數(shù)轉(zhuǎn)移病灶中Melan-A蛋白亦有高表達(dá)。Melan-A蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，為將Melan-A蛋白作為靶向位點(diǎn)的應(yīng)用研究提供了理論依據(jù)。

正電子發(fā)射斷層顯像(Positron Emission Tomography，PET)是目前唯一用解剖形態(tài)方式進(jìn)行功能、代謝和受體顯像的核醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，它可以無(wú)創(chuàng)傷地、動(dòng)態(tài)地、定量地觀察藥物或代謝物質(zhì)進(jìn)入人體內(nèi)的生理、生化變化。PET是利用正電子放射性核素及其標(biāo)記化合物為示蹤劑，以功能圖像方式、從分子水平顯示機(jī)體及病灶組織細(xì)胞的代謝、功能、血流、細(xì)胞增殖和受體密度分布狀況，為臨床提供更多的生理和病理方面的診斷信息。PET顯像結(jié)果更能客觀準(zhǔn)確地顯示活體的生物信息，近年來(lái)，發(fā)展較為迅速，在腫瘤診斷、分期、再分期及療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等方面具有重要臨床價(jià)值。

“免疫成像PET(immune-PET)”——單克隆抗體放射性標(biāo)記在正電子成像術(shù)(PET)中的應(yīng)用，真正的成為一種非創(chuàng)傷性的根據(jù)特定靶向分子的體內(nèi)成像技術(shù)，特別是針對(duì)體內(nèi)原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶的檢測(cè)。用于抗體同位素標(biāo)記的常見(jiàn)同位素有鋯89(⁸⁹Zr，t1/2＝3.3d)，碘124(¹²⁴I，t1/2＝4.2d)，銅64(⁶⁴Cu，t1/2＝12.7h)，釔89(⁸⁹Y，t1/2＝3.3d)。⁸⁹Zr，半衰期與抗體藥物基本一致，其能量介乎18F和68Ga之間，能獲得有高分辨率的PET成像圖片等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[18]，正成為近十年來(lái)immune-PET研究的熱門同位素。⁸⁹Zr標(biāo)記方式有很多種，現(xiàn)階段常用的方式是Df-Bz-NCS螯合劑標(biāo)記方法，該方法標(biāo)記產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好,耗時(shí)短，技術(shù)成熟，被應(yīng)用于多個(gè)抗體-⁸⁹Zr標(biāo)記研究中。本研究中采用雙功能改良螯合劑(Df-Bz-NCS)標(biāo)記方法合成黑色素瘤PET顯像示蹤劑[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A polyclonal antibody，合成方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)率較高，約54.75±11.02％，放化純度達(dá)95％以上，體外穩(wěn)定，168h室溫下經(jīng)TLC分析，未見(jiàn)明顯脫鋯表現(xiàn)。

Melan-A是一種在黑色素瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)，它由MLANA基因編碼的蛋白，該蛋白質(zhì)片段由9個(gè)氨基酸組成，該蛋白質(zhì)可以被免疫系統(tǒng)T細(xì)胞上的MHC I復(fù)合物識(shí)別，進(jìn)而激活T淋巴細(xì)胞，melan-A的高表達(dá)被認(rèn)為與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因?yàn)閙elan-A蛋白在黑色素瘤細(xì)胞上表達(dá)的特異性，因此被臨床上用來(lái)做為病理切片染色診斷黑色素瘤。然而，如上所述，病理切片只能診斷局部區(qū)域的組織，并不能反映全身的整體情況，因此，開發(fā)出一種新型的識(shí)別melan-A蛋白的黑色素瘤PET診斷試劑具有現(xiàn)實(shí)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前主要依賴影像學(xué)手段比如CT、MRI和PET-CT等手段來(lái)評(píng)估黑色素瘤病情，CT和MRI僅提供形態(tài)學(xué)方面信息，有一定局限性。18F-FDG對(duì)原發(fā)惡性黑色素瘤的檢出率較高，但是對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤病灶早期檢出率為18.75％，該結(jié)果說(shuō)明18F-FDG在黑色素瘤轉(zhuǎn)移的診斷中發(fā)揮的作用十分有限。因而亟待解決黑色素瘤PET-CT成像的特異性強(qiáng)的分子探針，既提高靈敏度，又兼顧特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種既提高靈敏度，又兼顧特異性的特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑及其制備方法。

技術(shù)方案：

特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑的制備方法，包括如下幾個(gè)步驟：

1)melan-A抗體溶劑置換：采用碳酸氫鈉溶液置換法，將1.5mg melan-A抗體凍干粉劑溶解于溶劑中，并離心濃縮；

2)melan-A抗體的-Df-Bz-NCS-修飾：取步驟1)置換溶劑并濃縮后的melan-A抗體溶液，調(diào)節(jié)PH值為7.0，加入20mg/mL的以DMSO為溶劑的DFO(去鐵胺B，一種可與各種金屬離子結(jié)合的螯合劑)溶液，在36℃油浴中反應(yīng)1h，每隔10min充分振蕩反應(yīng)管，得到-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體；

3)-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體的純化：將步驟2)得到的-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體通過(guò)PD10柱及0.15mol/L(PH＝7.2)醋酸鈉緩沖溶液純化；

4)[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體的合成：取放射性活度為3mCi的⁸⁹Zr草酸溶液0.5ml，加入0.1mol/L的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)PH值為7.0，再加入0.3ml的0.15mol/L(PH＝7.2)的醋酸鈉緩沖溶液，然后向前述體系中加入步驟3)得到的-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體，室溫下反應(yīng)40min；

5)[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體的純化：將步驟4)所得的[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體通過(guò)PD10柱及0.15mol/L(PH＝7.2)醋酸鈉緩沖溶液純化，即得到[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體即特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑。

本發(fā)明通過(guò)放射性紙層析(RTLC)檢測(cè)放射性化學(xué)純度，通過(guò)放射性紙層析(RTLC)檢測(cè)產(chǎn)品在室溫放置168h內(nèi)的穩(wěn)定性。

有益效果：本發(fā)明采用雙功能改良螯合劑(Df-Bz-NCS)標(biāo)記方法合成黑色素瘤PET顯像示蹤劑[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體，合成方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)率較高，約54.75±11.02％，放化純度達(dá)95％以上，體外穩(wěn)定，168h室溫下經(jīng)TLC分析，未見(jiàn)明顯脫鋯表現(xiàn)。具有高靈敏度和特異性，有效提升了PET-CT在黑色素瘤早期診斷和療效監(jiān)測(cè)中的作用，提升黑色素瘤病人的生存質(zhì)量。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體的合成過(guò)程示意圖。

圖2是本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例的細(xì)胞系Melan-A蛋白表達(dá)western blot鑒定圖。

圖3是本發(fā)明應(yīng)用實(shí)施例的melan-A高表達(dá)細(xì)胞株荷瘤鼠microPET掃描圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

如圖1所示，特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑的制備方法，包括如下幾個(gè)步驟：

1)melan-A抗體溶劑置換：將1.5mg Melan-Apolyclonal antibody凍干粉制劑溶于1ml 0.1mol/L碳酸氫鈉溶液，取PD10柱一支，用超純水清洗后，加入0.1mol/L碳酸氫鈉溶液平衡，平衡好后，取1mL melan-A抗體原液加入PD10柱柱頭端，再加入適量碳酸氫鈉溶液，待柱內(nèi)液體流干后，棄去所有流出液，繼續(xù)加入3mL 0.1mol/L碳酸氫鈉溶液，收集所有液體。取超濾離心管一支，將收集液體離心(1500rpm×5min)、濃縮；

2)melan-A抗體的-Df-Bz-NCS-修飾：取步驟1)置換溶劑并濃縮后的melan-A抗體溶液，調(diào)節(jié)PH值為7.0，加入20mg/mL的以DMSO為溶劑的DFO溶液，在36℃油浴中反應(yīng)1h，每隔10min充分振蕩反應(yīng)管，得到-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體；

3)-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體的純化：將步驟2)得到的-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體通過(guò)PD10柱及0.15mol/L(PH＝7.2)醋酸鈉緩沖溶液純化，取PD10柱一支，用超純水清洗后，加入0.15mol/L(PH＝7.2)的醋酸鈉緩沖溶液平衡。平衡結(jié)束后加入上述反應(yīng)粗品，再加入醋酸緩沖溶液，待柱內(nèi)液體流干后，棄去所有流出液。繼續(xù)加入3mL醋酸緩沖溶液，收集所有液體。取超濾離心管一支，將收集液體離心(1500rpm×5min)、濃縮并用醋酸緩沖溶液洗滌數(shù)次；

4)[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體的合成：取放射性活度為3mCi的⁸⁹Zr草酸溶液0.5ml，加入0.1mol/L的碳酸鈉溶液，調(diào)節(jié)PH值為7.0，再加入0.3ml的0.15mol/L(PH＝7.2)的醋酸鈉緩沖溶液，然后向前述體系中加入步驟3)得到的-Df-Bz-NCS-修飾的melan-A抗體，室溫下反應(yīng)40min；

5)[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體的純化：將步驟4)所得的[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體通過(guò)PD10柱及0.15mol/L(PH＝7.2)醋酸鈉緩沖溶液純化，即得到[⁸⁹Zr]-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體即特異性診斷黑色素瘤的PET示蹤劑。

對(duì)實(shí)施例1得到的產(chǎn)物進(jìn)行純度和穩(wěn)定性檢測(cè)：

1.通過(guò)放射性紙層析(RTLC)檢測(cè)放射性化學(xué)純度。

iTLC法測(cè)定放射性化學(xué)純度：吸取10μl的標(biāo)記產(chǎn)物中得到的⁸⁹Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體溶液，以iTLC玻璃纖維為固定相(1cm x 8cm instant silica gel strip)，然后以濃度為20mmol/L、pH值為6.5的檸檬酸-檸檬酸鈉為展開劑展開，干燥，依據(jù)中國(guó)藥典2010年版二部附錄XIII——放射化學(xué)純度測(cè)定法第一法，測(cè)定其放射性化學(xué)純度；其結(jié)果無(wú)游離⁸⁹Zr離子。

2.通過(guò)放射性紙層析(RTLC)檢測(cè)產(chǎn)品在室溫放置168h內(nèi)的穩(wěn)定性，操作方法

取送藥留樣藥品，按照時(shí)間點(diǎn)1h、2h、6h、24h、48h、72h、120h和168h進(jìn)行iTLC分析。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的比移值分別為：0.185、0.179、0.163、0.168、0.169、0.169、0.163和0.168，未發(fā)現(xiàn)明顯的⁸⁹Zr離子單峰。

⁸⁹Zr草酸溶液與Df-Bz-NCS-Melan-A抗體反應(yīng)后，溶液中未結(jié)合的⁸⁹Zr草酸溶液(Rf＝0.5)，⁸⁹Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體產(chǎn)物接近源點(diǎn)(Rf＝0.1)，說(shuō)明已無(wú)游離的⁸⁹Zr，放射性化學(xué)純度>99％。在本發(fā)明得到的標(biāo)記產(chǎn)物在室溫保存168h內(nèi)，其放射性化學(xué)純度>99％，穩(wěn)定性好。

應(yīng)用實(shí)施例

小動(dòng)物PET掃描和生物分布：

SK-MEL-28及A375細(xì)胞總蛋白Melan-A表達(dá)western blot驗(yàn)證

篩選出melan-A陽(yáng)性的表達(dá)的人源性細(xì)胞株SK-MEL-28及melan-A陰性的A375細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)擴(kuò)增，異位接種于裸鼠腋下，采用western blot實(shí)驗(yàn)鑒定兩種細(xì)胞melan-A的表達(dá)情況。由圖2可知，SK-MEL-28細(xì)胞系Melan-A表達(dá)陽(yáng)性，高表達(dá)Melan-A；A375細(xì)胞系Melan-A表達(dá)陰性，低表達(dá)Melan-A

⁸⁹Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體在荷瘤BALB/c裸鼠體內(nèi)microPET顯像:

SK-MEL-28荷瘤鼠注射[⁸⁹Zr]-DFO-Df-Bz-Melan-A抗體后2h，6h，24h，72h，120h和168h顯像如圖3所示。ROI半定量分析顯示，SK-MEL-28荷瘤鼠腫瘤部位對(duì)于顯像劑攝取于72h后達(dá)到最大，攝取值約15.85±2.56％ID/g。

由此實(shí)施例可知，本實(shí)施例制備的89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體，具有制備方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、放化純度高、體外穩(wěn)定好、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可客觀準(zhǔn)確的反應(yīng)活體中腫瘤中Melan-A的表達(dá)情況，可更加早期的診斷黑色素瘤。另外動(dòng)物和人體采用相同的PET示蹤劑，Melan-A蛋白在不同種屬表達(dá)高度保守，本實(shí)施例制備的89Zr-Df-Bz-NCS-Melan-A抗體可廣泛應(yīng)用于臨床早期黑色素瘤PET診斷和腫瘤療效評(píng)估，并為黑色素瘤早期轉(zhuǎn)移診斷提供可靠的影像學(xué)依據(jù)。