發(fā)明領域

本發(fā)明涉及用于治療α-半乳糖苷酶A缺陷的方法和組合物。

發(fā)明背景

Fabry病(費勃萊氏病，?；拾贝技喝擒彰溉狈ΠY)是X染色體連鎖的遺傳性溶酶體貯積病，特征為嚴重的腎損傷、血管角質瘤、和心血管異常(包括心室膨大和二尖瓣閉鎖不全)。Fabry病還影響外周神經系統(tǒng)，引起極度痛苦的發(fā)作，四肢灼痛。Fabry病是由α-半乳糖苷酶A(α-Gal A)的缺陷引起的。α-Gal A是溶酶體糖水解酶，切割各種復合糖的末端α-半乳糖基部分。Fabry病導致阻斷中性糖神經鞘脂--?；拾贝技喝擒?CTH)的分解代謝，并在細胞內和血流中積累這種酶底物。

由于這種疾病具有X染色體連鎖的遺傳模式，大多數Fabry病患者是男性。雖然已經觀察到受到嚴重影響的女性雜合子，但是女性雜合子通常沒有癥狀，或者具有相對較弱的癥狀(諸如特征性角膜混濁)。剩余α-Gal A活性低、抑或有很微弱的癥狀抑或表面上沒有Fabry病其它特征性癥狀的非典型性變異型Fabry病，與左心室肥大和心臟病有關Nakano等人，新英格蘭醫(yī)學雜志(New Engl.J.Med.)333：288－293，(1995)。α-Gal A的降低可能是這些心臟異常的病因。

已經分離得到了編碼人α-Gal A的cDNA和基因并進行了測序。人α-Gal A是作為429個氨基酸的多肽表達的，其N末端31個氨基酸為信號肽。人的這種酶已經在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中(Desnick等人，美國專利5,356,804；Ioannou等人，細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)119：1137，(1992))和昆蟲細胞中(Calhoun等人，WO 90/11353)得到表達。

然而，目前的α-Gal A制劑的功效有限。高純度α-Gal A的制備方法依賴于使用的親和層析法，即植物凝血素親和層析法(伴刀豆球蛋白A(ConA))和基于將α-Gal A與基質偶聯的底物類似物N-6-氨基己?；?α-D-半乳糖基胺的結合的親和層析法的聯合。參閱例如，Bishop等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)256：1307－1316，1981)。使用蛋白質性質的植物凝血素親和樹脂和底物類似物樹脂通常與親和劑從固相支持物連續(xù)脫落有關(Marikar等人，分析生化(Anal.Biochem.)201：306－310，1992)，導致純化產物中污染了在溶液中游離的或結合了洗脫蛋白質的親和劑。這些污染使產物不適合用于制藥學制劑。結合的底物類似物和植物凝血素也可能對蛋白質的酶學、功能性、和結構特性具有實質性的消極影響。此外，用以前的方法制備的α-Gal A在肝臟中被快速清除。

因此，本領域仍然需要使用傳統(tǒng)層析樹脂的純化方案，這種樹脂可以從供應商處容易地獲得，質量適用于大劑量商業(yè)用途，而且產生的α-Gal A制劑，不含親和劑。另外，本領域仍然需要循環(huán)半衰期延長、在肝臟以外的特定組織中的攝取增加的α-Gal A制劑。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了高純度的α-Gal A制劑及用于純化α-Gal A糖形式的多種方法。本發(fā)明還提供了電荷改變的α-Gal A制劑及其制備方法。電荷變化是通過增加α-Gal A的唾液酸含量和/或增加α-Gal A的磷酸化來實現的。本發(fā)明還提供了在哺乳動物宿主中循環(huán)半衰期延長的α-Gal A制劑及其制備方法。最后，本發(fā)明還提供了對受治療者施用α-Gal A制劑的方法和劑量。本發(fā)明的α-Gal A可用于治療Fabry病患者或Fabry病非典型性變異型患者(如主要為心血管異常的特定Fabry病患者群，諸如心室膨大，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣閉鎖不全；或者主要為腎累及的患者)。

圖的簡述

圖1表示用于從人成纖維細胞cDNA文庫分離α-Gal A cDNA的210bp探針(SEQ ID NO：1)。探針的序列來自α-Gal A基因的外顯子7。該探針是通過聚合酶鏈反應(PCR)由人基因組DNA分離的。圖中標有下劃線的區(qū)域對應于擴增引物的序列。

圖2表示完成α-Gal A cDNA克隆5’端的DNA片段的序列(SEQ ID NO：2)。此片段是通過PCR由人基因組DNA擴增的。標有下劃線的區(qū)域對應于擴增引物的序列。同時還標明了實施例1中所述亞克隆利用的NcoI和SacII限制性內切酶位點的位置。

圖3表示了α-Gal A cDNA的序列，包括編碼信號肽的序列(SEQ ID NO：3)。

圖4是α-Gal A表達構建物pXAG-16的示意圖，包括CMV(細胞肥大病毒)啟動子、第一個外顯子、和第一個內含子，hGH信號肽編碼序列和第一個內含子，α-Gal A的cDNA(缺α-Gal A信號肽序列)，和hGH 3’UTS。pcDNeo指示了從質粒pcDNeo得到的neo基因的位置。

圖5是α-Gal A表達構建物pXAG-28的示意圖，包括膠原蛋白Iα2啟動子和第一個外顯子，β-肌動蛋白內含子，hGH信號肽編碼序列和第一個內含子，α-Gal A的cDNA(缺α-Gal A信號肽序列)，和hGH 3’UTS。pcDNeo指示了從質粒pcDNeo得到的neo基因的位置。

圖6表示了人α-Gal A氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

圖7表示了編碼人α-Gal A的cDNA序列(無信號肽)(SEQ ID NO：5)。

圖8是使用丁基樹脂的α-Gal A純化步驟的層析圖譜。顯示了選定的收集液在280nm處的吸光率(普通線)和α-Gal A活性(打點線)。

圖9是pGA213C的示意圖。

圖10是靶向構建物pGA213C及其與內源α-半乳糖苷酶A基因座進行同源重組的圖解。將pGA213C描述成靶向序列，排列于X染色體α-半乳糖苷酶A基因座的相應序列的上面。在線性圖譜上面的數字表示的是相對于甲硫氨酸起始密碼子ATG的位置。在第-221位的上面顯示了含有通過DNA克隆插入該處的鼠dhfr、細菌neo、和CMV啟動子/醛縮酶內含子序列的激活單位。α-半乳糖苷酶A編碼序列由深色盒表示。α-半乳糖苷酶A非編碼基因組序列由淺色盒表示。大箭頭表示dhfr和neo表達盒的轉錄方向。激活的α-半乳糖苷酶A(GA-GAL)基因座圖譜下面的分段線表示成功靶向和基因活化后的GA-GAL mRNA剪接。

發(fā)明詳述

序言

此處所述的發(fā)明涉及一些新的α-Gal A制劑及其生產方法，以及使用這些制劑治療Fabry病或非典型性變異型Fabry病患者的方法。下文概述和更詳細地說明了某些受到關注的代表性實施方案。

本發(fā)明將在任何細胞(α-Gal A生產細胞)中生產的α-Gal A用于Fabry病的治療。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明使用由標準基因工程技術(基于將克隆的α-Gal A基因或cDNA導入宿主細胞)或基因活化方法生產的人α-Gal A。

本發(fā)明提供了含有純度高于在現有技術中制備的α-Gal A的制劑及其生產方法。如SDS-PAGE或反相HPLC所測量，使用本發(fā)明的純化方法，人α-Gal A制劑組合物優(yōu)選地純化到至少98％同質性，更優(yōu)選地至少99％同質性，最優(yōu)選地至少99.5％同質性。本發(fā)明的α-Gal A制劑的比活性優(yōu)選地至少2.0x10⁶單位/mg蛋白質，更優(yōu)選地至少3.0x10⁶單位/mg蛋白質，最優(yōu)選地至少3.5x10⁶單位/mg蛋白質。

在一個實施方案中，在疏水相互作用樹脂上將各種糖形式的α-Gal A與其它成分分開，由此純化α-Gal A制劑，但是不包括植物凝血素層析步驟。在優(yōu)選的實施方案中，疏水相互作用樹脂的功能部分包括丁基。

在備選的實施方案中，首先在層析柱中于平衡緩沖液中酸性pH下使各種糖形式的α-Gal A結合到陽離子交換樹脂上，然后用平衡緩沖液清洗層析柱，洗脫未結合的物質，并使用10－100mM的鹽溶液、pH4－5的緩沖液、或其組合作為洗脫液洗脫各種糖形式的α-Gal A，由此純化α-Gal A制劑。在優(yōu)選的實施方案中，平衡緩沖液的pH為大約4.4。

在另一個備選的實施方案中，用包括層析聚焦層析法、金屬螯合物親和層析法、或免疫親和層析法中的至少一個方法的純化步驟，將樣品中的各種糖形式的α-Gal A與樣品中的其它成分分開，從而純化了α-Gal A制劑。

本發(fā)明還提供了α-Gal A電荷改變的α-Gal A制劑及其生產方法。制劑可能包括不同糖形式的α-Gal A。電荷的改變是通過增加α-Gal A制劑中的唾液酸含量和/或增加α-Gal A制劑的磷酸化程度來實現的。

α-Gal A制劑中的唾液酸含量是如下增加的：(i)在純化過程之中或之后分離高電荷和/或高分子量的糖形式的α-Gal A；(ii)使用經遺傳修飾的細胞(通過傳統(tǒng)的基因工程方法或基因活化方法)表達唾液?；D移酶基因或cDNA來添加唾液酸殘基；或(iii)在低銨環(huán)境發(fā)酵或培養(yǎng)表達該酶的細胞。

如下增加α-Gal A制劑的磷酸化：(i)使用經遺傳修飾的細胞來(通過傳統(tǒng)的基因工程方法或基因活化方法)表達磷酸轉移酶基因或cDNA，添加磷酸殘基；或(ii)向培養(yǎng)細胞加入磷酸酶抑制劑。

使用本發(fā)明的方法，獲得了人的糖基化α-Gal A制劑，其中35％－85％的寡糖帶電荷。在優(yōu)選的實施方案中，至少35％的寡糖帶電荷。在更優(yōu)選的實施方案中，至少50％的寡糖帶電荷。

可供選擇的優(yōu)選的人糖基化α-Gal A制劑具有多種α-Gal A糖形式，其中優(yōu)選地至少20％，更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少70％使聚糖與2－4個唾液酸殘基復合。在可供選擇的優(yōu)選的實施方案中，具有多種糖形式的人糖基化α-Gal A制劑的寡糖電荷如Z數目測量所得，大于100，優(yōu)選地大于150，更優(yōu)選地大于170。在另一個可供選擇的優(yōu)選的實施方案中，具有多種糖形式的人糖基化α-Gal A制劑平均至少16－50％，優(yōu)選地25－50％，更優(yōu)選地至少30％磷酸化。在另一個可供選擇的實施方案中，具有多種糖形式的制劑中，50－75％，優(yōu)選地60％的總聚糖唾液酸化。

在本發(fā)明的一個實施方案中，生產寡糖電荷增加的糖基化α-Gal A制劑的步驟如下：首先將編碼GlcNAc轉移酶III(GnT-III)的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞或者通過同源重組導入調控序列以調控內源GnT-III基因的表達；然后在能夠表達α-Gal A和GnT-III的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)α-Gal A生產細胞；最后分離寡糖電荷增加的α-Gal A制劑。

在本發(fā)明的備選實施方案中，生產寡糖電荷增加的糖基化α-Gal A制劑的步驟如下：首先將編碼唾液酰基轉移酶的多核苷酸導入生產的α-Gal A細胞或者通過同源重組導入調控內源唾液酰基轉移酶基因的表達的調控序列；然后在能夠表達α-Gal A和唾液?；D移酶的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)α-Gal A生產細胞；最后分離寡糖電荷增加的α-Gal A制劑。優(yōu)選的唾液?；D移酶包括α2,3-唾液酰基轉移酶和α2,6-唾液?；D移酶。該方法在優(yōu)選的實施方案中，包括通過制劑的分級分離或純化來選擇大小或電荷增加的α-Gal A糖形式的額外步驟。

在另一個實施方案中，獲得唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制劑的步驟如下：將α-Gal A生產細胞接觸銨濃度低于10mM的培養(yǎng)基，更優(yōu)選地銨濃度低于2mM。在優(yōu)選的實施方案中，低銨環(huán)境是通過向培養(yǎng)基中加入谷氨酰胺合成酶來兌現的。在備選的優(yōu)選的實施方案中，低銨環(huán)境是通過用新鮮培養(yǎng)基連續(xù)或間歇灌注α-Gal A生產細胞以維持銨濃度低于10mM(優(yōu)選地低于2mM)來實現的。

在另外的一個實施方案中，獲得磷酸化增加的糖基化α-Gal A制劑的步驟如下：首先將編碼磷酸轉移酶的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞或者通過同源重組導入調控內源磷酸轉移酶基因表達的調控序列；然后在能夠表達α-Gal A和磷酸轉移酶的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)上述α-Gal A生產細胞；最后分離磷酸化程度比不含所述多核苷酸的細胞產生的α-Gal A更大的α-Gal A制劑。在優(yōu)選的實施方案中，由本發(fā)明方法生產的α-Gal A制劑具有多種糖形式，其中的16－50％，優(yōu)選地25－50％，更優(yōu)選地至少30％的糖形式是磷酸化的。在優(yōu)選的實施方案中，該方法包括通過分離或純化制劑來選擇大小或電荷增加的α-Gal A糖形式的額外步驟。

在另外的一個實施方案中，磷酸化增加的糖基化α-Gal A制劑是通過向培養(yǎng)細胞中加入磷酸酶抑制劑(如溴四咪唑)獲得的。在用作培養(yǎng)細胞的生長添加劑的胎牛血清中可以存在低水平的牛血漿堿性磷酸酶。這增加了分泌的α-Gal A上暴露的Man-6-P表位成為血漿堿性磷酸酶底物的可能性。已經顯示，溴四咪唑是堿性磷酸酶的潛在抑制劑，K_i＝2.8mM(Metaye等人，生化藥理學(Biochem.Pharmacol.)15：4263－4268，1988))；并在0.1mM濃度時達到完全抑制(Borgers和Thone，組織化學(Histochemistry)44：277－280，1975)。因此，在一個實施方案中，可以在培養(yǎng)的細胞中加入磷酸酶抑制劑(如溴四咪唑)，從而通過預防Man-6-P酯基的水解使得存在于培養(yǎng)基中的α-Gal A的高攝取形式最大化。

本發(fā)明還提供了在哺乳動物宿主中循環(huán)半衰期延長的α-Gal A制劑及其生產方法。增強循環(huán)半衰期和細胞攝取的步驟如下：(i)增加α-Gal A的唾液酸含量(如上兌現)；(ii)增加α-Gal A的磷酸化(如上兌現)；(iii)PEG化α-Gal A；或(iv)相繼除去α-Gal A寡糖鏈上的唾液酸和末端半乳糖殘基，或除去末端半乳糖殘基。

改善的α-Gal A制劑的唾液酸化也增強了外源α-Gal A的循環(huán)半衰期。另外，相對于肝細胞而言，非肝細胞中改善的α-Gal A的唾液酸化也增強了α-GalA的攝取，這些非肝細胞如肝內皮細胞、肝血竇細胞、肺細胞、腎細胞、神經細胞、內皮細胞、或心細胞。唾液酸含量增加的人糖基化α-Gal A制劑優(yōu)選包括多種糖形式，其中至少20％的復合聚糖含2－4個唾液酸殘基。備選的優(yōu)選人糖基化α-Gal A制劑也具有多種糖形式，其中50－75％，優(yōu)選地至少60％的總聚糖唾液酸化。

α-Gal A制劑的磷酸化也提高了進入細胞的α-Gal A水平。磷酸化是在表達α-Gal A的細胞內發(fā)生的。本發(fā)明的優(yōu)選人糖基化α-Gal A制劑優(yōu)選地包括多種糖形式，其中至少平均16－50％的糖形式磷酸化，優(yōu)選地25－50％，更優(yōu)選地至少30％。

在備選的實施方案中，α-Gal A與聚乙二醇復合增強了人α-Gal A制劑的循環(huán)半衰期。在優(yōu)選的實施方案中，α-Gal A制劑是通過與tresyl單甲氧基PEG(TMPEG)復合形成PEG化α-Gal A。然后將它純化提供了分離的PEG化α-Gal A制劑。PEG化α-Gal A加長了蛋白質的循環(huán)半衰期，增強了體內功效。

唾液酸化影響蛋白質的循環(huán)半衰期和生物分布。含微量唾液酸或不含唾液酸的蛋白質容易通過蛋白質上暴露的半乳糖殘基由肝細胞上的唾液酸糖蛋白受體(Ashwell受體)進行內在化。以半乳糖結尾的α-Gal A的循環(huán)半衰期可以如下步驟按序增強：(1)讓α-Gal A接觸神經氨酸苷酶(唾液酸酶)除去唾液酸，由此暴露末端半乳糖部分，并(2)使脫唾液酸α-Gal A接觸β-半乳糖苷酶除去末端半乳糖苷殘基。產生的α-Gal A制劑的寡糖鏈上的末端唾液酸和/或末端半乳糖苷殘基數目比未相繼接觸神經氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶的α-Gal A制劑的寡糖鏈上的少。或者，讓脫唾液酸α-Gal A只接觸β-半乳糖苷酶，除去末端半乳糖苷殘基而增長半乳糖結尾的α-Gal A的循環(huán)半衰期。產生的α-Gal A制劑的寡糖鏈上的末端半乳糖苷殘基數目比未接觸β-半乳糖苷酶的α-Gal A制劑少。在優(yōu)選的實施方案中，在先后接觸神經氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶后，再讓產生的α-Gal A制劑接觸β-氨基己糖苷酶，從而將寡糖切至三甘露糖核。

另外，唾液酸化水平可以根據所用的細胞類型而變化。因此，在另一個優(yōu)選的實施方案中，α-Gal A的唾液酸化是通過篩選唾液酰基轉移酶活性相對較高的哺乳動物細胞(如人細胞)并利用這些細胞作為α-Gal A生產細胞而增強的。

本發(fā)明還提供了基本上不含非α-Gal A蛋白質(諸如清蛋白、宿主細胞產生的非α-Gal A蛋白質、或從動物組織或流體分離的蛋白質)的α-Gal A制劑的配方。在一個實施方案中，配方還包括賦形劑。優(yōu)選的賦形劑包括甘露醇、山梨醇、甘油、氨基酸、脂類、EDTA、EGTA、氯化鈉、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷、葡聚糖、或這些賦形劑的任意組合。在另一個實施方案中，配方還包含非離子去污劑。優(yōu)選的非離子去污劑包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、屈立通X-100、屈立通X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡萄糖苷、辛基β-葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、和吐溫20。在優(yōu)選的實施方案中，非離子去污劑包括聚山梨酯20或聚山梨酯80。優(yōu)選的配方還包括磷酸鹽緩沖液，pH優(yōu)選地為6。

本發(fā)明還提供了對受治療者施用α-Gal A制劑的方法。在優(yōu)選的實施方案中，α-Gal A制劑是本文所述電荷改變(如寡糖電荷增加)和/或循環(huán)半衰期延長的α-Gal A制劑。施用劑量優(yōu)選地每kg體重0.05－5.0mg，更優(yōu)選地每kg體重0.1－0.3mg，α-Gal A制劑，一周一次或兩周一次。在優(yōu)選的實施方案中，施用劑量可以每kg體重約0.2mg，兩周一次。在這些方法中，可以如下施用：通過肌肉內、口、直腸、皮下、動脈內、腹膜內、大腦內、鼻內、真皮內、鞘內、穿粘膜、穿真皮、或吸入。在一個實施方案中，向受治療者投遞α-Gal A制劑的方法包括兩周一次或一周一次每kg體重皮下施用0.01－10.0mg，優(yōu)選地0.1－5.0mgα-Gal A制劑。α-Gal A制劑也可以靜脈內施用，如靜脈內大劑量注射、慢推靜脈內注射、或連續(xù)靜脈內注射。在任何上述方法中，α-Gal A制劑可以使用投遞系統(tǒng)投遞，諸如泵投遞、包囊細胞投遞、脂質體投遞、針頭投遞注射、無針頭注射、噴霧器、氣霧器、電穿孔、和透皮貼。任何上述α-Gal A制劑可以使用這些方法施用。

使用上述施用方法和劑量，α-Gal A制劑可以治療懷疑患有或已知患有Fabry病的個體。本發(fā)明關注對Fabry病患者(“Fabry患者”)以及非典型性變異型Fabry病患者(如主要為心血管異常的特定Fabry病患者群，本文中定義為心室膨大的Fabry患者，如左心室肥大(LVH)，和/或二尖瓣閉鎖不全，或者主要為腎累及的患者)的治療。

α-Gal A

α-Gal A是從糖脂和糖蛋白水解末端α-半乳糖基部分的同型二聚體糖蛋白。

術語成熟的“α-Gal A”和“GA-GAL”和SEQ ID NO：5”(見圖7)指不含信號肽的α-Gal A(對于含信號肽的α-Gal A，見圖3和SEQ ID NO：3)。如本文中定義的，術語“α-Gal A制劑”可與術語“糖基化α-Gal A制劑”互換使用，而且包括各種糖基化的α-Gal A糖形式。

“信號肽”指將該信號肽與之連接的新合成的肽引向內質網(ER)進行進一步的翻譯后加工和分布的肽序列。

如本文中對α-Gal A的論述中所用，“異源信號肽”指非人α-Gal A信號肽，通常是除α-Gal A之外的一些哺乳動物蛋白質的信號肽。

技術人員會認識到，人α-Gal A DNA序列(cDNA[SEQ ID NO：5]或基因組DNA)或者因沉默密碼子變化或產生保守性氨基酸替代的密碼子變化而與人α-Gal A DNA不同的序列可以用于遺傳修飾培養(yǎng)人細胞，使得細胞過度表達并分泌本酶。α-Gal A序列中的某些突變可以編碼保留了或展示改善的α-Gal A酶活性的多肽。比如說，特別是如果它們占蛋白質總殘基數的比率低于10％，技術人員將期望保守性氨基酸替代對生物學活性影響較小或沒有影響。保守性替代通常包括下列幾組中的替代：甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。參閱，例如美國專利5,356,804，引入本文作為參考。

Fabry病

Fabry病是由酶α-Gal A的活性缺陷引起的遺傳性紊亂?！唉?Gal A缺陷”指患者中該酶的量或活性的缺乏導致中性糖脂(如globotriaosylceramide)在血管壁組織細胞中積累異常，伴隨大腿、臀部、和生殖器上的血管角質瘤，少汗，四肢感覺異常，角膜輪生，和輻狀后囊下內障。該物質的沉積可以導致疼痛、嚴重的腎和心血管疾病、和中風。正如通常在Fabry病男性患者中觀察到的糖脂的積累會誘導嚴重的癥狀?；蛘呷缭谌毕莼虻碾s合子女性攜帶者中有時看到的，積累誘導相對微弱的癥狀。受影響個體的期望壽命大大縮短；常常大約40歲就因腎、心、或腦血管并發(fā)癥而死亡。這種疾病沒有特異性治療。歸類為溶酶體貯積紊亂的Fabry病患者在全世界有15,000人以上。

上文定義的Fabry病是一種復雜的臨床綜合癥，特征是涉及多器官和多系統(tǒng)?；加薪悄I養(yǎng)不良、皮膚病變(血管角質瘤)、痛苦的神經病、腦血管疾病、心肌病、和腎功能障礙全部病癥的患者歸為“典型性”表型。而一些沒有全部典型性表型的患者歸為“Fabry病非典型性變異型”。存在幾種與α-半乳糖苷酶A缺陷有關的非典型性變異型表型。例如，一些α-半乳糖苷酶A缺陷患者患有只涉及心的變異型Fabry病，如左心室肥大(LVH)。還存在只涉及腎的另一種變異型表型。雖然在男性半合子中已經確認了這兩種變異型表型，但是同樣在女性雜合子中也已經有變異型Fabry病的報道。

非典型性心變異型患者通常在生命后期患有癥狀性疾病。心變異型表型患者的診斷的平均年齡大約是52歲，而典型性表型大約是29歲(Desnick等人，在《遺傳性疾病的代謝和分子基礎》(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease)中，第6版，1996，Scriver等人(編)，McGraw-Hill，紐約，第2741－2784頁；Meikle等人，美國醫(yī)學學會會刊(J.Am.Med.Assoc.)281：249－254，1999)。這種綜合癥的患者通常存在微弱的心功能障礙癥狀，諸如勞力性呼吸困難。通常，標準回聲心動圖分析表明，心變異型表型患者左心室肥大(LVH)或中隔不對稱肥大。然而，患者還可能有心肌梗死或心肌病(Scheidt等人，新英格蘭醫(yī)學雜志(New Engl.J.Med.)324：395－399，1991；Nakao等人，新英格蘭醫(yī)學雜志(New Engl.J.Med.)333：288－293，1995))。這些患者經常進行心肌活組織檢查，表明變異型綜合癥的病理學與典型性Fabry病(貯積的糖脂浸潤心肌)基本相似。這些患者的α-半乳糖苷酶A酶實驗發(fā)現酶水平的范圍很廣。例如，有報導，心變異型患者的α-半乳糖苷酶A酶活性高達正常水平的30％，因此，至今尚未考慮作為α-Gal A取代療法的候選療法。

本發(fā)明人現在已經出人意料地發(fā)現，雖然非典型性心變異型或非典型性腎變異型患者的α-半乳糖苷酶A酶活性水平可能比典型性Fabry病表型患者高，但是這些患者也可以受益于α-半乳糖苷酶A酶療法。例如，患者可以具有在細胞中產生動力學不穩(wěn)定的α-Gal A酶的突變，而且對這些患者施用本發(fā)明的α-Gal A制劑顯著提高了α-Gal A酶水平。同樣，據報導，一些非典型性心變異型表型患者的α-半乳糖苷酶A第215位氨基酸具有點突變。而未突變蛋白質中的該氨基酸是糖基化的天冬酰胺(Eng等人，美國人類遺傳學雜志(Am.J.Hum.Genet.)53：1186－1197，1993)。由此，使用本發(fā)明的適當糖基化的α-半乳糖苷酶A制劑的α-Gal A酶取代療法在這些患者中可能是有效的。此外，已有報導，發(fā)現了唯一的Fabry病臨床表現是微弱的蛋白尿的非典型性腎突變型患者。然而，腎活組織檢查發(fā)現了Fabry病的典型性糖脂內含物，而α-Gal A酶實驗發(fā)現其酶水平低于正常α-Gal A水平。然而，因為在這些患者的尿沉淀物中的脫落腎小管細胞中可以檢測到腎中貯積的?；拾贝技喝擒?，所以施用本發(fā)明的α-Gal A制劑可以實質性的降低這些水平。通過與甘露糖-6-磷酸(M6P)受體的相互作用可以將溶酶體酶(諸如α-Gal A)靶向細胞的溶酶體腔，M6P受體結合定位于溶酶體腔的酶的寡糖部分中存在的M6P殘基(Kornfeld和Mellman，細胞生物學年鑒(Ann.Rev.Cell Biol.)5：483－525，1989)。初級相互作用發(fā)生于高爾基體中，結合高爾基體M6P受體的酶被分離并轉運至溶酶體?？梢韵嘈诺诙N相互作用發(fā)生于細胞外α-Gal A與位于細胞表面的M6P受體之間。不在常規(guī)系統(tǒng)中的酶是經組成性分泌途徑被細胞分泌的，而且常常被細胞表面M6P受體再次捕獲，通過內吞途徑使α-半乳糖苷酶A返回溶酶體。經內在化的細胞外物質在內吞小泡中轉運穿過細胞質，內吞小泡與初級溶酶體融合，并將其內容物全部輸入溶酶體中。在此過程中，細胞表面M6P受體也摻入到內吞小泡中并轉運至溶酶體中。具體地說，高水平唾液酸化和/或磷酸化的本發(fā)明α-Gal A制劑在治療Fabry病非典型性變異型患者時特別優(yōu)選。這樣的制劑例如能夠使從肝細胞清除的注射入α-Gal A部分最小化，并使得非肝細胞能夠攝取高水平的α-Gal A，諸如腎細胞、血管細胞、腎小管細胞、腎小球細胞、心肌細胞、和心血管細胞。

攜帶M6P殘基的細胞外α-Gal A可以結合細胞表面M6P受體，并轉運進入溶酶體腔。一旦進入溶酶體腔，α-Gal A就可以發(fā)揮適當功能。正是溶酶體酶轉運使得α-半乳糖苷酶A酶取代療法成為治療Fabry病患者的可行方法。由此，甚至當細胞有α-Gal A生成遺傳缺陷時，如果α-Gal A是適當糖基化的，且缺陷細胞攜帶M6P受體，那么細胞仍可以攝取細胞外α-Gal A。在Fabry病患者中，腎和心的血管內皮細胞嚴重地組織病理學異常，且造成該疾病的臨床病理。攜帶M6P受體的這些細胞是α-Gal A的特殊治療靶。本發(fā)明的一個目的是提供M6P存在于N-連接寡糖中的α-Gal A制劑。

α-Gal A的N-連接寡糖的唾液酸化修飾程度對α-Gal A藥物動力學和生物學分布具有實質性影響。當沒有適當的唾液酸化時，由于結合肝唾液酸化蛋白質受體(Ashwell受體)α-Gal A在肝細胞內在化并降解后，經循環(huán)系統(tǒng)快速清除(Ashwell和Harford，生化年鑒(Ann.Rev.Biochem.)51：531－554，1982)。這降低了循環(huán)系統(tǒng)中可獲得的、結合諸如腎和心的血管內皮細胞上的M6P受體的α-Gal A的量，造成了Fabry病的臨床病理。經遺傳修飾的人細胞分泌的α-Gal A具有適于治療Fabry病的糖基化特性，可以通過純化的分泌型蛋白質的傳統(tǒng)制藥學方法施用，抑或通過基因治療而不需要額外酶修飾。據已有的報導，溶酶體酶葡糖腦苷脂酶需要這種修飾，其中臨床相關細胞攝取純化的葡糖腦苷脂酶需要在從人胎盤純化之后對酶進行復雜的修飾(Beutler，新英格蘭醫(yī)學雜志(New Engl.J.Med.)325：1354－1360，1991)。

適用于α-Gal A生產的細胞

懷疑患有α-Gal A缺陷(諸如Fabry病)的個體可以用從培養(yǎng)的、經遺傳修飾的細胞(優(yōu)選地人細胞)獲得的純化的人α-Gal A進行治療。

在以治療Fabry病為目的而對細胞進行遺傳修飾時，細胞可以通過傳統(tǒng)的遺傳工程方法或通過基因激活方法來修飾。

按照傳統(tǒng)方法，含有α-Gal A cDNA或基因座DNA序列的DNA分子，可以包含在表達載體構建體中，并通過標準方法轉化到初生、次生、或永生細胞中，標準方法包括(但不限于)脂質體、聚凝胺、或DEAE葡聚糖介導的轉染、電穿孔、磷酸鈣沉淀、微注射、或速度驅動的微彈(“biolistics”)(參閱，如同樣懸而未決的USSN 08/334,797，此處引入作為參考)。技術人員或者可以使用通過病毒載體投遞遺傳信息的系統(tǒng)。已知可用于基因轉移的病毒包括腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、Sindbis(辛德畢斯)病毒、和牛痘病毒(諸如金絲雀痘病毒)。

或者，利用基因激活(“GA”)方法修飾細胞，諸如美國專利5,733,761和5,750,376所述，引入本文中作為參考。本文將基因激活產生的α-Gal A稱為GA-GAL。

因此，如本文所用，對于細胞，術語“遺傳修飾”包括導入編碼基因產物的DNA分子和/或控制基因產物編碼序列表達的調控元件后表達特定基因產物的細胞?？梢酝ㄟ^基因靶向或同源重組導入DNA分子，即在特定基因座位點導入DNA分子。同源重組可以用于取代缺陷基因自身。在Fabry病患者自身細胞中，可以用完整基因或其一部分取代缺陷型α-Gal A基因或其一部分。

如本文中所用，術語“初生細胞”包括從脊椎動物組織分離的細胞懸浮液中存在的細胞(在鋪板即吸附組織培養(yǎng)基質之前，諸如培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶)，從組織得到的外植體中存在的細胞，第一次鋪板的上述細胞種類，和從這些鋪板細胞得到的細胞懸浮液。

“次生細胞”指處于所有培養(yǎng)開始后步驟中的細胞。換言之，第一次由培養(yǎng)基質上取下鋪板的初生細胞并再次鋪板(傳代)，將之稱為次生細胞，正如隨后傳代中的所有細胞。

“細胞株”包括已經傳代一次或多次；在培養(yǎng)中展示有限次數的平均群體倍增；展示接觸抑制、依賴貼壁的生長特性(除了在懸浮培養(yǎng)中繁殖的細胞)；且不是永生的次生細胞。

“永生細胞”指源自培養(yǎng)中表觀上壽命不受限制的已建立細胞系的細胞。

初生或次生細胞的例子包括成纖維細胞、上皮細胞(包括乳房和腸上皮細胞)、內皮細胞、血液的組成元素(包括淋巴細胞和骨髓細胞)、膠質細胞、肝細胞、角質細胞、肌細胞、神經細胞、或這些細胞類型的前體。用于本方法的永生人細胞系的例子包括(但不限于)Bowes黑素瘤細胞(ATCC登記號CRL 9607)、Daudi細胞(ATCC登記號CCL 213)、HeLa細胞及其衍生物(ATCC登記號CCL 2、CCL 2.1、和CCL 2.2)、HL-60細胞(ATCC登記號CCL 240)、HT-1080細胞(ATCC登記號CCL 121)、Jurkat細胞(ATCC登記號TIB 152)、KB癌細胞(ATCC登記號CCL 17)、K-562白血病細胞(ATCC登記號CCL 243)、MCF-7乳癌細胞(ATCC登記號BTH 22)、MOLT-4細胞(ATCC登記號1582)、Namalwa細胞(ATCC登記號CRL 1432)、Raji細胞(ATCC登記號CCL 86)、RPMI 8226細胞(ATCC登記號CCL 155)、U-937細胞(ATCC登記號CRL 1593)、WI-38VA13亞系2R4細胞(ATCC登記號CLL 75.1)、CCRF-CEM細胞(ATCC登記號CCL 119)、和2780AD卵巢癌細胞(Van der Blick等人，癌癥研究(Cancer Res.)48：5927－5932，1988)，以及通過人細胞與其它物種細胞的融合產生的異種雜交瘤細胞。

在對人細胞進行遺傳修飾產生分泌α-Gal A的細胞后，可以產生基本上由遺傳性狀相同的已培養(yǎng)的初生永生人細胞集合組成的無性繁殖細胞株，即一個基本上由遺傳性狀相同的永生人細胞集合組成的無性繁殖細胞系。有一個實施方案中，無性繁殖細胞株或無性繁殖細胞系的細胞是成纖維細胞。另一個優(yōu)選的實施方案中，細胞是次生人成纖維細胞，如BRS-11細胞。

在經遺傳修飾后，培養(yǎng)細胞培養(yǎng)條件允許分泌α-Gal A。從培養(yǎng)細胞分離蛋白質步驟如下：收集使細胞生長的培養(yǎng)基和/或裂解細胞以釋放其內容物，然后應用蛋白質純化技術，得到蛋白質。

從穩(wěn)定轉染的細胞的已調節(jié)好的培養(yǎng)基純化α-Gal A

按照本發(fā)明的方法，從培養(yǎng)細胞(“α-Gal A生產細胞”)分離α-Gal A蛋白質步驟如下：收集生長細胞的培養(yǎng)基和/或裂解細胞以釋放其內容物，然后應用不使用植物凝血素親和層析的蛋白質純化技術純化蛋白質。優(yōu)選的純化過程在下文實施例2中有概述。

備選的疏水相互作用樹脂，諸如Source Iso(Pharmacia)、Macro-Methyl Support(Bio-Rad)、TSK Butyl(Tosohaas)、或Phenyl(Pharmacia)，也可以用于純化α-Gal A。層析柱可以用濃度相對較高的鹽(如1M硫酸銨或2M NaCl，于pH5.6的緩沖液中)平衡。待純化的樣品是通過調至平衡緩沖液的pH和鹽濃度制備的。將樣品加至層析柱，并用平衡緩沖液清洗層析柱以除去未結合物質。α-Gal A是用離子強度較低的緩沖液、水、或溶于水的有機溶劑(如20％乙醇或50％丙二醇)從層析柱中洗脫得到的?；蛘?，使用鹽濃度較低的平衡緩沖液和樣品或使用不同pH，讓α-Gal A流過層析柱。其它蛋白質可能與層析柱結合，使含α-Gal A的樣品不與層析柱結合，獲得純化。第一步純化步驟優(yōu)選使用羥基磷灰石層析柱。

備選的純化過程可以使用陽離子交換樹脂，如SP6Fast Flow(Pharmacia)、Source 30S(Pharmacia)、CMFast Flow(Pharmacia)、Macro-CM Support(Bio-Rad)、或Macro-High S Support(Bio-Rad)，來純化α-Gal A。“第一步層析步驟”是第一次將樣品加于層析柱(不包括與樣品制備有關的所有步驟)。α-Gal A能夠結合pH4.4的層析柱。諸如10mM醋酸鈉(pH4.4)、10mM檸檬酸鈉(pH4.4)、或在大約pH4.4具有適當緩沖能力的其它緩沖液可以用來平衡層析柱。將待純化樣品的pH和離子強度調至與平衡緩沖液一樣。將樣品加于層析柱，并在加樣后清洗層析柱以除去未結合物質。諸如NaCl或KCl等鹽可以用于從層析柱洗脫α-Gal A。或者，可以用更高pH或更高鹽濃度更高pH的緩沖液從層析柱洗脫α-Gal A。α-Gal A也可以通過在加樣過程中增加平衡緩沖液和樣品中的鹽濃度，通過在較高pH進行層析，或者通過高鹽高pH組合，使流經層析柱。

純化的另一步可以使用Q6Fast Flow來純化α-Gal A。Q6Fast Flow是相對較強的陰離子交換樹脂。較弱的陰離子交換樹脂，諸如DEAEFast Flow(Pharmacia)或Macro-DEAB(Bio-Rad)，也可以用于純化α-Gal A。層析柱是用如10mM磷酸鈉(pH6)等緩沖液平衡的。將樣品的pH調至pH6，并通過稀釋或滲濾樣品達到低離子強度。將樣品加到能夠結合α-GalA的條件下的柱上，用平衡緩沖液清洗層析柱以除去未結合物質。用如NaCl或KCl等鹽或者用較低pH緩沖液或者高鹽低pH組合洗脫α-Gal A。通過在加樣過程中增高加載物的鹽濃度，在較低pH進行層析，或者在高鹽低pH組合中層析，也可以讓α-Gal A流經層析柱。

另一純化步驟使用200(Pharmacia)大小排阻層析純化α-Gal A。其它大小排阻層析樹脂，諸如S-200HR或Bio-A-1.5cm，也可用于純化α-Gal A。大小排阻層析的優(yōu)選緩沖液是含0.05M NaCl的25mM磷酸鈉(pH6.0)。其它與配方兼容的緩沖液也可以利用，如10mM檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。緩沖液的pH可以在pH5與pH7之間，而且應當含有鹽，如NaCl或NaCl與KCl的混和物。

還有一個純化方法使用層析聚焦樹脂純化α-Gal A，諸如Polybuffer Exchanger PBE 94(Pharmacia)。在較高pH(如pH7.0或以上)平衡層析柱，將待純化樣品的pH調至相同pH，并將樣品加于層析柱上。蛋白質是用pH已調至4的Polybuffer 74(Pharmacia)等緩沖液系統(tǒng)，洗脫帶有逐漸降低至諸如4的pH的pH梯度。

或者可以利用免疫親和層析純化α-Gal A。可以將針對α-Gal A的適當的多克隆或單克隆抗體(使用標準技術，使用α-Gal A或由α-Gal A序列衍生的肽進行免疫而產生)固定在激活偶聯的樹脂上，如NHS激活的4Fast Flow(Pharmacia)或CNBr激活的4Fast Flow(Pharmacia)。將待純化樣品加于pH約為6或7的固定了抗體的層析柱上。清洗層析柱以除去未結合物質。用親和層析采用的典型試劑諸如低pH(如pH3)、變性劑(如胍-HCl或硫氰酸鹽)、或有機溶劑(如溶于pH6的緩沖液的50％丙二醇)從層析柱洗脫α-Gal A。純化過程還可以使用金屬螯和物親和樹脂如ChelatingFast Flow(Pharmacia)來純化α-Gal A。預先用金屬離子如Cu²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、或Cd²⁺使層析柱帶電荷。將待純化樣品加于pH適當的(如pH6－7.5)的層析柱，并清洗層析柱以除去未結合的蛋白質。利用咪唑或組氨酸的競爭性洗脫，或利用檸檬酸鈉或檸檬酸鉀將pH降低至6以下，或者利用諸如EDTA或EGTA等螯合劑，洗脫結合的蛋白質。

按照上述方案，本發(fā)明提供了比以前技術制備的含更高純度的α-Gal A的制劑，如由SDS-PAGE或反相HPLC測量的純度至少98％同質性，更優(yōu)選地至少99％同質性，最優(yōu)選地至少99.5％同質性。本發(fā)明的α-Gal A制劑可以含有多種α-Gal A糖形式。因此，如本文中α-Gal A制劑章節(jié)所用，術語“同質性”指基本上不含(<2％總蛋白質)α-Gal A以外的蛋白質的制劑。非α-Gal A蛋白質的例子諸如清蛋白、由宿主細胞產生的非α-Gal A蛋白質、和由動物組織或流體分離的非α-Gal A蛋白質。本發(fā)明α-Gal A制劑的比活性優(yōu)選地至少2.0x10⁶單位/mg蛋白質，更優(yōu)選地至少3.0x10⁶，最優(yōu)選地至少3.5x10⁶單位/mg蛋白質。

通過聚糖改造增加寡糖電荷增長α-Gal A制劑的循環(huán)半衰期

本發(fā)明提供了提高肝和巨噬細胞以外的特定組織攝取治療性酶的糖蛋白修飾程序。使用本發(fā)明的方法，得到了人糖基化α-Gal A制劑，其中35－85％的寡糖帶電荷，優(yōu)選地至少50％的寡糖帶電荷。

蛋白質N-糖基化通過修飾寡糖結構的適當天冬酰胺殘基起作用，影響其特性和生物學活性(Kukuruzinska和Lennon，口生物學和醫(yī)學評論(Crit.Rev.Oral.Biol.Med.)9：415－448，1998)。本發(fā)明提供了分離的α-Gal A制劑，其中主要是通過在復合聚糖上添加1－4個唾液酸殘基，在高甘露糖聚糖上添加1－2個磷酸部分，或者在雜合聚糖上添加1個磷酸和1個唾液酸使高百分率的寡糖帶負電荷。還存在較少數量的硫酸化復合聚糖。高比率的帶電荷結構具有兩個主要功能。第一，通過2,3-或2,6-連接的唾液酸掩蓋倒數第二個半乳糖殘基，由此防止通過肝細胞上的唾液酸糖蛋白受體從循環(huán)中過早清除。該受體識別含末端半乳糖殘基的糖蛋白。增長α-Gal A循環(huán)半衰期讓重要靶器官(諸如心和腎)有機會在酶輸液后從血漿中內吞更大數量的酶。第二，高甘露糖或雜合聚糖上存在Man-6-磷酸提供不依賴陽離子的Man-6磷酸受體(CI-MPR)一個受體介導的攝取機會。這種受體介導的攝取發(fā)生于許多細胞的表面，包括血管內皮細胞，這是CTH在Fabry患者中的主要儲存位點。含兩個M6P殘基的酶分子與CI-MPR的親和力大大高于含一個M6P殘基的酶分子。表1提供了有代表性的聚糖結構。

表1.有代表性的聚糖結構

N-糖蛋白的生物合成涉及多種酶、糖基轉移酶、和糖苷酶。這些酶中的大多數以有順序、有組織的方式在內質網(ER)和高爾基體中發(fā)揮功能。相同多肽中的不同天冬酰胺殘基可以用不同的寡糖結構修飾的事實增加了N-糖基化的復雜性，而各種蛋白質通過其碳水化合物部分的特征而相互區(qū)別。分子遺傳學的最新進展促成了鑒定、分離、和分析N-糖基化基因。結果，顯現出N-糖基化與其它細胞功能之間的相互關系的信息。

細胞中的N-連接糖蛋白加工是當在ER腔內向初生肽上的受體天冬酰胺加入一個單位的含Glc3Man9Nac2的寡糖鏈時開始。在多萜醇(一種鏈很長的脂肪醇)上構建了Glc3Man9GlcNAc2組成的十四糖寡糖鏈：

在ER腔內這種寡糖是作為一個單位轉移至初生肽上的受體天冬酰胺殘基上的。相對于肽而言較大的聚糖可以指導蛋白質折疊。3個葡萄糖殘基是寡糖已完成且已準備好由寡糖轉移酶轉移的信號。該酶還將轉移未葡萄糖化的寡糖，但是只占完成鏈的一部分，因為這些是亞最佳底物。人的碳水化合物缺陷糖蛋白綜合癥的一種形式已經顯示是由葡萄糖添加途徑中的第一種酶多萜醇-P-Glc:Man9GlcNAc2-PP-多萜醇葡萄糖轉移酶的缺陷引起的，導致血清蛋白質的糖基化過低(Korner等人，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)95：13200－13205，1998)。除去3個葡萄糖殘基并且構象正確后，將新合成的糖蛋白輸出至高爾基體。根據蛋白質折疊后聚糖對高爾基體甘露糖苷酶的易接近性，聚糖鏈可以仍作為含5－9個甘露糖殘基的高甘露糖鏈存在?；蛘?，可以進一步加工聚糖鏈成三甘露糖核，并成為其它糖基轉移酶的受體，通過加入更多的GlcNAc殘基后再加入Gal、NeuAc、和Fuc形成復合鏈。第三種可能是，如果蛋白質含有恰好相距與高甘露糖鏈有正確空間相互關系的兩個賴氨酸殘基，則在1個或者有時2個甘露糖殘基上添加GlcNacα-1-PO₄(Cuozzo等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)273：21069－21076，1998)。用特定的酶除去連接α的GlcNAc后，產生了跨越高爾基體的網絡中的M6P受體識別的末端M6P表位，然后將這些酶定位于間充質細胞起源的細胞中的溶酶體。

為了將α-Gal A盡可能多地定位到不同的組織，可以使用許多不同的碳水化合物結構(糖形式)。Matsuura等人，糖生物學(Glycobiology)8：329－339，1998)報導，CHO細胞中產生的人α-Gal A上的聚糖結構中41％含高甘露糖聚糖，24％磷酸化。然而，唾液酸化復合聚糖水平只有11％。因此，2/3的復合鏈未唾液酸化，導致肝臟快速清除α-Gal A。在本發(fā)明人細胞中產生的α-Gal A中帶電荷寡糖的百分率比過去的技術中CHO細胞中產生的α-Gal A高。例如，在本文中所述HT-1080細胞中合成的α-Gal A特別合適，因為在HT-1080細胞中產生的α-Gal A含有大約15％中性結構(高甘露糖和雜合物)、大約16％的磷酸化聚糖、和大約67％的含2－4個唾液酸殘基的復合聚糖。因此，與CHO細胞中產生的α-Gal A相比，基本上所有的復合鏈發(fā)生唾液酸化。HT-1080細胞α-Gal A具有3個N-連接糖基化位點。2個位點在高爾基體中加工成復合聚糖，而第三個位點被高甘露糖聚糖占據，其中50％被溶酶體酶特異的磷酸化修飾產生單磷酸化和雙磷酸化種類。

為了改造含N-連接聚糖鏈的蛋白質上的碳水化合物，本發(fā)明提供了4種方法。第一，通過在純化過程中選擇性分離糖形式來增加帶電荷α-Gal A的比率。本發(fā)明提供了通過在純化過程之中和/或之后在層析柱樹脂上分級分離α-Gal A種類來增加高度帶電荷和較大分子量α-Gal A糖形式的比率的方法。高度帶電荷的α-Gal A糖形式含有更多的唾液酸和/或更多的磷酸，而更大分子量的糖形式也將含有完全糖基化、最高度分支、且高度帶電荷的種類。選擇帶電荷種類或者除去未糖基化、弱糖基化、或弱唾液酸化和/和磷酸化的α-Gal A種類，將導致含更多唾液酸和/或更多磷酸的α-Gal A糖形式群，由此提供具有更長半衰期和潛在治療性功效的α-Gal A制劑。

此分離過程可以利用(但不限于)合適的層析柱樹脂來純化或分離α-Gal A。例如，可以利用(但不限于)陽離子交換樹脂(諸如SP－)、陰離子交換樹脂(Q-)、親和樹脂(肝素植物凝血素層析柱)、大小排阻層析柱(200)、和疏水相互作用層析柱(Butyl)和本領域已知的其它層析柱樹脂進行分離。

由于細胞中產生的α-Gal A是分子量和電荷不同的異源糖形式混和物，所以α-Gal A的從層析樹脂中洗脫的峰相對較寬。在這些洗脫中，糖形式的特定分布方式取決于所用樹脂的特性。例如，在大小排阻層析中，在洗脫曲線中較大的糖形式傾向于比較小的糖形式較早地洗脫出來。

在離子交換層析中，帶較多負電荷的糖形式傾向于用比帶較少負電荷的糖形式更大的親和力結合帶正電荷的樹脂(諸如Q-)，且由此傾向于在洗脫曲線的較晚期洗脫。相反，那些高度帶負電荷的糖形式與帶負電荷的樹脂(諸如SP)的結合比帶較少負電荷的種類更不緊密，或者甚至根本不結合。

層析樹脂上糖形式種類的分離可能受pH、離子強度、選擇的緩沖鹽、粘性、和/或其它參數(諸如樹脂類型的選擇)的影響。還可以優(yōu)化從由層析柱中選擇性地洗脫α-Gal A各種種類時使用的各種梯度洗脫類型(直線線性梯度或曲線，如指數梯度)或使用的系列短步驟洗脫以便分離α-Gal A?？梢詢?yōu)化單獨的或組合的所有這些因素以達到有效地分離糖形式。分級分離也可以在純化過程完成后在為期望糖形式群體的分離和選擇而進行了選擇性優(yōu)化的特定層析樹脂上進行。

從分離的α-Gal A種類選擇糖形式群體可以在分析了洗脫的α-Gal A糖形式后完成。可以通過多種技術分析洗脫峰，諸如(但不限于)SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳、分析性離子交換HPLC、和/或分析性大小排阻HPLC?？梢赃x擇大小或電荷特征接近期望的特定部分。選擇可以在過程中的每一個層析步驟(逐漸獲得期望的糖形式群)或限于特定的一步或幾步(如果這一步或這幾步的分離效果好)中進行。分級分離也可以在純化過程完成之后在為分離和選擇期望的糖形式群體而被選擇性優(yōu)化了的特定層析樹脂上進行。

高度帶電荷和/或分子量較大的α-Gal A糖形式的分離和選擇可以對任何α-Gal A制劑進行，諸如通過傳統(tǒng)遺傳工程方法或通過基因激活(GA)方法遺傳修飾的細胞來源的α-Gal A制劑。這也可以在提供了如上所述更高唾液酸化和磷酸化的優(yōu)化系統(tǒng)中培養(yǎng)、或如下所述PEG化α-Gal A的細胞系上進行。

例如，在如上所述的α-Gal A純化過程中，α-Gal A糖形式的分離可以在純化過程的各個步驟中進行。在疏水樹脂ButylFast Flow上，首先洗脫帶最多電荷的α-Gal A糖形式，隨后是電荷次多的種類。對于Heparin在洗脫峰中首先洗脫的也是帶最多電荷的種類，隨后是電荷次多的種類。用Q-發(fā)生的情況相反，首先洗脫電荷最少的種類，隨后是帶最多電荷的糖形式。在200的大小排阻層析上，首先洗脫最大分子量的糖形式，隨后是較小分子量、較少糖基化的α-Gal A種類。為了有效分離特定的α-Gal A糖形式群，可以組合多個層析步驟，根據不同的物理方法進行分離。例如，為了獲得pI最低的α-Gal A糖形式(含最多負電荷)，有限制地合并早期butyl洗脫液將會增強帶較多電荷的α-Gal A。將選擇的這些合并液應加于肝素層析柱上，并再次有限制的合并較早的、帶較多負電荷的α-Gal A種類，更加增強了合并液中低pI的α-Gal A糖形式所占比率?？梢栽诩兓^程的各個步驟中，通過SDS-PAGE和等電聚焦監(jiān)控洗脫液的大小和電荷分布來進一步精細調整糖形式群的。下文實施例2.4概述了通過大小和電荷的不同進行分離的例子。

用于碳水化合物改造的第二種方法包括使用純化的糖基轉移酶和適當的核苷酸糖供體通過附著額外的末端糖殘基來修飾純化的α-Gal A的某些糖形式。這種處理只影響那些含適當的游離末端糖殘基作為所用糖基轉移酶的受體的糖形式。例如，α2,6-唾液?；D移酶以CMP-唾液酸作為核苷酸糖供體在末端Galβ 1,4GlcNAc-R受體上以2,6-連接鍵添加唾液酸。商品化的酶及其來源物種包括：墨角藻糖α1,3轉移酶III、V、和VI(人)；半乳糖α1,3轉移酶(豬)；半乳糖β1,4轉移酶(牛)；甘露糖α1,2轉移酶(酵母)；唾液酸α2,3轉移酶(大鼠)和唾液酸α2,3轉移酶(大鼠)。反應完成后，可以通過糖基轉移酶特異親和柱(含有通過焦磷酸(GDP、UDP)或磷酸(CMP)酯鍵經6碳臂結合凝膠的適當核苷酸)或通過本領域已知的其它層析方法從反應混和物中除去糖基轉移酶。在上文所列的糖基轉移酶中，唾液?；D移酶對于酶(諸如α-Gal A)的修飾特別有用，可用于人患者的酶取代療法。使用唾液?；D移酶與作為核苷酸糖供體的CMP-5-熒光素-神經氨酸產生了熒光標記的糖蛋白，從而可以容易的監(jiān)控其攝取和組織分布。

用于碳水化合物改造的第三種方法包括α-Gal A生產細胞的糖工程，如導入影響細胞糖基化機制的基因以修改高爾基體中的翻譯后加工，是優(yōu)選的方法。

用于碳水化合物改造的第四種方法包括用適當的糖苷酶處理α-Gal A以降低不同糖形式的存在數目。例如，用神經氨酸苷酶、β-半乳糖苷酶、和β-氨基己糖苷酶相繼處理復合聚糖從而將寡糖切至三甘露糖核。

N-連接聚糖的結構取決于蛋白質折疊后聚糖鏈相對于高爾基體中加工的甘露糖苷酶的可獲得性和高爾基體中存在的糖基轉移酶家族和適當核苷酸糖供體。許多糖基轉移酶催化競爭性反應，導致聚糖鏈以多種不同且兼容的方式延伸，這取決于是哪種酶首先催化反應。這導致糖形式復雜家族中的微形成和異質性。有些結構對于單個組織是獨特的，諸如通過添加GalNAc-4-SO₄修飾某些垂體激素，或者將這些結構限制于少數器官。

后者的例子是腎而非肝中谷氨酰轉肽酶的復合聚糖上的所謂對分GlcNAc(GlcNAc以β1,4與核心β-甘露糖殘基連接)。γ-谷氨酰轉肽酶上的對分二岔結構顯示如下：

在哺乳動物中，在腦和腎的某些細胞中以及肝癌患者的肝的某些細胞中發(fā)現起作用的酶GlcNAc轉移酶III(GnT-III)。GnT-III催化向N-連接糖鏈的三甘露糖核的β-連接甘露糖以β1,4連接添加N-乙酰氨基葡萄糖，產生對分GlcNAc殘基。小鼠、大鼠、和人的GnT-III基因已經得到了克隆(Ihara等人，生化雜志(J.Biochem.)(東京)113：692－698，1993)。

人細胞中存在的其它GlcNAc轉移酶III活性可以以二岔、三岔、和四岔復合聚糖為代價而生產更多的單磷酸化雜合聚糖。這對血漿中的半衰期不會有不利影響，但是可以加強在血管內皮細胞中的定位。代表性結構顯示如下：

有些α-Gal A由腎攝取并導致明顯降低了貯積糖脂。因為腎可以用對分GlcNAc殘基形成N-聚糖，所以腎上皮細胞能夠識別帶有該表位特異性特別高的糖蛋白。

升高的GnT-III活性可以通過抑制GnT-II、IV、V、和Galβ1,4-轉移酶在底物水平的進一步分支而引起在三甘露糖核的分支中的不平衡。最近，通過過度表達重組GnT-III產生了能夠在糖蛋白上產生對分寡糖的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(Sburlati等人，生物技術進展(Biotechnol.Progr.)14：189－192，1998)。選擇β-干擾素(IFN-β)作為模型和潛在的治療性分泌型異源蛋白質，來評估GnT-III表達對產物糖基化的影響。帶有對分寡糖的IFN-β是GnT-III改造的CHO細胞而非未修飾親本細胞系產生的。

糖蛋白治療劑的生產需要針對各個批次間是否一致進行糖基化鑒定。已經將“假定N-聚糖電荷Z”作為簡單、有效方式分析蛋白質糖基化的參數。已經多次重復實驗驗證了Z測定，并證明是高度精確和可靠的(Hermentin等人，糖生物學(Glycobiology)6：217－230，1996)。由高效陰離子交換層析(HPAEC)/脈沖電流檢測(PAD)獲得的N-聚糖曲線能夠推導出給定糖蛋白的假設N-聚糖電荷。在HPAEC中，按照其電荷(如唾液酸殘基數)可以清楚地分開N-聚糖，得出中性結構以及單、二、三、和四唾液酸化N-聚糖的不同區(qū)域。Z的定義是無唾液酸、單唾液酸、二唾液酸、三唾液酸、四唾液酸、和五唾液酸區(qū)的各個面積(A)分別乘以相應電荷后的和：

Z＝A_{(無唾區(qū))}·0+A_{(單唾區(qū))}·1+A_{(二唾區(qū))}·2+A_{(三唾區(qū))}·3+A_{(四唾區(qū))}·4[+A_{(五唾區(qū))}·5]

Z＝ΣA_(i)·(i)

其中i在無唾液酸區(qū)(無唾區(qū))是0，在單唾液酸區(qū)(單唾區(qū))是1，在二唾液酸區(qū)(二唾區(qū))是2，在三唾液酸區(qū)(三唾區(qū))是3，在四唾液酸區(qū)(四唾區(qū))是4，在五唾液酸區(qū)(五唾區(qū))是5。

因此，大多數C4-4*結構的糖蛋白Z≌400，大多數C2-2*結構的糖蛋白總計Z≌200，而只具有高甘露糖種類或截短結構的糖蛋白Z≌0。

如Z數目測量所得，本發(fā)明的人糖基化α-Gal A制劑所含寡糖電荷超過100，優(yōu)選超過150，更優(yōu)選超過170。

通過磷酸化來改變血清α-Gal A的半衰期

可以改變α-Gal A的磷酸化來影響α-Gal A的循環(huán)半衰期和進入細胞的α-Gal A水平。優(yōu)選地在表達α-Gal A的細胞內進行磷酸化。值得特別關注的是，獲得磷酸化增加的糖基化α-Gal A制劑的過程：首先將編碼磷酸轉移酶的DNA序列導入α-Gal A生產細胞，或者通過同源重組導入調控序列來調控內源磷酸轉移酶基因的表達；然后在表達α-Gal A和磷酸轉移酶的條件下培養(yǎng)α-Gal A生產細胞；最后分離磷酸化程度比不含多核苷酸的細胞產生的α-Gal A更高的α-Gal A制劑。這些磷酸轉移酶在本領域是眾所周知的。參閱，例如美國專利5,804,413和5,789,247，引入本文中作為參考。

在溶酶體蛋白酶上產生M6P識別標記需要兩種膜結合的高爾基體酶的協(xié)同作用。第一種，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖:糖蛋白N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸轉移酶(GlcNAc磷酸轉移酶)，它需要溶酶體酶上的蛋白質識別決定簇，由相距與高甘露糖鏈具有正確空間關系的兩個賴氨酸殘基組成。第二種，N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸二酯α-N-乙酰氨基葡糖苷酶(磷酸二酯α-GlcNAcase)，水解暴露M6P識別位點的α-GlcNAc-磷酸酯鍵。

按照本發(fā)明的方法，由本發(fā)明方法生產的α-Gal A制劑具有多種糖形式，其中16－50％的糖形式發(fā)生了磷酸化，優(yōu)選地25－50％，更優(yōu)選地至少30％。

通過增加唾液酸化來改變血清α-Gal A的半衰期

增加具有末端半乳糖殘基的未脫唾液酸聚糖的唾液酸化可以用唾液?；D移酶基因轉染哺乳動物和優(yōu)選的人細胞來完成。

本發(fā)明提供了如下產生的寡糖電荷增加的糖基化α-Gal A制劑：首先將編碼唾液酰基轉移酶的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞，或者通過同源重組導入調控內源唾液?；D移酶基因表達的調控序列；然后在表達α-Gal A和唾液?；D移酶的條件下培養(yǎng)α-Gal A生產細胞；隨后的步驟包括分離寡糖電荷增加的α-Gal A制劑。優(yōu)選的唾液?；D移酶包括α2,3-唾液酰基轉移酶和α2,6-唾液?；D移酶。這些唾液?；D移酶是眾所周知的。例如，參閱美國專利5,858,751，引入本文中作為參考。

在優(yōu)選的實施方案中，增加唾液酸化的該方法包括通過分離或純化本制劑來選擇大小或電荷增加的α-Gal A糖形式的額外步驟(如下文討論的)。

或者，本發(fā)明提供了通過在低銨環(huán)境中維持細胞來加強唾液酸化的方法。特別是，通過將α-Gal A生產細胞接觸銨濃度低于10mM(更優(yōu)選低于2mM)的培養(yǎng)基來獲得唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制劑?？梢酝ㄟ^灌注生產細胞定期除去培養(yǎng)基中的有害代謝物(諸如氨)來加強唾液酸化。在優(yōu)選的實施方案中，低銨環(huán)境是通過向生產細胞加入谷氨酰胺合成酶基因或cDNA來兌現?；蛘撸眯迈r培養(yǎng)基灌注α-Gal A生產細胞來兌現低銨環(huán)境，將銨濃度維持在10mM以下，更優(yōu)選地低于2mM?；蛘?，可以用新鮮培養(yǎng)基間歇灌注生產細胞。如本發(fā)明所用，間歇灌注指在規(guī)則的、定期的間隔時間，或在測量銨濃度之后進行灌注，逐漸達到靶濃度(即10mM，更優(yōu)選地低于2mM)。間歇灌注的頻率應當相當，使得銨濃度從不超過靶濃度。灌注生產細胞足夠的時間，獲得α-Gal A制劑，其中總聚糖的50－70％發(fā)生了唾液酸化，優(yōu)選地60％。

通過α-Gal A的PEG化來延長血清α-Gal A的循環(huán)半衰期

同樣按照本發(fā)明，可以將α-Gal A與聚乙二醇復合來延長人糖基化α-Gal A制劑的循環(huán)半衰期。聚乙二醇(PEG)是水溶性聚合物，當與蛋白質共價連接時，能夠改變蛋白質的特性從而擴大它們的潛在用途。聚乙二醇修飾(“PEG化”)是一種已完善建立的技術，能夠解決或改善蛋白質或肽制藥學的許多問題。

與未修飾形式相比，PEG-蛋白質改進后的藥理學表現促成了這種共軛物發(fā)展成為治療劑。使用天然酶治療無效(由于快速清除和/或免疫學反應)的酶缺陷疾病，現在可以用等同的PEG-酶進行治療。例如，PEG-腺苷脫氨酶早已獲得FDA認證(Delgado等人，治療性藥物載體系統(tǒng)評論(Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.)9：249－304，1992)。

PEG與綠色咖啡豆的α-半乳糖苷酶的共價吸附，通過掩蓋分子上的特異決定簇位點而改變了酶的催化特性。這導致針對對-硝基酚的K_m上升而V_max下降(Wieder和Davis，應用生化雜志(J.Appl.Biochem.)5：337－347，1983)。α-半乳糖苷酶仍然能夠從人唾液血型物質B切除末端半乳糖殘基。PEG-α-半乳糖苷酶喪失了與抗體和植物凝血素的特異結合。由天然α-半乳糖苷酶產生的抗體能夠阻斷酶活性，但是當對PEG的量越來越多的酶制劑進行測試時，發(fā)現這種抑制逐漸喪失。相反，PEG-α-半乳糖苷酶免疫的動物的抗血清不抑制任何α-半乳糖苷酶或PEG-α-半乳糖苷酶制劑的酶活性。這些結果表明PEG傾向于覆蓋特異于植物凝血素的碳水化合物部分和抗原決定簇，而且這些位點在PEG-酶的體內加工過程中可能仍然是未暴露的。

PEG與蛋白質的共價吸附需要激活聚合物的末端羥基，聚合物上的合適離去基團可以用賴氨酸的ε-氨基和N-末端α-氨基的親核攻擊取代。已經開發(fā)出激活PEG的多種化學基團。對于每種特定應用，不同的偶聯方法具有不同的優(yōu)點。不同的PEG化方法對獲得的PEG化蛋白質和肽的持續(xù)的生物學活性、穩(wěn)定性、和免疫原性等因素具有令人驚訝的和戲劇性的影響(Francis等人，國際血液學雜志(Int.J.Hematol.)68(1)：1－18，1998)。例如，無接頭PEG化技術只將PEG吸附到靶分子上。更具體的說，如Francis等人(國際血液學雜志(Int.J.Hematol.)68(1)：1－18(1998)所述，對多種靶蛋白應用tresyl單甲氧基PEG(TMPEG)的生物學優(yōu)化PEG化方法，發(fā)現了出人意料的保存靶分子生物學活性方面的能力。這和之外不向蛋白質添加PEG以外的其它試劑(顯示在用于人治療中是安全的)的優(yōu)點使得這種方法對于修飾α-Gal A是理想的。

蛋白質上用于偶聯PEG的4個可能的位點是(1)氨基(N-末端和賴氨酸)；(2)羧基(天冬氨酸和谷氨酸)；(3)巰基(半胱氨酸)；和(4)碳水化合物基團(高碘酸鹽處理后產生的醛類)。與蛋白質的羧基和碳水化合物的醛基偶聯需要含親核氨基的PEG試劑。PEG結合帶負電荷的羧基后，這種化學作用改變了α-Gal A的pI。pI的任何變化可能影響α-Gal A的生物學活性。此外，將PEG與碳水化合物鏈偶聯可能影響M6P受體攝取α-Gal A，這對于生物學活性起決定性的。巰基化學還影響分子的物理結構，因而不推薦。

PEG化的常用方法在蛋白質的氨基與單甲氧基-PEG的甲氧基之間形成酰胺鍵。NHS-PEG已經商品化，它在蛋白質與PEG之間產生酰胺鍵。酰胺鍵的形成由于失去了帶正電荷的-NH₂基團從而改變了pI。

將PEG與α-Gal A偶聯而不影響其pI的方法使用的是tresyl-PEG。tresyl-PEG通過氨基發(fā)生偶聯并形成穩(wěn)定的仲胺。仲胺提供了保留氨基正電荷的優(yōu)勢。tresyl-PEG試劑已經商品化，而且作為凍干粉末是穩(wěn)定的。tresyl-PEG已經徹底鑒定，而且反應和副產物也已經徹底了解。因此，在優(yōu)選的實施方案中，將α-Gal A制劑與tresyl單甲氧基復合(TMPEG)，形成PEG化的α-Gal A。然后純化PEG化的α-Gal A得到分離的PEG化α-Gal A。

α-Gal A含有18個氨基，17個ε-氨基(賴氨酸)和1個α-氨基(N-末端)。可以控制反應以產生含取代極少的α-Gal A，然后可以從未取代或多重取代的形式純化每分子含1個PEG或每分子的PEG平均數更小的分子。α-Gal A上的多重取代可能對生物學活性沒有明顯影響；因此終產物可能含有吸附了1－18個PEG分子的異種混和物組成。取代水平將取決于保留的酶活性水平。應當注意的是，降低的酶活性可以通過延長α-Gal A的循環(huán)半衰期和降低α-Gal A的免疫識別，增強了治療效果來彌補。因此，在開發(fā)PEG-α-Gal A產品時，PEG與α-Gal A的比率將取決于生物學活性，而不僅是酶活性。

PEG化反應需要控制pH、緩沖液組成、和蛋白質濃度。適當的反應條件可以通過目前用于制造過程的超濾/滲濾步驟來兌現。臨反應前，將tresyl-PEG快速溶于水，連續(xù)攪動。然后將此溶液加入制備的α-Gal A，并于控制的時間內于控制的溫度進行反應(如2小時和250℃)。PEG化可以在最終純化過程之前進行，這樣在純化過程中就不需要加入步驟。偶聯完成后，在純化過程的剩余步驟中加之PEG-α-Gal A。在Q層析(陰離子交換)之前進行反應允許在兩步純化步驟中除去反應副產物。由于PEG不帶負電荷，它不能保留在Q上，將洗脫在柱外體積中。

PEG化的量是可以通過已知技術測量的。例如，當熒光胺結合蛋白質的α-氨基和ε-氨基時會發(fā)熒光。PEG化后的熒光損失百分率與結合α-Gal A的PEG百分率有關?？梢岳肞ierce總蛋白質BCA實驗測定蛋白質濃度。將羥甲香豆素-α-D-半乳糖吡喃糖苷(4-MUF-α-Gal)活性實驗用于評估對PEG-α-Gal A酶活性的作用。α-Gal A包含吸進溶酶體所需要的M6P。可以使用基于細胞的測試，監(jiān)控細胞中PEG-α-Gal A進入溶酶體來評估PEG對M6P受體識別的干涉。

α-Gal A制劑的施用方法

本發(fā)明的組合物(即包含多種α-Gal A糖形式)可以通過任何與α-Gal A制劑兼容的途徑施用。純化的α-Gal A制劑可以對α-Gal A蛋白質生成不足或缺陷或者受益于α-Gal A治療個體施用。本發(fā)明的治療性制劑可以通過任何適當的方法直接地(如局部性的地，如通過注射、植入、或局部對組織部位施用)或全身性的(如通過口服或胃腸外)提供給個體。

施用途徑可以是口服或胃腸外，包括靜脈內、皮下、動脈內、腹膜內、眼、肌肉內、口、直腸、陰道、眼窩內、腦內、真皮內、顱內、脊柱內、心室內、鞘內、池內、囊內、肺內、鼻內、穿粘膜、穿真皮、或吸入。肺內投遞的方法、器械、和藥物制劑描述于，例如美國專利5,785,049、5,780,019、和5,775,320，引入本文中作為參考。真皮內投遞的優(yōu)選方法是通過貼劑離子電滲投遞，美國專利5,843,015教授了這種投遞的一個例子，引入本文中作為參考。

特別有用的施用途徑是皮下注射?？梢园驯景l(fā)明α-Gal A制劑配制成以一次注射1－2ml施用所需總劑量。為了能夠進行1－2ml體積的注射，可以把本發(fā)明α-Gal A制劑的濃度配制成在1－2ml體積中含有優(yōu)選劑量，或者將α-Gal A制劑配制成凍干粉形式，在施用前用水或合適的生理學兼容緩沖液再構成配方。α-Gal A制劑的皮下注射具有方便患者的優(yōu)點，特別是能夠自己施用，同時血漿半衰期比例如靜脈內施用更長。延長血漿半衰期導致在較長時間內可以維持有效的血漿α-Gal A水平，這樣的優(yōu)點是加大了臨床上受影響的組織注射的α-Gal A的接觸，結果增加了進入這些組織的α-Gal A。這給患者帶來更多有利的影響和/或降低施用頻率。此外，正如上面討論的多種為方便患者設計的裝置，諸如可再注注射筆和無針頭注射裝置可以與本發(fā)明α-Gal A制劑一起使用。

可以是定期注射大劑量制劑，或者可以是從外部的(如IV袋)或內部的(如生物學可蝕植入物、生物學人造器官、或植入α-Gal A的生產細胞群)儲藏庫，在靜脈內或腹膜內施用。參閱，例如美國專利4,407,957和5,798,113，引入本文中作為參考。肺內投遞的方法和器械在例如美國專利5,654,007、5,780,014、和5,814,607中有敘述，文獻引入本文中作為參考。其它有用的胃腸外投遞系統(tǒng)包括乙烯－乙烯乙酸酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸液系統(tǒng)、泵投遞、包囊細胞投遞、脂質體投遞、針頭投遞注射、無針頭注射、噴霧器、氣霧器、電穿孔、和透皮貼。無針頭注射裝置在美國專利5,879,327、5,520,639、5,846,233、和5,704,911，這些專利的說明書引入作為參考。任何上述α-Gal A制劑都可以用這些方法施用。

途徑和蛋白質的投遞量可以根據熟練技術人員完全能夠評估的因素來決定。此外，熟練技術人員知道對于指定患者，治療性蛋白質的施用途徑和劑量可以改變，直到達到起治療作用的劑量水平。

α-Gal A蛋白質的制藥學配方

本發(fā)明還提供了基本上不含非α-Gal A蛋白質(諸如清蛋白、由宿主細胞產生的非α-Gal A蛋白質、或由動物組織或流體分離的蛋白質)的α-Gal A制劑的新配方。

制劑優(yōu)選包含部分水性或生理學相容流體懸浮液或溶液。由于載體是生理學相容的，所以除了向患者投遞需要的制劑，它對患者的電解質和/或容積平衡沒有不良影響。用于胃腸外施用的溶液可以通過制藥學領域眾所周知的任何方法制備。參閱，如《雷明頓制藥科學》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，A.Gennaro編，Mack出版社，1990。也可以使用非胃腸外配方，諸如栓劑和口服配方。

優(yōu)選地，配方含有賦形劑。配方中可能包括的、α-Gal A的制藥學可接受的賦形劑是緩沖液，諸如檸檬酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、和碳酸氫鹽緩沖液、氨基酸、尿素、乙醇、抗壞血酸、磷脂；蛋白質，諸如血清清蛋白、膠原蛋白、和明膠；鹽，諸如EDTA或EGTA和NaCl；脂質體；聚乙烯吡咯烷；糖，諸如葡聚糖、甘露醇、山梨醇、和甘油；丙二醇和聚乙二醇(如PEG-4000、PEG-6000)；甘油；甘氨酸和其它氨基酸；和脂類。與α-Gal A制劑一起使用的緩沖液系統(tǒng)包括檸檬酸鹽；醋酸鹽；碳酸氫鹽；和磷酸鹽緩沖液(都可從Sigma獲得)。磷酸鹽緩沖液是優(yōu)選的代表。α-Gal A制劑的優(yōu)選pH范圍是pH4.5－7.4。

配方還優(yōu)選包含非離子去污劑。優(yōu)選的非離子去污劑包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、屈立通X-100、屈立通X-114、Nonidet P-40、辛基α-葡萄糖苷、辛基β-葡萄糖苷、Brij 35、Pluronic、和吐溫20(都可從Sigma獲得)。

特別優(yōu)選的配方含有聚山梨酯20或聚山梨酯80非離子去污劑和磷酸鹽緩沖液，最優(yōu)選地pH6。

對于凍干α-Gal A制劑，蛋白質濃度可以是0.1－10mg/mL?？梢栽趦龈苫旌臀镏屑尤肱蛎泟T如甘氨酸、甘露醇、清蛋白、和葡聚糖。另外，還可以向凍干混和物中加入可能的冷凍保護劑，諸如二糖、氨基酸、和PEG。還可以加入上文列出的任何緩沖液、賦形劑、和去污劑。

在優(yōu)選配方中，用于注射的α-Gal A的濃度是1mg/mL。

施用配方可以包括甘油和其它高粘度組分，有助于將試劑保持在期望部位。生物學相容性聚合物，優(yōu)選生物學可再攝取的、生物學兼容的聚合物(包括如透明質酸、膠原蛋白、聚丁酸酯、丙交酸、和乙交酸聚合物，以及丙交酸/乙交酸共聚物)，可以作為賦形劑控制試劑在體內釋放。胃腸外配方可以具有口服施用的甘氨膽酸鹽、直腸施用的甲氧水楊酸鹽、或陰道的cutric acid。直腸施用的栓劑可以通過混和本發(fā)明α-Gal A制劑與無刺激性賦形劑(諸如可可脂或在室溫是固態(tài)而在體溫是液態(tài)的其它組分)制備。

吸入施用配方可以包括乳糖或其它賦形劑，或者可以是含有聚氧乙烯-9-十二醚、糖膽酸鹽、或脫氧膽酸鹽的水溶液。優(yōu)選的吸入氣霧劑的特征為具有質量密度小，個大的顆粒。質量密度小于0.4g/cm³且平均直徑超過5μm的顆粒能將吸入的治療劑有效地投遞至體循環(huán)中。這些顆粒被深深的吸入肺中，并能逃避肺的自然清除機制，直至吸入顆粒遞送裝載的治療劑(Edwards等人，科學(Science)276：1868－1872，1997)。例如使用美國專利5,654,007、5,780,014、和5,814,607所述的制備和配制方法可以氣霧劑形式施用本發(fā)明α-Gal A制劑，文獻引入本文中作為參考。鼻內施用配方可以包括以鼻滴液形式施用的油性溶液，或者鼻內施用的凝膠。

將α-Gal A制劑分散在皮膚病學可接受載體(諸如洗液、乳膏、油膏、或肥皂)中可以制備皮膚表面局部施用配方。特別有用的載體能夠在皮膚上形成薄膜或薄層從而能局部應用并抑制清除。為了局部施用于內部組織表面，可以將α-Gal A制劑散布于液體組織膠合劑或已知能增強組織表面攝取的其它物質中。例如，對于穿粘膜藥物投遞，已經敘述過多種粘膜膠合劑和口含片劑，諸如美國專利4,740,365、4,764,378、和5,780,045，引入本文中作為參考。其中還可以摻入羥丙纖維素或纖維蛋白原/凝血酶溶液?；蛘?，使用組織覆蓋液，諸如含果膠配方。

本發(fā)明制劑可以裝備在適當的分裝和儲存過程中適合于保持無菌，保護活性成分的活性、并可方便有效獲得對患者施用的試劑的容器中。也可以裝備在適于使用針頭和注射器取藥的封閉藥瓶中，以供應α-Gal A制劑的可注射配方。藥瓶可以一次性或多次使用。還可用預裝注射器供應制劑。在某些情況中，可在液體配方中供應內容物；而在其它情況中，可以干燥或凍干狀態(tài)供應，在某些情況中，需要用標準的或可供應的稀釋劑重構成液體狀態(tài)。當以靜脈內施用液體形式供應制劑時，可以在適合于連接靜脈內施用線或導管的無菌袋或容器中提供。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明制劑是在便于施用預定劑量的制劑的裝置中，以液體或粉末配方供應；這些裝置的例子包括用于皮下或肌肉內注射的無針頭注射器和計量式氣霧投遞裝置。在其它情況中，本制劑可以適合于持續(xù)釋放的形式供應，諸如應用于皮膚穿真皮施用的貼劑或敷料，或者用于穿粘膜施用的可蝕裝置。在以片劑或丸劑形式口服施用本制劑的情況中，制劑可以在帶可摘蓋的瓶中供應。容器可以標有說明諸如制劑類型、制造者或分裝者姓名、指示、建議劑量、正確儲存指示、或施用指示等。

α-Gal A制劑的施用劑量

本發(fā)明還提供了對Fabry病、Fabry病非典型性變異型、或者α-Gal A水平降低或存在α-Gal A突變形式的任何病癥的患者施用α-Gal A制劑的方法。施用劑量優(yōu)選地每kg體重0.05－5.0mgα-Gal A制劑，更優(yōu)選0.1－0.3mg，一周一次或兩周一次。在優(yōu)選的實施方案中，施用劑量約0.2mg/kg，二周一次。在患者的生命期中有必要有規(guī)則的重復施用蛋白質劑量。可以利用皮下注射維持較長期的全身性接觸藥物。皮下劑量可以是每kg體重0.01－10.0mgα-Gal A制劑，優(yōu)選0.1－5.0mg，一周一次或兩周一次。肌肉內注射的α-Gal A制劑劑量可以與皮下注射相同或不同；在優(yōu)選的實施方案中，肌肉內劑量較小，且施用頻率較低。α-Gal A制劑還可以靜脈內施用，如靜脈內大劑量注射、慢推靜脈內注射、或連續(xù)靜脈內注射。連續(xù)IV輸液(如2－6小時)能夠維持特定的血液中水平。

對患者施用α-Gal A制劑的備選優(yōu)選方法包括在幾年時間(如長達3年)里一周一次或兩周一次施用優(yōu)選劑量的α-Gal A制劑，在此期間對患者進行臨床監(jiān)控以評價其疾病狀況。通過例如改善腎或心功能或者患者整體健康(如疼痛)測量的臨床進步，和通過例如尿、血漿、或組織CTH水平的下降的實驗室測量的進步，評價患者的健康狀況。在治療和監(jiān)控期間觀察到臨床進步的情況后，可以降低α-Gal A的施用頻率。例如，接受一周一次注射α-Gal A制劑的患者可以改成兩周一次注射?；蛘?，接受兩周一次注射α-Gal A制劑的患者可以改成一月一次注射。在服藥頻率改變之后，應當對患者再監(jiān)控幾年，如3年，以評價與Fabry病相關的臨床和實驗室測量結果。在優(yōu)選的實施方案中，如果改變服藥頻率，則不改變施用劑量。這確保了在每次施用劑量后某些藥物動力學參數(如最大血漿濃度[C_max]、達到最大血漿濃度的時間[t_max]、血漿半衰期[t_1/2]、和以曲線下面積[AUC]測量的暴露)保持相對恒定。維持這些藥物動力學參數將導致服藥頻率改變時受體介導的α-Gal A攝取進入組織的水平相對恒定。

非典型性變異型Fabry病(如展示主要為心血管異?；蚰I累及)患者可以用這些相同的劑量方案,即0.05－5mg/kg體重，一周一次或兩周一次治療。劑量可以根據需要調整。例如，使用α-半乳糖苷酶A酶取代療法治療的心變異型表型患者在治療后心臟組成將變化心功能將得到改善。這種變化可以用檢測Fabry病患者左心室壁厚度增加的標準回聲心動圖測量(Goldman等人，J Am Coll Cardiol 7：1157－1161，1986)。在治療過程中可以進行左心室壁厚度的一系列回聲心動圖測量，而心室壁大小的減小表明對治療有應答。接受α-Gal A酶取代療法的患者還可以用心核磁成像(MRI)進行追蹤。MRI能夠評價指定組織的相對組成。例如，心MRI表明，相對于對照患者，Fabry病患者在心肌膜內沉積脂類(Matsui等人，美國心臟雜志(Am Heart J)117：472－474，1989)。對接受酶取代療法的患者的一系列心MRI評價表明患者心臟中脂類沉積有變化。腎變異型表型患者也能受益于α-半乳糖苷酶A酶取代療法。治療效果可以通過腎功能標準測試來測量，諸如24小時尿蛋白水平、肌酸酐水平、和腎小球過濾速率。下列實施例是為了更全面地例示本發(fā)明的優(yōu)選實施方案而提供的。決不應當認為這些實施例是所附權利要求確定的本發(fā)明范圍的限制。

實施例

實施例1.設計用于投遞并表達α-Gal A的構建物的制備與用途

構建了兩種表達質粒，pXAG-16和pXAG-28。這些質粒含有編碼α-Gal A酶398個氨基酸(不含α-Gal A信號肽)的人α-Gal A cDNA、由人生長激素(hGH)基因第一個內含子中斷的hGH信號肽基因組DNA序列、和含多聚腺苷酸化信號的hGH基因3’非翻譯序列(UTS)。質粒pXAG-16含有人細胞肥大病毒立即早期(CMV IE)啟動子和第一個內含子(側翼為非編碼外顯子序列)，而質粒pXAG-28由膠原蛋白Iα2啟動子和外顯子1驅動，它還包含β-肌動蛋白基因的5’UTS(含β-肌動蛋白基因的第一個內含子)。

1.1克隆完整的α-Gal A cDNA和構建α-Gal A表達質粒pXAG-16

從人成纖維細胞cDNA文庫克隆人α-Gal cDNA是如下構建的。mRNA是從總RNA分離的，cNDA的合成是使用λ系統(tǒng)的試劑按照制造商(Stratagen公司，La Jolla，CA)的說明進行。簡而言之，cDNA的“第一條鏈”是存在含內部XhoI限制性內切酶位點的寡聚dT引物時，通過逆轉錄產生的。繼RNA酶H處理之后，用DNA聚合酶I對cDNA進行缺刻翻譯產生雙鏈cDNA。用T4DNA聚合酶將此cDNA末端補平，并連接EcoRI銜接頭。將連接產物用T4 DNA激酶進行處理并用XhoI進行消化。通過-400層析分離cDNA。合并大的和中等大小的收集液，并將cDNA與EcoRI和XhoI已消化的λZapII臂連接。然后對此連接產物進行包裝并滴定。初級文庫的滴度為1.2x10⁷pfu/mL，平均插入片段大小為925bp。

來自人α-Gal A基因外顯子7的210bp探針(圖1，SEQ ID NO：1)已經被用于分離cDNA。探針自身是通過聚合酶鏈反應(PCR)使用下列寡核苷酸：5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3'(寡聚物1；SEQ ID NO：6)和5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3'(寡聚物2；SEQ ID NO：7)從基因組DNA分離得到的。然后將PCR產物用于篩選成纖維細胞cDNA文庫，分離陽性克隆并進一步鑒定。將一個陽性克隆，噬菌體3A，根據制造商的說明進行λ系統(tǒng)切除方案(Stratagene公司，La Jolla，CA)。在這一步驟產生質粒pBSAG3A，該質粒在pBluescriptSK-^TM質粒主鏈中含有α-Gal A cDNA序列。DNA測序發(fā)現此質粒不包含cDNA序列的完整5’端。因此，5’端是使用由人基因組DNA擴增的PCR片段再構成的。為此，使用了下列寡核苷酸：5’-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3’(寡聚物3；SEQ ID NO：8)和5’-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3’(寡聚物4；SEQ ID NO：9)擴增了268bp基因組DNA片段(圖2，SEQ ID NO：2)。將此片段亞克隆到“TA”克隆質粒(Invitrogen公司，San Diego，CA)中，產生質粒pTAAGEI。用SacII和NcoI消化含大半α-Gal A cDNA序列的質粒pBSAG3A和含α-Gal A cDNA 5’端的質粒pTAAGEI。圖2表示了相關的SacII和NcoI位點在擴增的DNA片段中的位置。從pTAAGEI分離0.2kb的SacII-NcoI片段，與同樣消化的pBSAG3A連接。這一質粒，pAGAL含有完整的α-Gal A cDNA序列，含有編碼α-Gal A信號肽的序列。將它的cDNA完整測序(表示于圖3，包括α-Gal A信號肽；SEQ ID NO：3)發(fā)現與人α-Gal A cDNA的發(fā)表序列相同(Genbank序列HUMGALA)。

如下，經多種中間物構建了質粒pXAG-16。首先，用SacII和XhoI消化pAGAL并補平末端。然后，將完整的α-Gal A cDNA的末端與XbaI接頭連接并亞克隆到經XbaI消化的pEF-BOS(Mizushima等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.)18：5322，1990)中產生pXAG-1。此構建物在編碼α-Gal A和α-Gal A信號肽的cDNA側翼具有人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)3’UTS和人延伸因子-1a(EF-1a)啟動子，使α-Gal A cDNA的5’端與EF-1a啟動子融合。為了制成帶有CMV IE啟動子及第一個內含子的構建物，從pXAG-1切下為2kb XbaI-BamHI片段的α-Gal A cDNA和G-CSF 3’UTS。將片段補平末端，連接BamHI接頭，并插入BamHI已消化的pCMVflpNeo(如下所述構建)。取向是將α-Gal A cDNA的5’端與CMV IE啟動子區(qū)融合。

pMVflpNeo是如下產生的。通過PCR使用CMV基因組DNA作為模板和下列寡核苷酸：5’-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3’(SEQ ID NO：10)和5’-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3’(SEQ ID NO：11)擴增CMV IE基因啟動子片段。用BamHI消化獲得的產物(1.6kb片段)，產生具有BamHI粘性末端的含CMV啟動子的片段。以1.1kb XhoI-BamHI片段從質粒pMClneopA(Stratagene公司，La Jolla，CA)分離neo表達單位。將含CMV啟動子和neo的片段插入經BamHI和XhoI消化的質粒(pUC12)。值得注意的是，pCMVflpNeo包含，從第546位核苷酸開始至第2105位核苷酸結束(Genbank序列HS5MIEP)的CMV IE啟動子區(qū)，以及由5’端緊隨CMV IE啟動子片段的單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶啟動子(Tkneo基因)驅動的新霉素抗性基因。neo基因的轉錄方向與CMV啟動子片段相同。此中間構建物稱為pXAG-4。

為了加入hGH 3’UTS，以XbaI-SmaI片段從pXAG-4切除GCSF3’UTS，并補平pXAG-4的末端。從pXGH5(Selden等人，分子和細胞生物學(Mol.Cell.Biology)6：3173－3179，1986)以0.6kb SmaI-EcoRI片段切下hGH 3’UTS。將此片段補平末端后，連接到pXAG-4中，緊隨pXAG-4中補平末端的XbaI位點之后。此中間物稱為pXAG-7。由此質粒以HindIII-ClaI片段切除TKneo片段，并用DNA聚合酶I的Klenow片段通過“填補”補平質粒末端。SV40早期啟動子驅動的新霉素抗性基因作為來自pcDNeo(Chen等人，分子和細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)7：2745－2752，1987)的ClaI-BsmBI補平片段接入質粒，neo轉錄單位的取向與α-Gal A轉錄單位相同。此中間物稱為pXAG-13。

為了完成含26個氨基酸hGH信號肽編碼序列和hGH基因第一個內含子的pXAG-16，首先切下pXAG-13的2.0kb EcoRI-BamHI片段。此片段包含α-Gal A cDNA和hGH 3’UTS。用3個片段取代此大片段。第一個片段是0.3kb的pXGH5PCR產物，從恰好位于Kozak保守序列上游的合成BamHI位點至hGH信號肽編碼序列終點，它含hGH信號肽編碼序列和hGH第一個內含子序列。此片段(片段1)是利用下列寡核苷酸：5’-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3’(寡聚物HGH101；SEQ ID NO：12)和5’-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3’(寡聚物HGH102；SEQ ID NO：13)擴增的。第二種片段是0.27kb PCR產物，所含序列對應于編碼398個氨基酸α-Gal A酶(即缺α-Gal A信號肽)的cDNA起點至NheI位點。此片段(片段2)是利用下列寡核苷酸：5’-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3’(寡聚物AG10；SEQ ID NO：14)和5’-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3’(寡聚物AG11；SEQ ID NO：15)擴增的。第三種片段即pXAG-7的NheI-EcoRI片段(片段3)，含剩余α-Gal A序列以及hGH 3’UTS。

將片段1(用BamHI和NaeI消化)、片段2(用PvuII和NheI消化)、和片段3與含neo基因和CMV IE啟動子的pXAG-13的6.5kb BamHI-EcoRI片段混和，并連接到一起產生pXAG-16(圖4)。

1.2構建α-Gal A表達質粒pXAG-28

如下分離用于α-Gal A表達構建物pXAG-28的人膠原蛋白Iα2啟動子。使用下列寡核苷酸分離含部分人膠原蛋白Iα2啟動子的人基因組DNA的408bp PCR片段：5’-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3’(寡聚物72；SEQ ID NO：16)和5’-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3’(寡聚物73；SEQ ID NO：17)。

將次片段用于篩選EMBL3中的人白細胞文庫(Clontech公司，Palo Alto，CA)。分離含3.8kb EcoRI片段的一個陽性克隆(噬菌體7H)，并克隆到pBSIISK+(Stratagene公司，La Jolla，CA)的EcoRI位點產生pBS/7H.2。用SpeI(切割pBSIISK+多接頭)消化、用DNA聚合酶I的Klenow片段“填補”、并插入寡核苷酸5’-CTAGTCCTAGGA-3’(SEQ ID NO：18)，由此向pBSIISK+中導入了AvrII位點。用BamHI和AvrII消化此pBSIISK+變體，并與上述最初的408bp膠原蛋白Iα2啟動子PCR片段的121bp BamHI-AvrII片段連接，產生pBS/121COL.6。

用XbaI(切割PBSIISK+多接頭序列)消化質粒pBS/121COL.6，用DNA聚合酶I的Klenow片段“填補”，并用AvrII消化。分離pBS/7H.2的3.8kb BamHI-AvrII片段，并用Klenow酶補平BamHI位點。然后用AvrII消化片段，并連接經AvrII消化的載體，由此產生膠原蛋白啟動子質粒pBS/121bpCOL7H.18。

然后融合膠原蛋白啟動子與含人β-肌動蛋白基因第一個內含子的人β-肌動蛋白基因。為了分離此序列，使用下列寡核苷酸：5’-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3’(寡聚物BA1；SEQ ID NO：19)和5’-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3’(寡聚物BA2；SEQ ID NO：20)從人基因組DNA分離2kb的PCR片段。

用BamHI和BsiHKAI消化此片段，釋放含β-肌動蛋白5’UTS和內含子的0.8kb片段。然后從膠原蛋白啟動子質粒pBS/121bpCOL7H.18如下分離3.6kb SalI-SrfI片段。用BamHI(BamHI位點位于膠原蛋白Iα2啟動子片段5’端)部分地消化pBS/121bpCOL7H.18，用Klenow片段補平末端，并連接SalI接頭(5’-GGTCGACC-3’)，將SalI位點放置于膠原蛋白Iα2啟動子上游。然后用SalI和SrfI(SrfI位點位于膠原蛋白Iα2啟動子CAP位點上游110bp)消化此質粒，并分離3.6kb片段。將0.8kb片段和3.6kb片段與經SalI和BamHI消化的pBSIISK-(Stratagene公司，La Jolla，CA)和退火下列四種寡核苷酸：5’-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCGTAT-3’(寡聚物COL-1；SEQ ID NO：21)，5’-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3’(寡聚物COL-2；SEQ ID NO：22)，5’-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3’(寡聚物COL-3；SEQ ID NO：23)，和5’-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3’(寡聚物COL-4；SEQ ID NO：24)組成的片段(所形成的片段含一個平末端和一個BsiHKAI末端)結合在一起。

當退火時，這四種寡核苷酸對應于由膠原蛋白啟動子SrfI位點開始并延續(xù)經過β-肌動蛋白啟動子BsiHKAI位點的區(qū)域。獲得的質粒命名為pCOL/β-肌動蛋白。

為了完成pXAG-28的構建，從pCOL/β-肌動蛋白分離了含膠原蛋白Iα2啟動子和β-肌動蛋白5’UTS的SalI-BamHI片段。將此片段連接來自pXAG-16的兩個片段(見實施例1.1和圖4)：(1)6.0kb BamHI片段(含neo基因、質粒主鏈、編碼398個氨基酸α-Gal A酶的cDNA、和hGH 3’UTS)；和(2)0.3kb BamHI-XhoI片段(含來自pcDneo的SV40polyA序列)。pXAG-28包含融合在一起的人膠原蛋白Iα2啟動子、β-肌動蛋白5’UTS、hGH信號肽(由hGH第一個內含子中斷)、編碼α-Gal A酶的cDNA、和hGH 3’UTS。完整表達構建物pXAG-28的圖譜表示在圖5。

1.3用α-Gal A表達質粒電穿孔轉染和選擇成纖維細胞

為了在成纖維細胞中表達α-Gal A，按照公開的方法(Selden等人，WO93/09222)培養(yǎng)并轉染次生成纖維細胞。

通過電穿孔將質粒pXAG-13、pXAG-16、和pXAG-28轉染到人包皮成纖維細胞中，產生轉染穩(wěn)定的無性繁殖細胞株，并如實施例1.4所述監(jiān)控得到的α-Gal A的表達水平。正常包皮成纖維細胞分泌的α-Gal A水平范圍為2－10單位/10⁶細胞/24小時。相反的，經轉染成纖維細胞展示的平均表達水平如表2所示。

表2.α-Gal A平均表達水平(±標準偏差)

這些數據顯示，所有三種表達構建物能夠使α-Gal A的表達比未轉染成纖維細胞增加許多倍。用編碼連接α-Gal A信號肽的α-Gal A的pXAG-13穩(wěn)定轉染的成纖維細胞的表達實質性地比用pXAG-16轉染的成纖維細胞低；pXAG-16的不同在于信號肽是hGH信號肽，它的編碼序列由hGH基因的第一個內含子中斷。

在每次進行傳染細胞的傳代時，都要測定分泌的α-Gal A活性，進行細胞計數，并計算細胞密度。根據收獲的細胞數目和α-Gal A的分泌時間，測定α-Gal A的特異表達速率，并將α-Gal A分泌單位/10⁶細胞/24小時表示于表3和表4?；蛑委熁蛏aα-Gal A的純化材料所需要的細胞株應當在多次傳代中展示生長和表達出穩(wěn)定。表3和表4表示了用α-Gal A表達構建物pXAG-16穩(wěn)定轉染的細胞株的數據，舉證了α-Gal A表達在多次傳代中保持穩(wěn)定的事實。

表3.含α-Gal A表達構建物pXAG-16的BRS-11細胞的生長和表達

表4.含α-Gal A表達構建物pXAG-16的HF503-242細胞的生長和表達

1.4α-Gal A表達的量化

使用水溶性底物4-羥甲香豆素-α-D-半乳糖吡喃糖苷(4-MUF-gal；Research Product公司)，根據Ioannou等人(細胞生物學雜志(J.Cell Biol.)119：1137－1150，1992)所述修改方案，測量α-Gal A活性。將底物溶于底物緩沖液(0.1M檸檬酸鹽-磷酸鹽，pH4.6)至濃度1.69mg/mL(5mM)。通常，向75mL底物溶液中加入10mL培養(yǎng)物上清液。將管蓋上并在37℃水浴中溫育60分鐘。在溫育期結束時，加入2mL甘氨酸-碳酸鹽緩沖液(130mM甘氨酸，83mM碳酸鈉，pH10.6)終止反應。使用具有固定激發(fā)波長365nm的TK0100型熒光計(Hoefer Scientific Instruments)檢測固定發(fā)射波長460nm，測量每份樣品的相對熒光。將樣品的讀數與從1mM羥甲香豆素原液(Sigma Chemical公司)制備的標準液的讀數進行比較，并計算水解底物的量。α-Gal A活性的單位表達為；1單位的α-Gal A活性相當于于37℃每小時水解1nmol底物。細胞表達數據通常表示為分泌的α-Gal A活性單位/10⁶細胞/24小時。如下文所討論的，此實驗還用于測量細胞裂解物中和各個α-Gal純化步驟的樣品中的α-Gal A活性的量。

1.5基因激活的α-Gal A(GA-GAL)的制備

使用基本上如美國專利5,733,761(引入本文中作為參考)所述的GA技術，通過在人α-Gal A編碼序列上游插入調控和結構DNA序列，產生基因激活的α-Gal A(GA-GAL)?；蚣せ钚蛄械木_插入是轉染的DNA片斷上的DNA與人細胞中α-Gal A基因座上游的基因組DNA序列之間的同源重組的結果?；蚣せ钚蛄凶陨砭哂笑?Gal A編碼序列，直至(但不包含)信號肽切割位點。分離含激活的α-Gal A基因座的細胞，并進行藥物選擇以分離GA-GAL的生成增加的細胞。

通過電穿孔將含適當基因激活序列的靶DNA片段導入宿主人細胞系。一個這樣的細胞系是HT-1080，可以從ATCC(Rockville，Maryland)獲得的經驗證細胞系。圖9顯示了含這樣的DNA片段的基因激活質粒(靶構建物)pGA213C。此質粒包含設計用于激活宿主細胞系中內源α-Gal A基因座部分的序列，還包含編碼信號肽而非人α-Gal A的序列。靶構建物還包含細菌neo和小鼠dhfr基因的表達盒。這些基因可用于通過neo基因選擇穩(wěn)定整合的靶片段，并隨后可用于氨甲蝶呤(MTX)逐步選擇dhfr基因。

另外，pGA213C包含設計用于通過同源重組靶向內源α-Gal A基因座上游染色體序列的序列。內源α-Gal A基因座與pGA213C 9.6kb DNA片段之間的同源重組表示在圖10。

通過pGA213C片段與X-染色體α-Gal A基因座之間的同源重組，構建pGA213C，刪除第-1183位至第-222位(相對于α-Gal A的甲硫氨酸起始密碼子)的962bp基因座序列。通過精確空位α-Gal A編碼區(qū)上游的外源調控序列的，進行α-Gal A基因座的轉錄激活。獲得的GA-GAL基因座引起的轉錄是從CMV啟動子起始，經過CMV外顯子1、醛縮酶內含子、和α-Gal A編碼序列的7個外顯子和6個內含子。大型前體mRNA的剪接連接了外源CMV外顯子(通過靶向插入)與完整內源α-Gal A轉錄本的第一個外顯子。GA-GAL mRNA的翻譯產生含31個氨基酸信號肽的前GA-GAL。緊隨宿主細胞的分泌，切除了信號肽。首先通過篩選GA-GAL mRNA的存在的聚合酶鏈反應鑒定了正確靶向的細胞系。還發(fā)現產生GA-GAL mRNA的克隆向培養(yǎng)基中分泌有酶活性的α-Gal A。隨后通過基因座DNA的限制性酶消化和Southern印漬雜交分析確認了靶向事件。

將細胞進行逐步氨甲蝶呤(MTX)選擇。在0.05μM MTX中選擇之后，分離一個細胞無性繁殖，并進行0.1μM MTX選擇。由此過程分離對0.1μM MTX有抗性的細胞集合，通過培養(yǎng)而擴增，并進行鑒定。

實施例2.α-Gal A純化

下文是用于生產、純化、并測試α-Gal A的優(yōu)選方法。在純化過程中，以可溶性的、有活性的、天然的形式保持α-Gal A。在純化過程中，不將蛋白質與極端pH、有機溶劑、或去污劑接觸，不進行蛋白水解切割，且不形成聚集物。設計的純化過程不改變α-Gal A糖形式的分布。

2.1α-Gal A的純化

實施例2.1例示了α-Gal A可以從培養(yǎng)已經穩(wěn)定轉染產生本酶的人細胞株條件的培養(yǎng)基純化至幾乎同質性。從含α-Gal A的培養(yǎng)基，利用一系列(五步)層析步驟分離α-Gal A。這五步利用各種分離原理，利用酶的不同物理特性將α-Gal A與污染材料分開。包括丁基上的疏水相互作用層析、羥基磷灰石上的離子相互作用層析、Q上的陰離子交換層析、和200上的大小排阻層析。大小排阻層析除了作為純化過程的最后步驟，還可作為將純化的蛋白質交換至可兼容配方的緩沖液中的有效方法。

A.使用Butyl層析作為α-Gal A純化中的第一步

通過離心使冷的條件培養(yǎng)基(1.34升)澄清，并濾過0.45μm醋酸纖維素濾器(使用玻璃纖維預過濾器)。一邊攪拌，一邊向冷的、過濾后的培養(yǎng)基中逐滴加入1N HCl，將pH調至5.6。并逐滴加入3.9M超純硫酸銨原液(室溫)至終濃度0.66M。如上所述，于4℃將培養(yǎng)基再攪拌5分鐘并進行過濾，然后加于用10mM MES-Tris(pH5.6，含0.66M硫酸銨)(緩沖液A)平衡的Butyl4Fast Flow層析柱上(柱床體積81ml，2.5x16.5cm；Pharmacia，Uppsala，Sweden)。于4℃，在裝備了分別用于評估總蛋白質和鹽濃度的串聯式UV(280nm)和電導率監(jiān)視器的Gradi-Frac^TM系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上進行層析。以10ml/min流速加樣后，用10倍柱床體積的緩沖液A清洗。用14倍柱床體積的緩沖液A至10mM MES-Tris(pH5.6，不含硫酸銨)線性梯度緩沖液從Butyl層析柱洗脫α-Gal A。通過4-MUF-gal實驗測定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明顯酶活性的收集液。如圖8和純化概述(表5)所示，這一步驟除去了大約99％的污染蛋白質(層析前樣品＝8.14g總蛋白質；層析后樣品＝0.0638g總蛋白質)。

表5.由穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞的條件培養(yǎng)基純化α-Gal A

B.使用肝素層析作為α-Gal A純化中的一步

將丁基層析峰收集液于4℃，對4升10mM MES-Tris(pH5.6，換一次)進行透析。于4℃，根據需要加入H₂O或NaCl將透析液電導率調至1.0mMHO。然后，將樣品加于用10mM MES-Tris(pH5.6，含9M NaCl)(緩沖液B)平衡的肝素6Fast Flow層析柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床體積29ml，2.5x6cm)上。于4℃，以10ml/min流速進行層析。用串聯式UV(280nm)和電導率監(jiān)視器測量了總蛋白質和鹽濃度。加樣后，用10倍柱床體積的緩沖液B、3倍柱床體積的至8％緩沖液C/92％緩沖液B(緩沖液C是10mM MES-Tris，pH5.6，含250mM NaCl)的線性梯度緩沖液、和10倍柱床體積的8％緩沖液C清洗層析柱。隨后用1.5倍柱床體積的至29％緩沖液C的線性梯度緩沖液及10倍柱床體積的至35％緩沖液C的線性梯度緩沖液洗脫α-Gal A。測定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明顯活性的收集液。

C.使用羥基磷灰石層析作為α-Gal A純化中的步驟

將肝素收集液進行過濾，并直接加于用1mM磷酸鈉(pH6.0)(緩沖液D)平衡的陶瓷羥基磷灰石HC層析柱(40μm；美國國際化學公司，Natick，MA；柱床體積12ml，1.5x6.8cm)上。于室溫，在裝備了串聯式UV(280nm)和電導率監(jiān)視器的雜化物Gradi-Frac^TM系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上進行層析。以5ml/min流速加樣后，用10倍柱床體積的緩沖液D清洗層析柱。用7倍柱床體積的至42％緩沖液E/58％緩沖液D的緩沖液線性梯度及10倍柱床體積的至52％緩沖液E的梯度緩沖液洗脫α-Gal A(緩沖液E是250mM磷酸鈉，pH6.0)。測定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明顯活性的收集液。

D.使用Q陰離子交換層析作為α-Gal A純化中的步驟

于室溫，將羥基磷灰石收集液用H2O稀釋大約1.5倍至終電導率為3.4－3.6mMHO。過濾后，將樣品加于用10％緩沖液G/90％緩沖液F平衡的QHP層析柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床體積5.1ml，1.5x2.9cm)。緩沖液F是25M磷酸鈉(pH6.0)；緩沖液G是25mM磷酸鈉(pH6.0)和250mM NaCl。于室溫，在Gradi-Frac^TM/雜化物系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上進行層析，并通過串聯式計數器監(jiān)控總蛋白質和鹽濃度。以5ml/min流速加樣，然后進行下列步驟：(1)用5倍柱床體積的10％緩沖液G清洗，(2)用7倍柱床體積的12％緩沖液G清洗，(3)用3倍柱床體積的至50％緩沖液G的線性梯度緩沖液洗脫，(4)用10倍柱床體積的至53％緩沖液G的線性梯度緩沖液洗脫，(5)用3倍柱床體積的至100％緩沖液G的梯度緩沖液洗脫，和(6)用10倍柱床體積的100％緩沖液G清洗。α-Gal A主要在第3步和第4步洗脫。合并含有明顯活性的收集液(“Q集合”)。

E.使用-200凝膠過濾層析作為α-Gal A純化中的步驟

使用-10離心濃縮器單位(Amicon，Beverly，MA)將Q集合濃縮約5倍，并加于用25mM磷酸鈉(pH6.0，含150mM NaCl)平衡并洗脫的200層析柱上(Pharmacia，Uppsala，Sweden；柱床體積189ml，1.6x94cm)。在系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上于室溫進行層析，用串聯式UV監(jiān)視器(280nm)追蹤蛋白質的洗脫。加于層析柱的加樣體積≤2ml，流速0.5ml/min，收集液大小2ml。進行多次層析；測定收集液的α-Gal A活性，并合并含有明顯活性的收集液。

使用-10單位濃縮來自-200層析柱的合并收集液，分裝，快速冷凍，并短期保存于-80℃。表5表示了對此α-Gal A純化實施例的概述。α-Gal A的終產量是59％的起始材料活性，純化產物的比活性是2.92x10⁶單位/mg蛋白質。在還原條件下在4－15％SDS-PAGE上電泳及銀染之后，獲得的產物表現出高水平的純度。

小結

純化過程提供了高度純化的α-Gal A。純化主要發(fā)生于此過程的前2步，而后3步是通過除去剩余的少量污染來提純材料。最后一步，200上的大小排阻層析，同時將α-Gal A交換至與可兼容配方的緩沖液中。

2.2培養(yǎng)中的已穩(wěn)定轉染的人細胞產生的α-Gal A的大小

研究了純化的α-Gal A的結構和功能特性。在還原條件下在4－15％SDS-PAGE上電泳及銀染之后，獲得的產物表現出高水平的純度。

通過MALDI-TOF質譜法估計α-Gal A的分子量。這些結果證明二聚體的分子量是102,353Da，而單體的分子量是51,002Da。根據氨基酸組成，單體的期望分子量是45,400Da。因此，酶中碳水化合物含量達到5,600Da的分子重量。

2.3由穩(wěn)定轉染人細胞產生的α-Gal A的碳水化合物修飾

同時評價了按照本發(fā)明生產的α-Gal A的糖基化模式。正確糖基化對于優(yōu)化α-Gal A的體內活性是重要的；在非糖基化系統(tǒng)中表達的α-Gal A無活性或不穩(wěn)定。Hantzopolous等人，基因(Gene)57：159，(1987)。糖基化對于α-Gal A內在化至期望的靶細胞中也是重要的，糖基化同時還影響酶的體內循環(huán)半衰期。在α-Gal A的每個亞基上有4個位點可添加天冬酰胺連接的碳水化合物鏈，其中只占據了3個位點(Desnick等人，在《遺傳性疾病的代謝和分子基礎》(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease)中，McGraw Hill，紐約，1995，第2741－2780頁。

用從A.urafaciens(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)分離的神經氨酸苷酶處理穩(wěn)定轉染細胞產生的α-Gal A樣品可以除去唾液酸。將5mgα-Gal A與10mU神經氨酸苷酶在總體積10mL的醋酸緩沖鹽(ABS，20mM醋酸鈉(pH5.2)和150mM NaCl)中于室溫反應過夜。

在ABS(用Tris將pH調升至7.5)中用15U堿性磷酸酶(小牛腸堿性磷酸酶，Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)處理5mgα-Gal A于室溫過夜，將由穩(wěn)定轉染細胞產生的純化α-Gal A去磷酸化。

通過SDS-PAGE和/或等電聚焦及使用抗α-Gal A特異抗體的Western印漬分析樣品。所用抗體是利用代表α-Gal A第68－81位氨基酸的肽作為免疫原產生的兔多克隆抗肽抗體。將蛋白質轉移至PVDF(Millipore，Bedford，MA)后，用在2.5％blotto(溶于20mM Tris-HCl(pH7.5)，0.05％吐溫20中的脫脂奶粉)中稀釋1:2000的抗血清對膜進行探查。隨后用與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG(Organo Technique/Cappella，Durham，NC；1:5000稀釋)和ECL化學發(fā)光試劑盒(Amersham，Arlington Heights，IN)的試劑進行檢測。

用神經氨酸苷酶處理α-Gal A，隨后進行SDS-PAGE分析，顯示了分子量漂移(大約1500－2000Da或4－6個唾液酸/單體)，表明α-Gal A存在廣泛的唾液酸修飾。作為參考，α-Gal A的血漿形式具有5－6個唾液酸殘基/單體，而胎盤形式具有0.5－1.0個唾液酸殘基/單體。Bishop等人，生物化學雜志(J.Biol.Chem.)256：1307，(1981)。

用于檢驗α-Gal A的唾液酸和M6P修飾的另一種方法是等電聚焦(IEF)，即根據等電點(pI)或凈電荷分離樣品。由此，可以期望從α-Gal A中除去帶電荷的殘基(諸如唾液酸或磷酸)來改變蛋白質在IEF系統(tǒng)中的遷移率。

為了進行IEF實驗，用神經氨酸苷酶和/或堿性磷酸酶處理按照本發(fā)明生產的α-Gal A樣品，與2x Novex加樣緩沖液(含8M尿素，pH3.0－7.0)1∶1混和，加載于用(Pharmacia，Uppsala，Sweden；pH3.0－6.5；4－6.5和2.5－5.5，0.25mL/凝膠)制作的6M尿素IEF凝膠(5.5％聚丙烯酰胺)。還加載了等電點標準(Bio-Rad)。電泳后，如上所述，將凝膠轉移至PVDF，并進行Western印漬分析。

用神經氨酸苷酶處理酶增加了所有這3種同工型的pI，表明所有同工型都被唾液酸修飾至一定程度了。這些數據說明如本發(fā)明所述生產的α-Gal A制劑將具有需要的血漿半衰期，表明該物質能很好地適用于制藥學上的用途。此外，用堿性磷酸酶處理經神經氨酸苷酶處理的α-Gal A將一部分蛋白質的pI進一步增加至大約5.0－5.1，表明酶攜帶一個或多個M6P殘基。這種修飾是靶細胞將α-Gal A有效內在化所需要的。

α-Gal A的N-連接碳水化合物鏈是通過離子交換HPLC(Glyco-Sep C)并用熒光化合物2-氨基苯甲酰胺(AB)標記非還原性末端來分析的。表6概述了來自3種獨立的α-Gal A制劑的AB-聚糖的分析結果。所有3種制劑的Z數目都大于170。此外，超過67％的聚糖發(fā)生了唾液酸化，超過16％的聚糖發(fā)生了磷酸化，而不足16％的聚糖是中性的。與以前報導的結果相比，這些結果非常有利。例如，據Desnick等人(美國專利5,356,804)報導，超過60％的聚糖是中性的，只有11％的聚糖發(fā)生了唾液酸化。

表6.來自GA-GAL的AB-聚糖的分析結果

表7提供了更詳細的純化GA-GAL制劑的鑒定。

表7.GA-GAL的純化批量

2.4通過分離α-Gal A種類來增加帶電荷的α-Gal A的比率

如上所述，可以在此處所述純化過程中的多個步驟進行α-Gal A糖形式的分級分離。在此實施例中，根據大小和電荷分級分離α-Gal A糖形式。還可能通過上述這些或其它層析技術的組合來分部分離α-Gal A。

對于α-Gal A糖形式的大小分部分離，可以在用磷酸鹽緩沖液(pH6)平衡的200層析柱(Pharmacia，1.6x94.1cm)上進行大小排阻層析。將α-Gal A(1mL中含2.6mg)加于層析柱上，并以0.35mL/min洗脫。收集洗脫過程中的洗脫液，并通過SDS-PAGE分析包含寬廣的α-Gal A洗脫峰的收集液，然后通過銀染可視化。位于峰前沿的收集液含有最大分子量的α-Gal A，隨著收集液經過峰，α-Gal A的表觀分子量逐漸下降。然后選擇和合并α-Gal A收集液，以提供期望分子量范圍的α-Gal A制劑。

在根據電荷分部分離α-Gal A的糖形式中，通過Q-層析分離α-Gal A。Q-層析柱(1.5x9.4cm)用含30mM NaCl的20mM磷酸鈉(pH6.0)平衡，并將流速維持在5mL/min。將α-Gal A(166mL中含130mg)加于層析柱上，用平衡緩沖液清洗，然后用含130mM NaCl的20mM磷酸鈉(pH6.0)洗脫。對于更廣泛的分離，可以使用平衡緩沖液－洗脫緩沖液的梯度緩沖液洗脫(如10倍柱床體積)。收集洗脫過程中的洗脫液，并通過SDS-PAGE分析包含α-Gal A洗脫峰的收集液，然后通過銀染觀察。在凝膠上觀察到的最小分子量種類在清洗中和峰前沿處洗脫，最大分子量的糖形式的洗脫直至峰的結束。較小分子量的種類對應于帶較少負電荷的α-Gal A糖形式，與帶正電荷的Q-層析柱(包含季胺取代樹脂)的結合也較不緊密。帶最多負電荷的α-Gal A種類在洗脫過程的晚期洗脫，且根據SDS-PAGE分析，具有較大的分子量。通過洗脫收集液備選擇的合并液的等電聚焦確認根據電荷進行的分部分離。

由此，根據大小的分離和根據電荷的分離都能夠用于選擇高度帶電的α-Gal A糖形式。

2.5甘露糖或甘露糖-6-磷酸(M6P)介導的α-GalA的內在化

為了將穩(wěn)定轉染細胞產生的α-Gal A作為α-Gal A缺陷的有效治療劑，本酶必須由受影響的細胞內在化。α-Gal A在生理學pH水平具有極低活性，例如在血液或組織液中。只有在溶酶體的酸性環(huán)境中內在化時，α-Gal A才最佳地代謝積累的脂類底物。這種內在化是α-Gal A與M6P受體的結合介導的，M6P受體在細胞表面表達并將酶經內吞途徑遞送至溶酶體。M6P受體是普遍表達的；大多數體細胞能表達M6P至一定程度。對糖蛋白上暴露的甘露糖殘基特異的甘露糖受體較不普遍。甘露糖受體通常只發(fā)現于巨噬細胞和類巨噬細胞上，并提供了α-Gal A進入這些類型的細胞的額外方法。

為了證明M6P介導的α-Gal A內在化，將來自Fabry病患者的皮膚成纖維細胞(NIGMS人類基因突變型細胞儲存庫)(NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository)在本發(fā)明的純化α-Gal A濃度增加的條件下培養(yǎng)過夜。一些樣品含有5mM可溶性M6P，它們競爭性抑制與M6P受體的結合和經M6P受體的內在化。其它樣品含有30mg/mL甘露糖，它們抑制與甘露糖受體的結合和經甘露糖受體的內在化。溫育后，刮到裂解緩沖液(10mM Tris(pH7.2)，100mM NaCl，5mM EDTA，2mM Pdfabloc^TM(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)，和1％NP-40)中，清洗并收獲細胞。然后測定裂解樣品的蛋白質濃度和α-Gal A活性。結果以α-Gal A活性單位/mg細胞蛋白質表示。Fabry細胞以依賴劑量的方式內在化α-Gal A。這一內在化受M6P的抑制，但是不受甘露糖的抑制。因此，Fabry成纖維細胞內在化α-Gal A受M6P受體而非甘露糖受體介導。

α-Gal A還受內皮細胞的體外內在化，內皮細胞是治療Fabry病的重要靶細胞。將人臍帶靜脈內皮細胞(HUVECs)與7500Uα-Gal A一起培養(yǎng)過夜；一些孔含有M6P。溫育后，收獲細胞并如上所述測定α-Gal A。與α-Gal A一起溫育的細胞的酶水平幾乎是對照(未與α-Gal A一起溫育)細胞的10倍。M6P抑制α-Gal A的細胞內積累，說明HUVEC內在化α-Gal A是由M6P受體介導。由此，本發(fā)明的人α-Gal A是由臨床相關細胞內在化的。

已知少數培養(yǎng)人細胞系表達甘露糖受體。然而，攜帶甘露糖受體但是少許M6P受體(如果有)的小鼠類巨噬細胞細胞系(J774.E)，可用于確定本發(fā)明的純化α-Gal A是否經甘露糖受體內在化。Diment等人，白細胞生物學雜志(J.Leukocyte Biol.)42：485－490，(1987)。將J774.E細胞在存在10,000U/mLα-Gal A的條件下培養(yǎng)過夜。選擇的樣品還含有2mM M6P，而其它樣品含有100mg/mL甘露糖。如上所述清洗并收獲細胞，測定每份樣品的總蛋白質和α-Gal A活性。M6P不抑制這些細胞攝取α-Gal A，而甘露糖將α-Gal A積累水平降低了75％。由此，在表達此特定細胞表面受體的細胞類型中，本發(fā)明α-Gal A可以由甘露糖受體內在化。

實施例3.制藥學配方

緩沖液和配方的制備

將α-Gal A的純化批量用α-Gal A稀釋劑稀釋至終濃度。根據待配制的純化批量的體積、α-Gal A濃度(mg/mL)、和α-Gal A在最終配方中的期望濃度，確定需要的α-GalA稀釋液的體積。在使用前24小時內，通過混和適當量的WFI、NaCl、和磷酸鈉單基，并用NaOH溶液將pH調至6.0，由此配制α-Gal A稀釋液。α-Gal A稀釋液的組成列于表8。

表8.α-Gal A稀釋液的組成(每升)

將1升或更小體積的α-Gal A稀釋液用無菌的0.2mm尼龍膜(Nalge Nunc International公司，Rochester，NY)真空過濾。更大的體積可使用蠕動泵和0.2mm囊濾器(Pall，Port Washington，NY)正壓過濾。將所有濾出液進行過濾后氣泡點完整性測試。在經檢驗的100等級層流櫥中進行混和和過濾。在混和容器中向α-Gal A的純化批量中加入α-Gal A稀釋劑，得到1mg/ml的終溶液。然后，加入適當體積的聚山梨酯20(吐溫20，Spectrum)至終濃度0.02％。

實施例4.脫唾液酸、脫半乳糖的α-Gal A

為了研究糖基化對α-Gal A的生物學分布的影響，將α-Gal A的純化制劑連續(xù)糖基化，并將每種形式注射到小鼠中。注射后4小時采集小鼠器官，并對組織進行免疫組織化學分析，觀察本蛋白質生物學分布中的可能變化。

首先用神經氨酸苷酶(唾液酸酶)處理α-Gal A以除去唾液酸殘基，使半乳糖部分暴露。將經唾液酸酶處理的α-Gal A的一部分進一步與β-半乳糖苷酶反應以除去半乳糖殘基，使N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAC)殘基暴露。然后用N-乙酰氨基葡糖苷酶除去GlcNAC，在蛋白質上剩下核心甘露糖基團。經尾靜脈將未處理的α-Gal A(對照)或本蛋白質的處理形式之一注射到小鼠中。注射后4小時，從小鼠采集肝、脾、心、腎、和肺，保存，并免疫染色以檢測α-Gal A。

當與接受未處理蛋白質的對照動物進行比較時，接受經唾液酸酶處理的酶(半乳糖殘基暴露)的小鼠在肝中具有更多的α-Gal A，而其它檢驗器官中的酶相應的較少。另外，肝中的染色模式是相當不同的。在對照動物中，α-Gal A主要位于Kupffer細胞(肝巨噬細胞)和內皮細胞，而肝細胞只有中等染色。在接受經唾液酸酶處理的α-Gal A的動物中，酶只位于肝細胞，這與已知的唾液酸糖蛋白受體知分布是一致的。當用β-半乳糖苷酶除去半乳糖殘基后，脫糖基化對生物學分布的影響發(fā)生逆轉。在接受不含半乳糖部分的這種蛋白質的小鼠的肝中觀察到的染色模式與對照動物相似；染色主要位于Kupffer細胞和內皮細胞，而肝細胞具有少量染色。用N-乙酰氨基葡糖苷酶進一步處理α-Gal A不改變經β-半乳糖苷酶處理的蛋白質觀察到的染色模式；即除去N-乙酰氨基葡萄糖殘基似乎對α-Gal A的生物學分布的影響較少。

實施例5用表達α-Gal A的人成纖維細胞矯正Fabry成纖維細胞

為了進行基因治療，產生α-Gal A的自身細胞植入物必須產生修飾成適用于“矯正”靶細胞中的α-Gal A缺陷的形式的酶。為了評價由經轉染人成纖維細胞產生的α-Gal A對Fabry細胞的影響，將從Fabry病患者采集的成纖維細胞(NIGMS人類基因突變型細胞儲存庫)(NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository)與α-Gal A生產細胞株(BRS-11)在(Costar，Cambridge，MA)中共培養(yǎng)。將Fabry細胞在12孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)，有些孔含有表面可以生長細胞的插入物(0.4mm孔徑)。插入物的生長基質是多孔的，高分子能夠由上層環(huán)境穿至下層環(huán)境。一組插入物包含正常人包皮成纖維細胞(HF)，分泌極低水平α-Gal A；而另一組插入物包含穩(wěn)定轉染的人成纖維細胞株BRS-11，分泌大量的α-Gal A。在與α-Gal A生產細胞共培養(yǎng)的孔中，α-Gal A能夠進入培育Fabry細胞的培養(yǎng)基，而且可以潛在地可以由Fabry細胞內在化。

表9中的數據表明Fabry細胞內在化分泌型α-Gal A。對α-Gal A的細胞內水平監(jiān)控3天。那些單獨(沒有插入物)培養(yǎng)或在存在未轉染包皮成纖維細胞(HF插入物)的情況下培養(yǎng)的細胞具有很低的細胞內α-Gal A活性水平。然而，在第2天結束時，與α-Gal A生產細胞(BRS-11插入物)一起培養(yǎng)的Fabry細胞展示的酶水平與正常細胞相似(正常成纖維細胞具有25－80單位α-Gal A/mg蛋白質)。通過M6P抑制(BRS-11插入物+M6P)證明了矯正可歸功于通過M6P受體攝取的α-GalA。

表9.用表達α-Gal A活性(單位/mg總蛋白質)的人成纖維細胞矯正Fabry成纖維細胞

本發(fā)明涉及以下實施方式：

1.含人α-Gal A制劑的組合物，如SDS-PAGE或反相HPLC測量，純化至至少99.5％同質性，其中所述制劑包含多種α-Gal A糖形式且具有至少3.0x10⁶單位/mg蛋白質的比活性，而且其中所述制劑基本上不含植物凝血素。

2.實施方式1的組合物，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖至少35％帶電荷。

3.實施方式1的組合物，如Z數目測量的，其中所述α-Gal A糖形式的寡糖電荷超過150。

4.實施方式1的組合物，其中所述α-Gal A糖形式的總聚糖至少60％唾液酸化。

5.實施方式4的組合物，其中所述制劑的循環(huán)半衰期延長。

6.用于生產含多種α-Gal A糖形式的純化α-Gal A制劑的方法，所述方法包括下列步驟：

a)在平衡緩沖液中于酸性pH使所述α-Gal A糖形式結合陽離子交換樹脂，

b)用所述平衡緩沖液清洗所述樹脂以洗脫未結合的物質，并

c)使用選自下組的洗脫溶液洗脫所述α-Gal A糖形式：10－100mM的鹽溶液、pH4－5的緩沖液、及其組合，

其中所述α-Gal A制劑純化至至少99.5％同質性，且其中所述制劑基本上不含植物凝血素。

7.實施方式6的方法，還包括選自下組的純化步驟：層析聚焦層析法、金屬螯合物親和層析法、和免疫親和層析法。

8.含多種α-Gal A糖形式的α-Gal A制劑，純化至至少99.5％同質性，由實施方式6的方法生產。

9.用于生產寡糖電荷增加的糖基化α-Gal A制劑的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將編碼GlcNac轉移酶III(GnT-III)的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞，或者通過同源重組導入調控序列以調控內源GnT-III基因的表達；

b)在能夠表達α-Gal A和GnT-III的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述α-Gal A生產細胞；并

c)分離α-Gal A，其中所述α-Gal A制劑的寡糖電荷比不含所述多核苷酸的細胞產生的α-Gal A多。

10.實施方式9的方法，其中所述α-Gal A制劑的寡糖至少35％帶電荷。

11.實施方式9的方法，其中所述α-Gal A制劑包含多種糖形式，所述糖形式的復合聚糖至少20％含2－4個唾液酸殘基。

12.實施方式9的方法，如Z數目測量的，其中所述α-Gal A制劑的寡糖電荷超過150。

13.實施方式9的方法，其中所述制劑包含多種糖形式，所述糖形式平均至少25－50％磷酸化。

14.寡糖電荷增加、由實施方式9－13任一項的方法生產的糖基化α-Gal A制劑。

15.用于生產寡糖電荷增加的糖基化α-Gal A制劑的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將編碼唾液?；D移酶的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞，或者通過同源重組導入調控序列以調控內源唾液?；D移酶的表達；

b)在能夠表達α-Gal A和唾液酰基轉移酶的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述α-Gal A生產細胞；并

c)分離α-Gal A，其中所述α-Gal A制劑的寡糖電荷比不含所述多核苷酸的細胞產生的α-Gal A多。

16.實施方式15的方法，還包括下列步驟：

d)通過分離或純化步驟(c)的制劑來選擇大小或電荷增加的α-Gal A糖形式。

17.寡糖電荷增加、由實施方式15或16的方法生產的糖基化α-Gal A制劑。

18.用于生產唾液酸化增加的糖基化α-Gal A制劑的方法，所述方法包括使α-Gal A生產細胞接觸銨濃度低于10mM的培養(yǎng)基的步驟。

19.實施方式18的方法，其中接觸步驟包括用新鮮培養(yǎng)基連續(xù)或間歇灌注所述α-Gal A生產細胞以維持銨濃度低于10mM。

20.用于生產磷酸化增加的糖基化α-Gal A制劑的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將表達后編碼磷酸轉移酶的多核苷酸導入α-Gal A生產細胞，或者通過同源重組導入調控序列以調控內源磷酸轉移酶的表達；

b)在導致α-Gal A和磷酸轉移酶表達的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述α-Gal A生產細胞；并

c)分離α-Gal A，其中所述α-Gal A制劑的磷酸化比不含所述多核苷酸的細胞產生的α-Gal A多。

21.磷酸化增加、由實施方式20的方法生產的糖基化α-Gal A制劑。

22.生產寡糖鏈上唾液酸和末端半乳糖殘基數目減少的糖基化α-Gal A的方法，所述方法包括下列步驟：

a)將α-Gal A接觸神經氨酸苷酶(唾液酸酶)以除去唾液酸殘基，并使末端半乳糖部分暴露；并

b)將步驟(a)的脫唾液酸α-Gal A接觸β-半乳糖苷酶以除去末端半乳糖殘基，

其中步驟(b)的脫唾液酸，脫半乳糖α-Gal A產物寡糖鏈上的末端唾液酸或半乳糖殘基數目比來自未接觸α-Gal A的α-Gal A減少。

23.用于生產寡糖鏈上末端半乳糖殘基數目減少的糖基化α-Gal A的方法，所述方法包括將α-Gal A接觸β-半乳糖苷酶以除去末端半乳糖殘基的步驟，其中產物寡糖鏈上的末端半乳糖殘基數目比未接觸α-Gal A的α-Gal A減少。

24.由實施方式23的方法生產的脫半乳糖α-Gal A制劑。

25.α-Gal A制劑在制藥中的用途，藥劑用于一周一次或兩周一次每kg受治療者體重施用0.05－5.0mg劑量的所述α-Gal A制劑。

26.實施方式25的用途，其中所述藥劑用于一周一次或兩周一次每kg受治療者體重施用大約0.2mg劑量的所述α-Gal A制劑。

27.實施方式25或26的用途，其中所述劑量配制用于肌肉內、口、直腸、皮下、動脈內、腹膜內、大腦內、鼻內、鞘內、穿粘膜、穿真皮、或經吸入施用。

28.α-Gal A制劑在制藥中的用途，藥劑用于一周一次或兩周一次皮下每kg受治療者體重施用0.01－10mg劑量的所述α-Gal A制劑。

29.實施方式27或28的用途，其中所述劑量配制用于使用選自下組的投遞系統(tǒng)的施用：泵投遞、包囊細胞投遞、脂質體投遞、針頭投遞注射、無針頭注射、噴霧器、氣霧器、電穿孔、和透皮貼。

30.α-Gal A制劑在制藥中的用途，藥劑用于治療Fabry病，其中所述藥劑用于一周一次或兩周一次每kg受治療者體重施用0.01－10mg劑量的所述α-Gal A制劑。

31.實施方式30的用途，其中所述藥劑配制用于皮下施用。

32.α-Gal A制劑在制藥中的用途，藥劑用于治療非典型性變異型Fabry病，其中所述藥劑用于一周一次或兩周一次每kg受治療者體重施用0.05－5.0mg劑量的所述α-Gal A制劑。

33.實施方式32的用途，其中所述患者患有心血管異常。

34.實施方式33的用途，其中所述心血管異常是左心室肥大(LVH)。

上述描述只用于例示目的，而非將本發(fā)明限制成公開的精確形式，但是后面所附權利要求作了限制。在說明書和所附權利要求書中，除非文章中清楚指明，單數形式包括復數參考。此說明書中引用的所有專利和發(fā)表物引入作為參考。