本發(fā)明涉及一種花粉祛癢止痛凝膠劑及其制作方法，屬于藥品技術(shù)的領(lǐng)域。
技術(shù)背景
跌打損傷在日常生活中對(duì)于有些人似乎是家常便飯，中醫(yī)治療跌打損傷有著幾千年的歷史，古稱“跌打損傷”為諸傷之總論，多因外力作用，或自身姿勢(shì)不正確的情況下用力過(guò)猛而造成的。中醫(yī)把凡因外力作用于人體而引起的筋骨傷損、瘀血腫痛、氣血不和、經(jīng)絡(luò)不通以至臟器受損等，統(tǒng)稱為跌打損傷。其主要病理為淤血壅滯，血閉氣阻，故以疼痛、腫脹為主要表現(xiàn)。治療多以活血通絡(luò)，舒筋行氣，消腫止痛為法，療效也較為明顯。
花粉祛癢止痛酊源于少數(shù)民族民間用藥，雪上一枝蒿具有強(qiáng)烈鎮(zhèn)痛作用，為主藥，輔以白芷、天花粉為臣藥，具有消腫、止癢的作用，助雪上一枝蒿發(fā)揮消炎、止痛功效；痛則不通，通則不痛，故佐以具有活血化瘀、行氣止痛的乳香，沒(méi)藥。本方具有活血化瘀，消腫止痛，祛風(fēng)止癢的功效，效果明顯。但由于酊劑中含有大量的乙醇，皮膚對(duì)乙醇敏感的患者不宜適用，且酊劑在儲(chǔ)存過(guò)程中乙醇容易揮發(fā)，會(huì)影響藥物的療效。此外，申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，采用現(xiàn)有提取工藝制成花粉祛癢止痛制劑中，乳香的有效成分不易測(cè)出，尤其是總?cè)祁愑袡C(jī)酸的含量不易測(cè)出。使得花粉祛癢止痛制劑的臨床療效還不夠理想。
凝膠劑，指藥物與適宜基質(zhì)均勻混合制成的具有一定稠度的半固體外用制劑，作為載體透皮給藥。其作為載體透皮給藥，與其他劑型相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能提高藥物的透皮能力，可在角質(zhì)層和真皮形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，明顯緩釋藥物，達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間高劑量的釋放，從而提高藥物的生物利用度，達(dá)到增加藥效的目的，且易儲(chǔ)存，保質(zhì)期長(zhǎng)，適合各類患者使用。
如將花粉祛癢止痛酊制成凝膠劑，將擴(kuò)大花粉祛癢止痛藥物的適用范圍，更好地為患者服務(wù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于，提供一種花粉祛癢止痛凝膠劑及其制作方法。本發(fā)明根據(jù)花粉祛癢止痛酊組方中各藥物的性質(zhì)，以及該藥物在組方中所起的作用，將其制成凝膠劑，并對(duì)所用基質(zhì)進(jìn)行了篩選，對(duì)基質(zhì)用量進(jìn)行了優(yōu)化，所選基質(zhì)可促進(jìn)藥物中的大分子藥物在體內(nèi)的吸收，增加藥物透過(guò)率；還可在角質(zhì)層和真皮形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，明顯緩釋藥物，藥效顯著增加。還適合各類患者使用。同時(shí)，對(duì)具體制作工藝及參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，本發(fā)明基質(zhì)和本發(fā)明制作工藝結(jié)合，促進(jìn)了乳香中有效成分的溶出，尤其是乳香中有效成總?cè)祁愑袡C(jī)酸的溶出。使得本藥物更加精煉，藥效更加顯著，臨床療效好。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種花粉祛癢止痛凝膠劑,由按照重量份計(jì)的天花粉30-60份，白芷30-60份，雪上一枝蒿20-50份，冰片1-8份，樟腦1-8份，醋制乳香10-30份，醋制沒(méi)藥10-30份，及按體積份計(jì)的薄荷油5-30份、桉油1-8份，甘油50-60份，蒸餾水40-60份，三乙醇胺8-22份以及按重量份計(jì)算的卡波姆5-15份及甘氨酸鈉5-15份制作而成。
前述的花粉祛癢止痛凝膠劑，由按照重量份計(jì)的天花粉45份，白芷45份，雪上一枝蒿34份，冰片4份，樟腦5份，醋制乳香20份，醋制沒(méi)藥20份，及按體積份計(jì)的薄荷油10份、桉油5份，甘油55份，蒸餾水50份，三乙醇胺16份以及按重量份計(jì)算的卡波姆10.6份及甘氨酸鈉10份制作而成。
前述的花粉祛癢止痛凝膠劑的制作方法，包括以下步驟：
(1)取天花粉，雪上一枝蒿，醋制沒(méi)藥,白芷粉碎成粗顆粒，混勻，加75-85％乙醇浸潤(rùn)20-28小時(shí)，再用75-85％乙醇分2-4次浸漬，每次1-3小時(shí)，合并浸漬液，濾過(guò)，得混合濾液，備用，另取醋制乳香，加6-10倍量水煎煮2-4次，每次1-2小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至體積每毫升與藥材量每克之比為1-3：3-1，過(guò)濾，上清液加乙醇，使含醇量達(dá)到60-70％，用5-20％氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～10，冷藏，過(guò)濾，回收乙醇至凈，加水至體積每毫升與藥材量每克之比為1-3：3-1，用5-20％鹽酸溶液調(diào)pH為5～7，過(guò)濾，濾液與混合溶液混合，得A品；
(2)另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加75-85％乙醇溶解，加入A品中，再加75-85％乙醇使成900-1100ml，混勻，靜置20-28小時(shí)，取上清液，濾過(guò)，得B品；
(3)取卡波姆與甘油，充分研磨后，得C品；
(4)向C品中加入蒸餾水研勻，得D品；
(5)向D品中加入三乙醇胺及甘氨酸鈉，研勻，得E品；
(6)E品中加入B品，研勻，即得。
前述的花粉祛癢止痛制劑的制作方法，包括以下步驟：
(1)取天花粉，雪上一枝蒿，醋制沒(méi)藥,白芷粉碎成粗顆粒，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24小時(shí)，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3小時(shí)；第二、三次各2小時(shí)，合并3次浸漬液，濾過(guò)，得混合濾液，備用，另取醋制乳香，加8倍量水煎煮3次，每次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至體積每毫升與藥材量每克之比為1.5：2，過(guò)濾，上清液加乙醇，使含醇量達(dá)到65％，用13％氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～10，冷藏，過(guò)濾，回收乙醇至凈，加水至體積每毫升與藥材量每克之比為1.5：2，用13％鹽酸溶液調(diào)pH為5～7，過(guò)濾，濾液與混合溶液混合，得A品；
(2)另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入A品中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24小時(shí)，取上清液，濾過(guò)，得B品；
(3)取卡波姆與甘油，充分研磨后，得C品；
(4)向C品中加入蒸餾水研勻，得D品；
(5)向D品中加入三乙醇胺及甘氨酸鈉，研勻，得E品；
(6)E品中加入B品，研勻，即得。
本發(fā)明所述藥物處方中，雪上一枝蒿具有強(qiáng)烈鎮(zhèn)痛作用，為主藥，輔以白芷、天花粉為臣藥，具有消腫、止癢的作用，助雪上一枝蒿發(fā)揮消炎、止痛功效；痛則不通，通則不痛，故佐以具有活血化瘀、行氣止痛的乳香，沒(méi)藥。具有活血化瘀，消腫止痛，祛風(fēng)止癢的功效。申請(qǐng)人對(duì)花粉止痛制劑進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的大量研究，申請(qǐng)人最先以天花粉，白芷，雪上一枝蒿，冰片，樟腦，醋制乳香，醋制沒(méi)藥，薄荷油及桉油為原料制成酊劑，但因酊劑含大量的乙醇，皮膚對(duì)乙醇敏感的患者不宜適用，且酊劑在儲(chǔ)存過(guò)程中乙醇容易揮發(fā)，會(huì)影響藥物的療效。又因凝膠劑作為載體透皮給藥，與其他劑型相比具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能提高藥物的透皮能力，可在角質(zhì)層和真皮形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，明顯緩釋藥物，可達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間高劑量的釋放，從而提高藥物的生物利用度，達(dá)到增加藥效的目的，因此，申請(qǐng)人考慮將其制成凝膠劑。但是制成凝膠劑后，基質(zhì)占凝膠劑的絕大部分，所選基質(zhì)除了賦形劑的作用外，同時(shí)也擔(dān)當(dāng)著藥物載體的角色，對(duì)凝膠劑的質(zhì)量起著重要作用。為確保本發(fā)明凝膠劑的質(zhì)量好，藥效佳，申請(qǐng)人對(duì)凝膠的基質(zhì)的選擇及其用量進(jìn)行了大量的研究，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)得出，選擇甘油，蒸餾水，三乙醇胺，卡波姆10.6及甘氨酸鈉為原料作為基質(zhì)時(shí)，制成的花粉祛癢止痛凝膠中大分子藥物在體內(nèi)的吸收提高了，增加藥物透過(guò)率。
此外，申請(qǐng)人還對(duì)現(xiàn)有花粉祛癢止痛制劑的制作工藝進(jìn)行了改進(jìn)，現(xiàn)有花粉祛癢止痛制劑的制作方法方法為：天花粉、白芷、雪上一枝蒿、醋制乳香、醋制沒(méi)藥粉碎成粗顆粒，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24h，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3小時(shí)，第二、三次各2h，合并3次浸漬液，濾過(guò)，濾液備用；另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入上述濾液中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24h，取上清液，濾過(guò)，即得。但是發(fā)明人在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，采用這種方法制成的花粉祛癢止痛制劑中，乳香的有效成分不易測(cè)出。使得乳香的臨床療效還不夠理想。發(fā)明人在工藝研究中還發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明方法將乳香單獨(dú)提取并改變?nèi)橄愕奶崛」に?，這樣制成的花粉祛癢止痛制劑中，乳香的有效成分容易測(cè)出，且測(cè)出的乳香的有效成分高。這就使得使得本藥物更加精煉，藥效更加顯著，臨床療效好。申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明工藝并配合上述的基質(zhì)，可更好的促進(jìn)乳香中有效成分的溶出，特別是總?cè)祁愑袡C(jī)酸的溶出，促滲作用更加明顯，從而使花粉祛癢止痛制劑中的總?cè)祁愑袡C(jī)酸提高了，乳香中的乳香酸類(BAs)是其抗炎、抗腫瘤等作用的有效成分，其中總?cè)祁愑袡C(jī)酸)抗炎活性最顯著，因此，總?cè)祁愑袡C(jī)酸的溶出提高后，藥效更好，從而使其臨床效果更好。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明根據(jù)花粉祛癢止痛酊組方中各藥物的性質(zhì)，以及該藥物在組方中所起的作用，將其制成凝膠劑，并對(duì)所用基質(zhì)進(jìn)行了篩選，對(duì)基質(zhì)用量進(jìn)行了優(yōu)化，所選基質(zhì)可促進(jìn)藥物中的大分子藥物在體內(nèi)的吸收，增加藥物透過(guò)率；還可在角質(zhì)層和真皮形成藥物儲(chǔ)庫(kù)，明顯緩釋藥物，藥效顯著增加。還適合各類患者使用。同時(shí)，對(duì)具體制作工藝及參數(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，基質(zhì)和本發(fā)明制作工藝結(jié)合，促進(jìn)了乳香中有效成分的溶出，尤其是乳香中有效成總?cè)祁愑袡C(jī)酸的溶出。使得本藥物更加精煉，藥效更加顯著，臨床療效好。
申請(qǐng)人進(jìn)行了下列實(shí)驗(yàn)，可證明本發(fā)明具有有效的效果；
實(shí)驗(yàn)例1.輔料篩選實(shí)驗(yàn)
1實(shí)驗(yàn)材料
本發(fā)明基質(zhì)：甘油55ml，蒸餾水50ml，三乙醇胺16ml，卡波姆10.6g，甘氨酸鈉10g。
對(duì)比基質(zhì)A：卡波姆4.50g、明膠12.50g、聚乙烯醇15.00g、甘油5g、丙二醇1.00g、甘氨酸鋁5g及蒸餾水69.00g。
對(duì)比基質(zhì)B：聚丙烯酸鈉5.0g、卡波姆9406.15g、PVP-303.55g、三氯化鋁5.22g、高嶺土15g、檸檬酸10g、甘油15g及蒸餾水60.00g。
對(duì)比基質(zhì)C：?jiǎn)斡仓岣视痛?.00g、硬脂酸12.50g、液體石蠟6.00g、白凡士林10.05g、甘油5.10g、三氯化鋁5.55g、高嶺土15.11g及蒸餾水65.00g。
對(duì)比基質(zhì)D：阿拉伯膠10.00g、聚丙烯酸鈉5.25g、卡波姆7.51h、PVP-303.55g、三氯化鋁2.52g、高嶺土10g、檸檬酸15g、甘油8g及蒸餾水70.00g。
工藝：按比例分別稱取上述基質(zhì)及等量的藥物(實(shí)施例1中B品)，稱取各組分置50℃水浴中煉合20min后，涂布于30cm×5cm無(wú)紡布上，在50℃烘箱中烘40min，冷卻后加蓋聚乙烯膜，密封，1周后做相關(guān)測(cè)試。
2經(jīng)皮滲透試驗(yàn)
2.1儀器與試藥
1200型高效液相色譜儀，包括柱溫箱、在線脫氣機(jī)、四元泵及二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)：超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)TP-3型藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀與垂直式Franz擴(kuò)散池(上海黃海儀器廠)Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。
2.2動(dòng)物準(zhǔn)備雄性昆明種小鼠100只，體重(22±2)g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。
2.3方法與結(jié)果
2.3.1分析方法的建立
色譜條件：色譜柱AgilentSB-C18柱(4.6mm×150mm，5um)；流動(dòng)相乙腈-0.4％乙酸(48∶52)，流速1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)430nm進(jìn)樣量10ul。本色譜條件下，空白接收液不干擾測(cè)定。
方法學(xué)考察：標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密吸取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋成濃度分別為0.4、1.6、4、8、20和40g/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積(A)。以1濃度(c)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝55.782c-16.553(r＝0.9996)。表明1在0.4-40g/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。
精密度及回收率試驗(yàn)：分別取低、中、高濃度(0.4、8和40g/ml)的溶液，1d內(nèi)測(cè)定5次，連續(xù)5d測(cè)定，計(jì)算得日內(nèi)和日間RSD分別為1.13％、0.97％、1.02％和1.38％、1.27％、1.09％；平均回收率為97.47％，RSD為2.45％(n＝3)，符合試驗(yàn)要求。
2.3.2體外透皮試驗(yàn)
取小鼠，斷頸處死，除去腹部皮膚上的毛發(fā)，剝離腹部皮膚后小心去除皮下脂肪組織和血管，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，剪成適當(dāng)?shù)拇笮?，檢查皮膚完整性后置生理鹽水中，置4℃冰箱中保存，于1d內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。每次試驗(yàn)前，檢查鼠皮的完整性。
采用垂直式Franz擴(kuò)散池(擴(kuò)散面積0.785cm2，接收池體積10ml)，將預(yù)處理好的小鼠腹部皮膚固定于擴(kuò)散池間，角質(zhì)層面向供給池，真皮層面向接收液。37℃平衡30min，更換接收液，排盡皮膚下面的氣泡。供給池加入樣品溶液，接收池加入含0.5％Tween-80和20％乙醇的混合溶劑作為接收液，在轉(zhuǎn)速500r/min下試驗(yàn)。分別在1、2、4、6、8、10、12和24h取樣1ml(立即補(bǔ)充同溫等量接收液)，離心(10332×g)15min后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。
計(jì)算單位面積累積滲透量Q(ug/cm2)和穩(wěn)態(tài)滲透速率J(ug·cm-2·h-1)。透皮試驗(yàn)結(jié)束后，取下鼠皮，剪下用藥部位，分別用清水和無(wú)水乙醇擦拭皮膚表面各3次，以除去鼠皮表面殘留藥物，用濾紙吸干水分。將鼠皮剪碎，置1ml離心管中，加甲醇1ml旋渦5min后超聲提取60min，離心(10332×g)15min后，取上清液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各對(duì)照品在鼠皮中的滯留量。
2.3.4不同基質(zhì)經(jīng)透皮的影響
分別選擇各基質(zhì)：本發(fā)明基質(zhì)，對(duì)比基質(zhì)A、B、C、D，固定凝膠濃度為1％，制成凝膠劑。并分別取0.5g凝膠于供給池上樣，考察各基質(zhì)經(jīng)透皮性的影響。結(jié)果見(jiàn)表1.
表1不同基質(zhì)凝膠劑的滲透參數(shù)
由表可知，凝膠基質(zhì)對(duì)藥物透皮滲透性具有較大影響，與其他對(duì)照基質(zhì)相比，本發(fā)明凝膠組藥物單位面積累積滲透量和皮膚滯留量均較大，故本發(fā)明凝膠組經(jīng)透皮性能最好。
實(shí)驗(yàn)例2：藥效學(xué)研究
申請(qǐng)人對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了主要藥效學(xué)研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
1、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)
1.1實(shí)驗(yàn)藥物
1.1.1本發(fā)明凝膠劑:按實(shí)施例1進(jìn)行制作；
1.1.2原酊劑:
組方：天花粉45g，白芷45g，雪上一枝蒿34g，冰片4g，樟腦5g，乳香(醋制)20g，沒(méi)藥(醋制)20g，薄荷油10ml、桉油5ml；
工藝：先取天花粉、白芷、雪上一枝蒿、乳香(醋制)、沒(méi)藥(醋制)粉碎，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24h，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3h，第二、三次各2h，合并3次浸漬液，濾過(guò)，濾液備用；另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入上述濾液中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24h，取上清液，濾過(guò)，制成酊劑。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
取健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組、本發(fā)明凝膠組和原酊劑組，每組16只。給藥劑量分別為空白對(duì)照組(0.5g/kg賦形劑)，本發(fā)明組(0.5g/kg本發(fā)明凝膠組)，原酊劑組(0.5g/kg)。將小鼠臀背部脫毛，涂抹相應(yīng)的受試物，涂抹2h，每天給藥1次，連續(xù)給藥3天。于末次經(jīng)藥12h后，各小鼠腹腔注射0.8％白醋酸溶液0.2ml/只，觀察記錄15min內(nèi)每只小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差，比較組間差異。
1.3結(jié)果
各給藥組均能對(duì)抗白醋酸刺激所致的疼痛反應(yīng)，使小鼠扭體次數(shù)明顯減少(見(jiàn)表2)。
表2對(duì)小鼠扭體次數(shù)的影響(n＝12，x±s)
注：本發(fā)明凝膠組與原酊劑組比較*P＜0.05
與空白對(duì)照組比較##P＜0.01
1.4結(jié)論
以上實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，本發(fā)明凝膠組與原酊劑組均能對(duì)抗白醋酸刺激所致的疼痛反應(yīng)(P＜0.01)；但本發(fā)明凝膠組優(yōu)于原酊劑組(P＜0.05)。
2、抗炎實(shí)驗(yàn)
2.1實(shí)驗(yàn)藥物
2.1.1本發(fā)明凝膠劑:按實(shí)施例1進(jìn)行制作；
2.2.2原酊劑:
組方：天花粉45g，白芷45g，雪上一枝蒿34g，冰片4g，樟腦5g，乳香(醋制)20g，沒(méi)藥(醋制)20g，薄荷油10ml、桉油5ml；
工藝：先取天花粉、白芷、雪上一枝蒿、乳香(醋制)、沒(méi)藥(醋制)粉碎，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24h，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3h，第二、三次各2h，合并3次浸漬液，濾過(guò)，濾液備用；另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入上述濾液中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24h，取上清液，濾過(guò)，制成酊劑。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)取健康昆明種小鼠48只，雌雄各半，分組、給藥劑量同1.1項(xiàng)下，連續(xù)給藥6天，第7天將每只小鼠右耳一面涂抹20μL二甲苯，另一面涂抹10μL。30min后處死動(dòng)物，用8mm打孔器打取左右耳同一部位圓片，稱重，計(jì)算腫脹率＝(右耳重量-左耳重量)/左耳重量×100％。結(jié)果見(jiàn)表3。
2.2.2大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)取雄性昆明種大鼠48只，隨機(jī)分成3組，分組同2.2.1項(xiàng)下。大鼠腹部脫毛面積為2.5cm×2.5cm。本發(fā)明凝膠組外敷0.3g/kg，原酊劑組外涂抹0.3g/kg，空白對(duì)照組外敷空白基質(zhì)0.3g/kg，涂抹2h，每天1次，連續(xù)給藥6天。以容積法測(cè)大鼠右后足的正常足跖容積(mL)。末次給藥后，大鼠右后足跖皮下注射1％角叉菜膠0.1mL致炎，測(cè)致炎后5h同一位置的足跖體積。計(jì)算腫脹率＝(致炎后足跖厚度－致炎前足跖厚度)/致炎前足跖厚度×100％。結(jié)果見(jiàn)表4。
表3小鼠扭耳廓腫脹率比較(n＝12，x±s)
注：本發(fā)明凝膠組與原酊劑組比較*P＜0.05
與空白對(duì)照組比較##P＜0.01
表4各組大鼠足腫脹率比較(n＝12，x±s)
注：本發(fā)明凝膠組與原酊劑組比較*P＜0.05
與空白對(duì)照組比較##P＜0.01
2.3結(jié)論
結(jié)果表明：本發(fā)明凝膠組與原酊劑組均能降低小鼠扭耳廓腫脹率和大鼠足腫脹率。與原酊劑組比較，本發(fā)明凝膠組效果更好(P＜0.05)。
3、祛癢試驗(yàn)
3.1實(shí)驗(yàn)藥物
3.1.1本發(fā)明凝膠劑:(按實(shí)施例1進(jìn)行制作)；
3.2.2原酊劑:
組方：天花粉45g，白芷45g，雪上一枝蒿34g，冰片4g，樟腦5g，乳香(醋制)20g，沒(méi)藥(醋制)20g，薄荷油10ml、桉油5ml；
工藝：先取天花粉、白芷、雪上一枝蒿、乳香、沒(méi)藥粉碎，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24h，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3h，第二、三次各2h，合并3次浸漬液，濾過(guò)，濾液備用；另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入上述濾液中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24h，取上清液，濾過(guò)，制成酊劑。
3.2實(shí)驗(yàn)方法
取豚鼠50只，隨機(jī)均分為空白對(duì)照組(空白基質(zhì)),本發(fā)明凝膠組；原酊劑組。各組豚鼠右后足背部剃毛1.5cm×1.5cm，分別將受試物均勻涂于剃毛區(qū),給藥量為每次0.05g·cm2,給藥面積約1cm2,每日給藥3次，用藥間隔為1h,給藥第3天，用粗砂紙分別擦傷剃毛處以傷及表皮,有輕度滲血為度。在傷口局部分別涂受試物或?qū)φ瘴?次,涂藥10min后,分別在每只豚鼠創(chuàng)面處滴0.01％磷酸組胺0.05mL,此后每隔3min依0.01％,0.02％,0.03％，0.04％，0.05％遞增濃度,每次均為0.05mL/只,直至豚鼠出現(xiàn)回頭舔后足時(shí),記錄每只豚鼠所給予組胺的總量,以此總量為致癢閾,并比較各組動(dòng)物的致癢閾。結(jié)果本發(fā)明凝膠與原酊劑均可不同程度地提高豚鼠致癢閾,抑制由組胺引起的皮膚瘙癢,并呈現(xiàn)良好的量效依賴關(guān)系,且本發(fā)明凝膠的效果優(yōu)于原酊劑，與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05),見(jiàn)表5。
表5對(duì)豚鼠磷酸組胺致癢反應(yīng)的影響
注:與空白對(duì)照組比較#P<0.05,*P<0.01
本發(fā)明凝膠組與原酊劑組比較+P＜0.05。
實(shí)驗(yàn)例3總?cè)祁愑袡C(jī)酸含量測(cè)定
1材料
Agilent 8453 UV-Vis分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)；齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)110709-200304,中國(guó)藥品生物制品檢定所)；本發(fā)明凝膠劑(按實(shí)施例1進(jìn)行制作)；原酊劑，按藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS3-11212(ZD-1212)-2002-2012Z)上的方法制成的酊劑。
2方法與結(jié)果
2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5mg,置10mL量瓶中，加冰醋酸溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL中含齊墩果酸0.5mg)。
2.2供試品溶液1的制備取本發(fā)明凝膠劑(按實(shí)施例1進(jìn)行制備)約6mg,精密稱定,置10mL量瓶中,加冰醋酸8mL,超聲處理15min,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻,即得。
2.3供試品溶液2的制備取原酊劑(同實(shí)驗(yàn)例2)約6mg,精密稱定,置10mL量瓶中,加冰醋酸8mL,超聲處理15min,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻,即得。
2.4波長(zhǎng)的選擇對(duì)照品溶液、供試品溶液1和供試品溶液2顯色后的最大吸收波長(zhǎng)均為546nm,因此確定對(duì)照品及供試品溶液1和供試品溶液2在546nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色測(cè)定。
2.5顯色條件的選擇
2.5.1 5％香草醛-冰醋酸用量考察
(1)取本發(fā)明凝膠劑約6mg,精密稱定,置10mL量瓶中，加冰醋酸8mL,超聲處理15min,放冷,加冰醋酸至刻度，搖勻,分別精密量取上清液0.2mL,共取4份,分別置10mL量瓶中,分別精密加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.1,0.2,0.3,0.4mL,高氯酸0.8mL,搖勻,置70℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸稀釋至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,0.2mL 5％香草醛-冰醋酸為最佳用量。
(2)取原酊劑約6mg,精密稱定,置10mL量瓶中，加冰醋酸8mL,超聲處理15min,放冷,加冰醋酸至刻度，搖勻,分別精密量取上清液0.2mL,共取4份,分別置10mL量瓶中,分別精密加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.1,0.2,0.3,0.4mL,高氯酸0.8mL,搖勻,置70℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸稀釋至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,0.2mL5％香草醛-冰醋酸為最佳用量。
2.5.2高氯酸用量考察
取本發(fā)明凝膠劑約6mg,按“2.5.1”中“(1)”項(xiàng)下操作,自“分別精密量取上清液0.2mL”起,共取3份,分別置10mL量瓶中,分別精密加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.6,0.8,1.0mL,搖勻,分別置70℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸稀釋至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,0.8mL為高氯酸最佳用量。
取原酊劑約6mg,按“2.5.1”中“(2)”項(xiàng)下操作,自“分別精密量取上清液0.2mL”起,共取3份,分別置10mL量瓶中,分別精密加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.6,0.8,1.0mL,搖勻,分別置70℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸稀釋至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,0.8mL為高氯酸最佳用量。
2.5.3顯色時(shí)間的選擇
取本發(fā)明凝膠劑約6mg,共取3份,分別按上述方法制備供試品溶液,自“加入高氯酸0.8mL”起,搖勻,分別置70℃水浴加熱10,15,20min,取出,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,15min為最佳顯色時(shí)間。
取原酊劑約6mg,共取3份,分別按上述方法制備供試品溶液,自“加入高氯酸0.8mL”起,搖勻,分別置70℃水浴加熱10,15,20min,取出,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸收度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示,15min為最佳顯色時(shí)間。
2.5.4顯色溫度的選擇
取本發(fā)明凝膠劑約6mg，共取3份,分別按上述方法制備供試品溶液,自“高氯酸0.8mL,搖勻”起,分別置60,70,80℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸光度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示，70℃為最佳顯色溫度。
取原酊劑約6mg，共取3份,分別按上述方法制備供試品溶液,自“高氯酸0.8mL,搖勻”起,分別置60,70,80℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻后在546nm處測(cè)定吸光度,同時(shí)做空白校正。結(jié)果顯示，70℃為最佳顯色溫度。
2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取齊墩果酸對(duì)照品5.30mg,置10mL量瓶中,加冰醋酸溶解并稀釋至刻度,搖勻,精密吸取0.1,0.14,0.18,0.22,0.26,0.30mL,分別置10mL量瓶中,各精密加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,搖勻,置70℃水浴加熱15min,放冷,加冰醋酸至刻度,搖勻,同時(shí)作空白。照分光光度法[1](中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅤB),在546nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為C＝-0.019984+0.25196A,r＝0.9996,表明齊墩果酸在0.53～1.59g·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。
2.7精密度試驗(yàn)
取同一對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次,測(cè)得吸收度,計(jì)算RSD為0.09％,取相同濃度的6份對(duì)照品溶液,分別測(cè)定吸收度,計(jì)算RSD為1.10％。表明本方法精密度良好。
2.8重復(fù)性試驗(yàn)
取本發(fā)明凝膠劑6mg,精密稱定,共取6份,按樣品制備方法平行測(cè)定總?cè)坪?平均含量為609mg·g-1,RSD值為0.78％,表明本方法的重復(fù)性良好。
取原酊劑6mg,精密稱定,共取6份,按樣品制備方法平行測(cè)定總?cè)坪?平均含量為609mg·g-1,RSD值為0.78％,表明本方法的重復(fù)性良好。
2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)
分別取供試品溶液，對(duì)照品溶液1和對(duì)照品溶液2,按樣品制備方法測(cè)定放置0,20,40,60,80min后,測(cè)定吸收度。計(jì)算得對(duì)照品及供試品的RSD分別為0.95％,0.99％，0.98％。結(jié)果表明:齊墩果酸對(duì)照品溶液，供試品溶液1和供試品溶液2顯色后在1h內(nèi)穩(wěn)定。
2.10回收率試驗(yàn)
密稱取已知含量的乳香總?cè)祁愑袡C(jī)酸準(zhǔn)確加入定量的齊墩果酸對(duì)照品,按上述方法進(jìn)行測(cè)定,平均回收率為98.71％,RSD值為1.57％。
2.11樣品測(cè)定
分別取本發(fā)明凝膠劑和原酊劑，制成供試品溶液1和供試品溶液2,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線下的方法測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6。
表6總?cè)祁愑袡C(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果
由表可知，與原酊劑相比，本發(fā)明凝膠中乳香的有效成分總?cè)祁愑袡C(jī)酸的含量更高。
具體實(shí)施方式：
實(shí)施例1：
藥物配方：天花粉45g，白芷45g，雪上一枝蒿34g，冰片4g，樟腦5g，醋制乳香20g，醋制沒(méi)藥20g，薄荷油10ml、桉油5ml，甘油55ml，蒸餾水50ml，三乙醇胺16ml，卡波姆10.6g，甘氨酸鈉10g。
工藝：
(1)取天花粉，雪上一枝蒿，醋制沒(méi)藥,白芷粉碎成粗顆粒，混勻，加80％乙醇浸潤(rùn)24小時(shí)，再用80％乙醇分三次浸漬，第一次3小時(shí)；第二、三次各2小時(shí)，合并3次浸漬液，濾過(guò)，得混合濾液，備用，另取醋制乳香，加8倍量水煎煮3次，每次1.5小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至體積每毫升與藥材量每克之比為1.5：2，過(guò)濾，上清液加乙醇，使含醇量達(dá)到65％，用13％氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～10，冷藏，過(guò)濾，回收乙醇至凈，加水至體積每毫升與藥材量每克之比為1.5：2，用13％鹽酸溶液調(diào)pH為5～7，過(guò)濾，濾液與混合溶液混合，得A品；
(2)另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加80％乙醇溶解，加入A品中，再加80％乙醇使成1000ml，混勻，靜置24小時(shí)，取上清液，濾過(guò)，得B品；
(3)取卡波姆與甘油，充分研磨后，得C品；
(4)向C品中加入蒸餾水研勻，得D品；
(5)向D品中加入三乙醇胺及甘氨酸鈉，研勻，得E品；
(6)E品中加入B品，研勻，即得。
用法用量：外用，貼于患處，每隔4-6h換1次。
實(shí)施例2：
藥物配方：天花粉60g，白芷60g，雪上一枝蒿50g，冰片8g，樟腦8g，醋制乳香30g，醋制沒(méi)藥30g，薄荷油30ml、桉油8ml，甘油60ml，蒸餾水60ml，三乙醇胺22ml，卡波姆15g及甘氨酸鈉15g。
工藝：
(1)取天花粉，雪上一枝蒿，醋制沒(méi)藥,白芷粉碎成粗顆粒，混勻，加85％乙醇浸潤(rùn)28小時(shí)，再用85％乙醇分4次浸漬，每次3小時(shí)，合并浸漬液，濾過(guò)，得混合濾液，備用，另取醋制乳香，加10倍量水煎煮4次，每次2小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至體積每毫升與藥材量每克之比為3：1，過(guò)濾，上清液加乙醇，使含醇量達(dá)到70％，用20％氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～10，冷藏，過(guò)濾，回收乙醇至凈，加水至體積每毫升與藥材量每克之比為3：1，用20％鹽酸溶液調(diào)pH為5～7，過(guò)濾，濾液與混合溶液混合，得A品；
(2)另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加85％乙醇溶解，加入A品中，再加85％乙醇使成1100ml，混勻，靜置28小時(shí)，取上清液，濾過(guò)，得B品；
(3)取卡波姆與甘油，充分研磨后，得C品；
(4)向C品中加入蒸餾水研勻，得D品；
(5)向D品中加入三乙醇胺及甘氨酸鈉，研勻，得E品；
(6)E品中加入B品，研勻，即得。
用法用量：外用，貼于患處，每隔4-6h換1次。
實(shí)施例3：
配方：天花粉30g，白芷30g，雪上一枝蒿20g，冰片1g，樟腦1g，醋制乳香10g，醋制沒(méi)藥10g，薄荷油5ml、桉油1ml，甘油50ml，蒸餾水40ml，三乙醇胺8ml，卡波姆5g及甘氨酸鈉5g。
工藝：
(1)取天花粉，雪上一枝蒿，醋制沒(méi)藥,白芷粉碎成粗顆粒，混勻，加75％乙醇浸潤(rùn)20小時(shí)，再用75％乙醇分2次浸漬，每次1小時(shí)，合并浸漬液，濾過(guò)，得混合濾液，備用，另取醋制乳香，加6倍量水煎煮2次，每次1小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濃縮至體積每毫升與藥材量每克之比為1：3，過(guò)濾，上清液加乙醇，使含醇量達(dá)到60％，用5％氫氧化鈉溶液調(diào)pH為7～10，冷藏，過(guò)濾，回收乙醇至凈，加水至體積每毫升與藥材量每克之比為1：3，用5％鹽酸溶液調(diào)pH為5～7，過(guò)濾，濾液與混合溶液混合，得A品；
(2)另取冰片、樟腦、薄荷油、桉油加75％乙醇溶解，加入A品中，再加75％乙醇使成900ml，混勻，靜置20小時(shí)，取上清液，濾過(guò)，得B品；
(3)取卡波姆與甘油，充分研磨后，得C品；
(4)向C品中加入蒸餾水研勻，得D品；
(5)向D品中加入三乙醇胺及甘氨酸鈉，研勻，得E品；
(6)E品中加入B品，研勻，即得。
用法用量：外用，貼于患處，每隔4-6h換1次。