本發(fā)明涉及生物制劑領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明提供一種新的含有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的生物制劑的制備方法以及通過(guò)該方法獲得的生物制劑。本發(fā)明還提供上述生物制劑在治療乙型肝炎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胎盤(placenta)是哺乳動(dòng)物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間交換物質(zhì)的過(guò)渡性器官。胎盤由羊膜(amnioticmembrane)、葉狀絨毛膜(chorionfrondosum)和底蛻膜構(gòu)成。胎兒在子宮中發(fā)育，依靠胎盤從母體取得營(yíng)養(yǎng)，而雙方保持相當(dāng)?shù)莫?dú)立性。在活體內(nèi)，胎盤還產(chǎn)生多種維持妊娠的激素，是一個(gè)重要的內(nèi)分泌器官。

妊娠分娩之后，胎盤為臨床醫(yī)學(xué)的廢棄物。但中醫(yī)將其歸入中藥的范疇，名為“紫河車”，其性溫、味甘咸，入肺、肝、腎三經(jīng)，有養(yǎng)血益精的功效。民間常用其煮爛食之，治療虛損、羸瘦、咳喘、盜汗、遺精、陽(yáng)痿等多種病癥。

人胎盤的成分較復(fù)雜，還含有干擾素(interferon)，有抑制多種病毒對(duì)人細(xì)胞的作用，含有的巨球蛋白稱為β抑制因子(β-inhibitor)，能抑制流感病毒。胎盤中含有與血液凝固有關(guān)的成分，有類似凝血因子?的纖維蛋白穩(wěn)定因子；尿激酶抑制和纖維蛋白溶酶原活化物。人胎盤中還含有許多激素：促性腺激素(gonadotropin)a和b，催乳素(lactogen)，促甲狀腺激素(thyrotropin)，催產(chǎn)素樣物質(zhì)，多種甾體激素和雌酮(estrone)，雌二醇(estradiol)，雌三醇(estriol)，孕甾酮(progesterone)，睪丸甾酮(testosterone)，去氧皮質(zhì)甾酮(deoxycorticosterone)，11-去氫皮質(zhì)甾酮(11-dehydrocorticosterone)(化合物a)，可的松(cortisone)(化合物b)，17-羥皮質(zhì)甾酮(17-hydroxycorticosterone)(化合物f)，四氫皮質(zhì)甾酮(tetrahydrocorticosterone)，4-孕烯-20，21-二醇-3，11-二酮(4-pregnen-20,21-diol-3,11-dione)，絨毛膜促腺激素(chorionicgonadotropin)等及促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropichormone)等。人胎盤中還含有多種有應(yīng)用價(jià)值的酶，如溶菌酶(lysozyme)，激肽酶(kininase)，組胺酶(histaminase)，催產(chǎn)素酶(oxytocinase)，清蛋白酶，α-球蛋白酶，β-球蛋白酶，γ-球蛋白酶等。此外，尚含有紅胞生成素，磷脂(phospholipid)，β-內(nèi)啡肽(β-endorphin)，氨基多糖體(系由8分子乙酰氨葡萄糖、6分子甘露糖所組成)。胎盤乳原(多肽化合物)含多種氨基酸，并含微量維生素b12，乙酰膽堿及碘等。

胎盤免疫調(diào)節(jié)肽是一種可透析、可超濾的多肽,含有16種氨基酸，分子量為6000以下的小分子物質(zhì),療效與轉(zhuǎn)移因子相似。安全、無(wú)毒副作用并對(duì)balb/c小鼠具有促進(jìn)生長(zhǎng)、發(fā)育的功能；可使95.2％的pha皮試陰性者轉(zhuǎn)陽(yáng)；使因溫育37℃而降低的玫瑰花結(jié)形成率恢復(fù)至活性花結(jié)水平,經(jīng)164例臨床應(yīng)用研究證明,本品可不同程度地提高患者的細(xì)胞免疫功能,是一種比較滿意的免疫調(diào)節(jié)劑。(彭立義等：胎盤免疫調(diào)節(jié)肽的鑒定與臨床應(yīng)用。濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院免疫科；濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院免疫科；新藥與臨床：1990年03期)。

于2013年，韓國(guó)yonsei大學(xué)利用正常人和先兆性子癇病人的胎盤組織作為研究對(duì)象，用蛋白組學(xué)的分析方法，對(duì)人胎盤組織中蛋白質(zhì)和多肽做了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人胎盤組織中含有4239種特異性蛋白質(zhì)，219種n-末端鏈接的多糖肽(n-linkedglycopeptides)，592種特異性的磷酸蛋白肽(phosphopeptides)，66種13染色體特異性蛋白質(zhì)。28種為先兆性子癇特異性蛋白(preeclampsia-specificproteins)。(leehjetal:comprehensivegenome-wideproteomicanalysisofhumanplacentaltissueforthechromosome-centrichumanproteomeproject.jproteomeres.2013feb14.)。但這些特異性蛋白質(zhì)和多肽的生物學(xué)效用還有待進(jìn)步研究。

濟(jì)南軍區(qū)肝病研究所張光曙教授所領(lǐng)導(dǎo)和主持的研究小組，通過(guò)三十年的臨床研究發(fā)現(xiàn)利用乙肝病毒表面抗原抗體陽(yáng)性的人胎盤作為轉(zhuǎn)移因子和核糖核酸制備的材料，制備分子量在8000以下的胎盤轉(zhuǎn)移因子，在全國(guó)共21個(gè)研究單位，觀察1560病例，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)移因子來(lái)治療慢性乙型肝炎，以及與乙肝病毒感染相關(guān)的肝硬化和肝癌獲得相當(dāng)好的臨床療效。同時(shí)，用于丙型肝炎(115例)也有治療效果，對(duì)癌癥病人免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)作用十分明顯。

cn1049119c公開了一種抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液的制備方法，該方法工藝復(fù)雜，在制備過(guò)程中需要添加36％的甲醛作為滅活劑，存在顯著的毒副作用。

cn1299763c公開了一種抗乙肝人體胎盤轉(zhuǎn)移因子粉針劑的制備方法，該方法在制備時(shí)需要2-5次凍融(耗時(shí)24-50h)，制備時(shí)間長(zhǎng)，并且在胎盤轉(zhuǎn)移因子離心后的上清液需要用naoh調(diào)ph，造成制備工藝穩(wěn)定性和可重復(fù)性差。

cn1554363a公開了一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物及其制備工藝，該工藝對(duì)胎盤的初加工和勻漿有效成分的浸提都是在常溫下進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是在現(xiàn)有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子制備方法的基礎(chǔ)上對(duì)上述原有生產(chǎn)工藝加以改進(jìn)和完善。

本發(fā)明是基于以下出人意料的發(fā)現(xiàn)：胎盤離體后于0～4℃除去空氣分別冷凍保存；制備時(shí)不再需要2-5次凍融(耗時(shí)24-50h)，顯著縮短了生產(chǎn)時(shí)間；且在4-10℃條件下進(jìn)行均質(zhì)、離心操作，用0.1mol/l的氯化鈉溶液浸提胎盤勻漿1h，低溫條件的應(yīng)用，使成品中多肽的含量較現(xiàn)有方法(如cn1299763c)提高了逾20％；此外，胎盤轉(zhuǎn)移因子離心后的上清液不再需要用naoh調(diào)ph，保證抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的制備的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

另外，本發(fā)明涉及利用蛋白組學(xué)的方法對(duì)乙肝轉(zhuǎn)移因子中有效多肽的分析和發(fā)現(xiàn)，對(duì)乙肝轉(zhuǎn)移因子中的多肽進(jìn)行氨基酸序列分析。發(fā)現(xiàn)對(duì)病人體內(nèi)非特異性和特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用，可用于治療或輔助治療肝炎、癌癥疾病、或其他相關(guān)的疾病。

因此，本發(fā)明涉及以下各項(xiàng)：

1.一種含有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的生物制劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)將新鮮胎盤直接放入無(wú)菌0～4℃的保溫容器中，之后將胎盤裝入真空包裝內(nèi)并在低溫(-20℃)的條件下保存；

2)將以上保存的胎盤20～30℃解凍，加入0.1％氯化鈉水溶液并均質(zhì)以獲得勻漿；

3)將以上獲得的勻漿于0～10℃恒溫條件下進(jìn)行有效成分浸提0.5-5小時(shí)，再將勻漿升溫至55℃～65℃，連續(xù)均勻水浴5～15小時(shí)，完成病毒滅活，然后將勻漿冷卻至10℃以下；

4)將以上獲得的勻漿在溫度為4℃～10℃、轉(zhuǎn)速為3000～12000r/min的條件下離心30～100分鐘，獲得上清液；和

5)將以上獲得的上清液進(jìn)行超濾處理，獲得所述含有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的生物制劑。

2.根據(jù)以上1所述的制備方法，所述方法在步驟5)之后還包括以下步驟：

6)將獲得的提取物用生理鹽水或注射用水調(diào)配，然后經(jīng)過(guò)0.22μm孔徑的濾芯/濾膜除菌，獲得注射液半成品，和任選地：

7)將以上獲得的注射液半成品配制成注射液或制成凍干粉針劑。

3.根據(jù)以上1或2所述的制備方法，其中：

1)所述胎盤是人胎盤，優(yōu)選乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽(yáng)性，乙型肝炎病毒(hbsag、hbeag、hbeab、hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體(梅毒、淋病等)均為陰性的人胎盤；和/或

2)步驟1)還包括去除胎盤附屬結(jié)構(gòu)(臍帶和羊膜)，將所得胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干，切成小塊；和/或

3)在步驟2)中在解凍后加入含有0.1mol/l(約0.6％)的氯化鈉的注射用水，胎盤：鹽水(重量比)＝1：2～4；和/或

4)在步驟4)中獲得的上清液的ph為6.6～7.4，并且不用naoh調(diào)節(jié)ph；和/或

5)在步驟5)中的超濾處理是如下進(jìn)行：將上清液經(jīng)截留分子量為80～200kd的中空超濾纖維柱超濾，所得濾液再用截留分子量為5～20kd(優(yōu)選10kd)的中空超濾纖維柱超濾，收集濾液。

4.一種含有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的生物制劑，其可通過(guò)根據(jù)以上1～3中任一項(xiàng)所述的制備方法制備。

5.根據(jù)以上4中任一項(xiàng)的生物制劑，其中所述抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的分子量小于10kd。

6.根據(jù)以上4-5中任一項(xiàng)的生物制劑，其為溶液形式，并且溶液中ph為6.6～7.4，多肽含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白細(xì)胞粘附抑制指數(shù)≥50％。

7.一種生物制劑，優(yōu)選通過(guò)以上所述的本發(fā)明的方法制備，其含有一種或多種(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22或23種)選自以下的多肽：

1)、制劑指紋圖譜峰-1(p1)的氨基酸序列：hageygaeale；

2)、制劑指紋圖譜峰-2(p2)的氨基酸序列：eygaeale；

3)、制劑指紋圖譜峰-3(p3)的氨基酸序列：ageygaeale；

4)、制劑指紋圖譜峰-4(p4)的氨基酸序列：hvddmpnal；

5)、制劑指紋圖譜峰-5(p5)的氨基酸序列：avahvddmpnal；

6)、制劑指紋圖譜峰-6(p6)的氨基酸序列：eygaealerm；

7)、制劑指紋圖譜峰-7(p7)的氨基酸序列：adaltnavahv；

8)、制劑指紋圖譜峰-8(p8)的氨基酸序列：tnavahvddmpnal；

9)、制劑指紋圖譜峰-9(p9)的氨基酸序列：hvddmpnalsal；

10)、制劑指紋圖譜峰-10(p10)的氨基酸序列：altnavahvddmpnal；

11)、制劑指紋圖譜峰-11(p11)的氨基酸序列：avahvddmpnalsal；

12)、制劑指紋圖譜峰-12(p12)的氨基酸序列：ddmpnasal；

13)、制劑指紋圖譜峰-13(p13)的氨基酸序列：vddmpnasal；

14)、制劑指紋圖譜峰-14(p14)的氨基酸序列：tnavahvddmpnalsal；

15)、制劑指紋圖譜峰-15(p15)的氨基酸序列：ddmpnalsalsdlhah；

16)、制劑指紋圖譜峰-16(p16)的氨基酸序列：ltnavahvddmpnalsal；

17)、制劑指紋圖譜峰-17(p17)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsa；

18)、制劑指紋圖譜峰-18(p18)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnal；

19)、制劑指紋圖譜峰-19(p19)的氨基酸序列：altnavahvddmpnalsal；

20)、制劑指紋圖譜峰-20(p20)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnal；

21)、制劑指紋圖譜峰-21(p21)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsal；

22)、制劑指紋圖譜峰-22(p22)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnalsal；

23)、制劑指紋圖譜峰-23(p23)的氨基酸序列：geygaealermfl。

8.根據(jù)以上4-7的生物制劑，其為注射液或凍干粉針劑形式。

9.根據(jù)以上4-8中任一項(xiàng)的生物制劑在制備藥物或試劑盒中的應(yīng)用，所述藥物或試劑盒用于治療肝炎、肝硬化和/或肝癌，優(yōu)選用于治療乙型肝炎，優(yōu)選其中所述藥物或試劑盒還含有另外的用于治療乙型肝炎的藥物，如拉米夫定。

10.用于治療肝炎(優(yōu)選乙型肝炎)、肝硬化和/或肝癌的藥物組合物，其含有根據(jù)以上4-7中任一項(xiàng)的生物制劑和藥學(xué)上可接受的載體。

具體實(shí)施方式

一、抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的制備

(1)人胎盤材料的預(yù)處理

產(chǎn)婦體檢標(biāo)準(zhǔn)：病人血清學(xué)檢測(cè)，乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽(yáng)性；乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體(梅毒、淋病等)均為陰性結(jié)果的病人。

選用乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽(yáng)性，乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體均為陰性的胎盤。且患有惡性腫瘤、免疫缺陷病、急性傳染病、人工流產(chǎn)、死胎、各種畸形兒及肉眼檢查外觀不正常、保存運(yùn)輸不當(dāng)而變質(zhì)者均不得使用。

將新鮮人胎盤從無(wú)菌手術(shù)室獲得后，直接放入無(wú)菌0～4℃的保溫容器中，將胎盤處于真空包裝內(nèi)并在低溫(-20℃)的條件下存儲(chǔ)和運(yùn)輸，至gmp車間或glp實(shí)驗(yàn)室。在d級(jí)潔凈區(qū)，去除胎盤附屬結(jié)構(gòu)(臍帶和羊膜)所得胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干，切成小塊(約1cm²)，置無(wú)菌容器內(nèi)于低溫(-20℃)存儲(chǔ)。

(2)勻漿調(diào)配

取上述冷凍的胎盤組織塊，于20-30℃條件下解凍，隨后加入含有0.1mol/l(約0.6％)的氯化鈉的注射用水，胎盤：鹽水(重量比)＝1：2～4。在溫度為4～10℃的條件下，將混合物在均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)10～15min。完成均質(zhì)后的勻漿在高倍顯微鏡下觀察，見(jiàn)不到完整的細(xì)胞。

(3)有效成分的提取和病毒的滅活處理

將上述勻漿于10℃恒溫條件下，浸提有效成分1h。

再將勻漿升溫至55℃～65℃，連續(xù)均勻水浴10小時(shí)，完成病毒滅活。將勻漿冷卻至10℃以下。

(4)離心處理

將勻漿轉(zhuǎn)移至離心容器中。在溫度為4℃～10℃、轉(zhuǎn)速為3000-12000r/min的條件下離心30～100分鐘。檢測(cè)上清液ph值，應(yīng)在6.6-7.4之間。

胎盤轉(zhuǎn)移因子離心后的上清液不再用naoh調(diào)ph，如ph值低于規(guī)定的值，說(shuō)明提取過(guò)程中已發(fā)生酸敗，即自身發(fā)生降解或被微生物嚴(yán)重污染；如ph高于規(guī)定的值，說(shuō)明容器未清潔徹底，即有清潔管路時(shí)用的naoh殘留。

(5)超濾處理

將上清液經(jīng)80～200kd的中空超濾纖維柱超濾，濾液再用5～20kd的中空超濾纖維柱超濾，收集濾液，即抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子原液。

(6)除菌處理

收集原液，將所得原液用生理鹽水或注射用水稀釋調(diào)配后，使溶液中ph為6.6～7.4、多肽的含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白細(xì)胞粘附抑制指數(shù)≥50％，再經(jīng)過(guò)0.22μm孔徑的濾芯/濾膜除菌，得注射液半成品。

(7)注射制劑的制備

注射液半成品進(jìn)一步分裝制成注射液或凍干粉針。

二、人胎盤乙型肝炎免疫活性多肽的蛋白組學(xué)分析，確定抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品中的多肽種類。

1.樣品處理。

將抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品溶于含50mmdtt的ph8.5、100mmtrishcl的緩沖液，于37℃靜置1小時(shí)。然后，加入終濃度為60mm的碘乙酰胺，室溫下避光反應(yīng)1小時(shí)。待烷化反應(yīng)結(jié)束后，用三氟乙酸(tfa)將ph值調(diào)為2；多肽溶液脫鹽時(shí)，使用pepcleanc18柱(thermo)，依據(jù)柱生產(chǎn)廠家提供的操作步驟進(jìn)行。

2.lc-ms/ms分析。

在真空離心蒸發(fā)濃縮器中，將洗脫下來(lái)的多肽進(jìn)行脫水，隨后用0.1％tfa復(fù)溶。多肽樣品等分后試樣加載到lc-ms/ms系統(tǒng)，測(cè)定多肽序列。其中hplc使用內(nèi)徑75μmc18反相色譜柱，配對(duì)使用在線離子阱質(zhì)譜儀。hplc設(shè)計(jì)運(yùn)行200分鐘，柱流速是1μl/min。第一階段：130min時(shí)從2％調(diào)整至33％(b％)；第二階段：20min時(shí)調(diào)整到90％。質(zhì)譜儀開啟數(shù)據(jù)依賴模式和動(dòng)態(tài)排除功能。

3.數(shù)據(jù)分析。

首先使用廠家提供的pt_denovo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(1.1版)，并參考人類蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。再將鑒定到的肽段進(jìn)行人工分析和驗(yàn)證。

附圖說(shuō)明

圖1.根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制品中人胎盤免疫活性多肽(抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子)的指紋圖譜(lcms/ms)，其中顯示本發(fā)明選中的23個(gè)主峰；

圖2.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-1(p1)的氨基酸序列：hageygaeale；

圖3.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-2(p2)的氨基酸序列：eygaeale；

圖4.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-3(p3)的氨基酸序列：ageygaeale；

圖5.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-4(p4)的氨基酸序列：hvddmpnal；

圖6.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-5(p5)的氨基酸序列：avahvddmpnal；

圖7.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-6(p6)的氨基酸序列：eygaealerm；

圖8.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-7(p7)的氨基酸序列：adaltnavahv；

圖9.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-8(p8)的氨基酸序列：tnavahvddmpnal；

圖10.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-9(p9)的氨基酸序列：hvddmpnalsal；

圖11.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-10(p10)的氨基酸序列：altnavahvddmpnal；

圖12.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-11(p11)的氨基酸序列：avahvddmpnalsal；

圖13.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-12(p12)的氨基酸序列：ddmpnasal；

圖14.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-13(p13)的氨基酸序列：vddmpnasal；

圖15.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-14(p14)的氨基酸序列：tnavahvddmpnalsal；

圖16.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-15(p15)的氨基酸序列：ddmpnalsalsdlhah；

圖17.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-16(p16)的氨基酸序列：ltnavahvddmpnalsal；

圖18.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-17(p17)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsa；

圖19.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-18(p18)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnal；

圖20.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-19(p19)的氨基酸序列：altnavahvddmpnalsal；

圖21.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-20(p20)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnal；

圖22.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-21(p21)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsal；

圖23.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-22(p22)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnalsal；

圖24.人胎盤免疫活性多肽的指紋圖譜峰-23(p23)的氨基酸序列：geygaealermfl；

圖25.根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制品中人胎盤免疫活性多肽的hplc指紋圖譜(a)與cn1554363a的提取物的hplc指紋圖譜(b)的比較；

圖26.根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制品中人胎盤免疫活性多肽的hplc指紋圖譜；和

圖27.根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制品中人胎盤免疫活性多肽的分子量質(zhì)譜圖。

序列說(shuō)明

seqidno.1-制劑指紋圖譜峰-1(p1)的氨基酸序列：hageygaeale；

seqidno.2-制劑指紋圖譜峰-2(p2)的氨基酸序列：eygaeale；

seqidno.3-制劑指紋圖譜峰-3(p3)的氨基酸序列：ageygaeale；

seqidno.4-制劑指紋圖譜峰-4(p4)的氨基酸序列：hvddmpnal；

seqidno.5-制劑指紋圖譜峰-5(p5)的氨基酸序列：avahvddmpnal；

seqidno.6-制劑指紋圖譜峰-6(p6)的氨基酸序列：eygaealerm；

seqidno.7-制劑指紋圖譜峰-7(p7)的氨基酸序列：adaltnavahv；

seqidno.8-制劑指紋圖譜峰-8(p8)的氨基酸序列：tnavahvddmpnal；

seqidno.9-制劑指紋圖譜峰-9(p9)的氨基酸序列：hvddmpnalsal；

seqidno.10-制劑指紋圖譜峰-10(p10)的氨基酸序列：altnavahvddmpnal；

seqidno.11-制劑指紋圖譜峰-11(p11)的氨基酸序列：avahvddmpnalsal；

seqidno.12-制劑指紋圖譜峰-12(p12)的氨基酸序列：ddmpnasal；

seqidno.13-制劑指紋圖譜峰-13(p13)的氨基酸序列：vddmpnasal；

seqidno.14-制劑指紋圖譜峰-14(p14)的氨基酸序列：tnavahvddmpnalsal；

seqidno.15-制劑指紋圖譜峰-15(p15)的氨基酸序列：ddmpnalsalsdlhah；

seqidno.16-制劑指紋圖譜峰-16(p16)的氨基酸序列：ltnavahvddmpnalsal；

seqidno.17-制劑指紋圖譜峰-17(p17)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsa；

seqidno.18-制劑指紋圖譜峰-18(p18)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnal；

seqidno.19-制劑指紋圖譜峰-19(p19)的氨基酸序列：altnavahvddmpnalsal；

seqidno.20-制劑指紋圖譜峰-20(p20)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnal；

seqidno.21-制劑指紋圖譜峰-21(p21)的氨基酸序列：adaltnavahvddmpnalsal；

seqidno.22-制劑指紋圖譜峰-22(p22)的氨基酸序列：daltnavahvddmpnalsal；

seqidno.23-制劑指紋圖譜峰-23(p23)的氨基酸序列：geygaealermfl

實(shí)施例

以下的具體實(shí)例被解釋為僅僅是說(shuō)明性的，并且無(wú)論如何不以任何形式限制公開的其余部分。在沒(méi)有進(jìn)一步詳細(xì)細(xì)節(jié)的情況下，據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于本文的描述以本發(fā)明的最完整的范圍利用本發(fā)明。本文引述的全部公開物通過(guò)引用將它們的全部結(jié)合在此。

實(shí)施例1

人胎盤乙型肝炎特異免疫活性多肽制備方法，包括以下步驟：

1.與產(chǎn)婦簽署合作協(xié)議，獲取產(chǎn)婦體檢結(jié)果；對(duì)胎盤進(jìn)行采樣檢測(cè)，并于-20℃儲(chǔ)存。

2.在gmp車間或glp實(shí)驗(yàn)室，解凍胎盤，去除羊膜和臍帶后用純化水清洗并瀝干。

3.在4～10℃條件下，將胎盤用手術(shù)剪切成1cm²小塊，裝入無(wú)菌容器內(nèi)速凍。

4.取解凍胎盤塊，加入3倍胎盤重量的含0.1mol/l氯化鈉的注射用水，在均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)10min。高倍顯微鏡下檢查無(wú)完整細(xì)胞。

5.勻漿在10℃恒溫浸提有效成分1h。

6.在60℃條件下恒溫10h，滅活病毒。隨后降溫到10℃。

7.在4℃條件下，在離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，收集上清液，檢測(cè)ph值應(yīng)為6.6～7.4。

8.用100kd中空纖維超濾柱對(duì)上清液超濾，超濾液用10kd中空纖維超濾柱超濾，收集液即為原液。

9.用2×生理鹽水或注射用水對(duì)原液進(jìn)行調(diào)配，使溶液中ph為6.5～7.5、多肽的含量≥0.5mg/ml，核糖含量≥80μg/ml，白細(xì)胞粘附抑制指數(shù)≥50％。。

10.將調(diào)配好的原液用0.22μm的微孔濾膜除菌，得到半成品。

11.半成品分裝即得注射劑，或做成凍干粉針制劑成品。成品于2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中得到的抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品，對(duì)其中的有效成分進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.常規(guī)制劑質(zhì)控檢測(cè)(標(biāo)準(zhǔn)和方法引自《中國(guó)生物制品規(guī)程》2002年增補(bǔ)本--抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液相同項(xiàng)下)

外觀：應(yīng)為微黃色澄明液體，無(wú)異物、渾濁或沉淀；合格。

化學(xué)檢定：ph為6.8；蛋白質(zhì)反應(yīng)為陰性；多肽含量0.67mg/ml；核糖含量89μg/ml；合格。

無(wú)菌試驗(yàn)：無(wú)菌生長(zhǎng)；合格

熱原檢查：家兔每1kg體重注射劑量為3.0ml；合格。

異常毒性(小鼠法)：無(wú)異常反應(yīng)，動(dòng)物健存，體重增加；合格。

異常毒性(豚鼠法)：無(wú)異常反應(yīng)，動(dòng)物健存，體重增加；合格。

hbsag檢測(cè)：陰性；合格。

2.hplc指紋圖譜見(jiàn)圖26(標(biāo)準(zhǔn)和方法引自《中國(guó)生物制品規(guī)程》2002年增補(bǔ)本--抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液相同項(xiàng)下)

條件：packdoil-200(8.0×300mm)色譜柱，以0.1mpb-0.1mna2so4-0.05％nan3ph7.0的緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，流速0.6ml/min，靈敏度0.08aufs，對(duì)樣品稀釋20倍。

hplc指紋圖譜顯示：①在19.0～23.0min保留時(shí)間內(nèi)定有三個(gè)連續(xù)組份；②2、3組份總含量≥90％(以峰面積計(jì)算)；③第三組份含量為55±5％(以峰面積計(jì)算)；

3.抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的最大分子量測(cè)定。

采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，n2激光源，波長(zhǎng)337nm，激光發(fā)射脈寬4ns，線性飛行距離65cm，加速電壓22kv，檢測(cè)電壓1850v。采用正離子線性采集模式，基質(zhì)為cca。

根據(jù)質(zhì)譜圖(參見(jiàn)附圖27)判定：抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的最大分子量為8197da<10kd，符合規(guī)定。

4.根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制品中人胎盤免疫活性多肽的hplc指紋圖譜(25(a))與cn1554363a的hplc指紋圖譜(25(b))的比較。

1)因依cn1554363a制得的提取物，依題述檢測(cè)未能得到文中所提到的指紋圖譜，故未能進(jìn)行成分比對(duì)；

2)將本發(fā)明的提取物依照cn1554363a的檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)：packdoil-200(8.0×300mm)色譜柱，以0.1mpb-0.1mna2s04-0.05％nan3ph7.0的緩沖液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，流速0.6ml/min，靈敏度0.08aufs，對(duì)樣品稀釋20倍。

結(jié)果顯示：

a.圖25(a)中峰1＇、峰2＇和峰3＇的峰高比1：30：42，而圖25(b)中峰1、峰2和峰3的峰高比1：1.3：3.4；

b.圖25(a)中峰2＇和峰3＇組分峰面積之和>90％,與圖25(b)中峰2和峰3組分峰面積之和<90％不相同；

c.圖25(a)中峰4＇緊鄰峰3＇，而圖2中峰3后無(wú)緊鄰峰。

由以上可知，圖25(a)和圖25(b)指示的是兩種不同的物質(zhì)組合，因此本發(fā)明的提取物與cn1554363a的提取物在組分和含量方面都是不同的。

5.樣品經(jīng)過(guò)分離和分析獲得指紋圖譜(lcms/ms)(圖1，其中顯示本發(fā)明選中的23個(gè)主峰)。將含量最高的主要峰段進(jìn)行氨基酸序列分析，本發(fā)明中獲得23個(gè)主峰的氨基酸序列，質(zhì)譜圖見(jiàn)附圖2至24。

實(shí)施例3

1.抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的特異免疫活性測(cè)定--白細(xì)胞粘附抑制試驗(yàn)(標(biāo)準(zhǔn)和方法引自《中國(guó)生物制品規(guī)程》2002年增補(bǔ)本--抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液相同項(xiàng)下)

1.1小鼠白細(xì)胞懸液的制備：取體重22～25g健康小鼠5只，由眼靜脈放血，無(wú)菌取出脾臟，以hank's液洗3次，用無(wú)菌銅網(wǎng)輕輕壓碎制成細(xì)胞懸液，用1640培養(yǎng)液洗3次(1500r/min離心15分鐘)，然后每只鼠脾臟加3m1無(wú)菌蒸餾水破壞紅細(xì)胞，再加3.6％氯化鈉溶液1m1調(diào)整滲透壓，混勻后用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)1500r/min離心5分鐘，再分別用0.9％氯化鈉溶液和1640培養(yǎng)液各洗1次，收集細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁶～3.0×10⁶個(gè)/ml，備用。

供試品溶液的制備：取待檢品2ml備用。

1.2試驗(yàn)步驟：取潔凈的離心管2支，各加細(xì)胞懸液lml，一管加待檢樣品1ml為試驗(yàn)管，另一管加無(wú)菌0.9％氯化鈉溶液lml為對(duì)照管。置37℃致敏30分鐘，1500r/min離心10分鐘，棄上清液，每管沉淀分別準(zhǔn)確加入1640培養(yǎng)液1m1。取無(wú)菌培養(yǎng)瓶6個(gè)，前3瓶各加試驗(yàn)管細(xì)胞懸液0.2m1，后3瓶各加對(duì)照管細(xì)胞懸液0.2ml，然后每瓶?jī)?nèi)加純化hbsag0.2ml(hbsag100μg/ml)，1640培養(yǎng)液0.6m1，置co2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)1～2小時(shí)后，取出輕輕搖勻，靜置1～3分鐘，顯微鏡下計(jì)數(shù)未粘附的白細(xì)胞數(shù)。

2.3檢測(cè)結(jié)果：未粘附白細(xì)胞抑制指數(shù)(nai)＝(試驗(yàn)組平均未粘附細(xì)胞數(shù)一對(duì)照組平均未粘附細(xì)胞數(shù))/對(duì)照組平均未粘附細(xì)胞數(shù)×100％。(nai％應(yīng)不小于50％)

經(jīng)測(cè)定抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的特異免疫活性(nai％)為62。

2.小白鼠足掌注射試驗(yàn)

2.1材料：

取昆系小白鼠24只，雌雄各半，體重在18～22g之間，隨機(jī)分6組，每組12只。hbsag為2.0μg/ml。

樣品。實(shí)施例1中制得的抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品。

2.2試驗(yàn)方法。

實(shí)驗(yàn)組。取小白鼠12只，每天腹腔內(nèi)注射抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品0.2ml，連續(xù)5天，停止注射2天；第8天于后肢足掌皮下注射1μghbsag，第10天剪下注射部足掌，隨即以10％甲醛固定，送作病理切片、he染色檢查。

對(duì)照組。生理鹽水組取小白鼠12只，試驗(yàn)方法同實(shí)驗(yàn)組。

3.肉眼觀察。

各組小白鼠經(jīng)腹腔注射不同制劑后，均未見(jiàn)異常表現(xiàn)。但足掌皮下注射hbvm陽(yáng)性血清后，6h后注射側(cè)后肢膝以下即顯輕重不一的水腫、充血，次日晨更明顯，第三天基本消退；其中以抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組很明顯，甚至影響肢體運(yùn)動(dòng)，生理鹽水組不明顯，見(jiàn)表1。

表1足掌皮下注射后膝關(guān)節(jié)以下水腫、充血比較

4.病理切片檢查。

足掌注射處局部組織he染色，鏡下見(jiàn)除生理鹽水組外，實(shí)驗(yàn)組有局部程度不一的間質(zhì)水腫、充血，退變和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，一般以淋巴細(xì)胞為主，有的見(jiàn)較多的多核細(xì)胞。較生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)組局部病變明顯，見(jiàn)表2。

表2足掌皮下注射后局部病理檢查結(jié)果比較

結(jié)論：經(jīng)抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品腹腔注射的小白鼠，獲得對(duì)hbv特異免疫活性后，再次在足掌皮下遇到hbvm陽(yáng)性血清攻擊后，不僅肉眼觀察可見(jiàn)注射側(cè)后肢膝下明顯水腫、充血，同時(shí)足掌注射部病理切片he染色亦可見(jiàn)明顯水腫、充血、退變和細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以淋巴細(xì)胞為主。

3.抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的影響

3.1材料。選昆系健康小鼠30只，體重18-22g，隨機(jī)分為3組：生理鹽水對(duì)照組、抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組和乙肝疫苗+抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組。

3.2實(shí)驗(yàn)方法。對(duì)照組每天腹腔注射生理鹽水0.2ml/只，實(shí)驗(yàn)組每天腹腔注射抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品0.3ml./只，連續(xù)7天；乙肝疫苗在第一次腹腔注射時(shí)同時(shí)進(jìn)行，劑量1μg/只。在試驗(yàn)前1天和實(shí)驗(yàn)后第2天、第8天分別斷尾取血，取血20μl加入0.38ml白細(xì)胞稀釋液混勻，2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)；同時(shí)推血涂片2張，其一姬薩姆染色分類計(jì)數(shù)用于計(jì)算淋巴細(xì)胞絕對(duì)值；另一張進(jìn)行anae染色，油鏡下觀察計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，胞漿中有紫色顆粒者為anae陽(yáng)性細(xì)胞?？蓪nae陽(yáng)性細(xì)胞分為2個(gè)亞類，包漿中出現(xiàn)1-3個(gè)明顯紫紅色顆粒者為顆粒型(t-樣)，稀散或彌散細(xì)點(diǎn)者為彌散型(thy-型)。根據(jù)淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和各類細(xì)胞的百分率，分別計(jì)算出其絕對(duì)值。

3.3結(jié)果：

實(shí)驗(yàn)第2天小鼠淋巴細(xì)胞的變化。實(shí)驗(yàn)組各類t細(xì)胞均較對(duì)照組有不同程度的增長(zhǎng)，尤以t-樣細(xì)胞表現(xiàn)突出(p<0.01)，兩實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著差別，見(jiàn)表3。

實(shí)驗(yàn)第8天小鼠淋巴細(xì)胞的變化。實(shí)驗(yàn)組第8天anae陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組增加(p<0.01)，其中t-樣細(xì)胞增加最明顯，而thy-樣細(xì)胞組間無(wú)明顯差別。乙肝疫苗+抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組t-樣細(xì)胞顯著高于單純抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組(p<0.01)，見(jiàn)表4。

表3第2天小鼠白細(xì)胞的變化(個(gè)/mm³、)

表4第8天小鼠白細(xì)胞的變化(個(gè)/mm³、)

3.4討論

本研究結(jié)果表明，抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品可使小鼠外周血t4細(xì)胞增加，而且這種作用在用藥后48h就已經(jīng)開始。同時(shí)證明，抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品可使小鼠增加胸腺指數(shù)，而對(duì)脾指數(shù)無(wú)影響，b細(xì)胞并非來(lái)源于胸腺。

第8天實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血t4細(xì)胞均顯著高于對(duì)照組，表現(xiàn)出抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的非特異免疫活性；然而乙肝疫苗+抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組t4細(xì)胞比單純抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品組增加更明顯，兩者差別顯著(p<0.01)，表明了抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)hbv的特異免疫活性。小鼠免疫細(xì)胞被乙肝疫苗致敏后，使抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品的特異性免疫活性得以顯示，使得小鼠外周血t4細(xì)胞增加。

4.抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)乙型肝炎病例e花結(jié)和淋轉(zhuǎn)影響

4.1總玫瑰花結(jié)(ert)和活性玫瑰花結(jié)(art)檢查。

取肝素抗凝血2.5ml，以無(wú)鈣鎂離子hank液稀釋2倍，加淋巴細(xì)胞分離液，以2000r/min離心20min，分離單核細(xì)胞；吸取單核細(xì)胞層，hank液洗3次，混懸，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為4×10⁵個(gè)/ml；分2管，各0.3ml，一查ert、一檢art。取羊紅細(xì)胞(srbc)以hank液洗3次，混懸，計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為8×10⁷個(gè)/ml。

ert管內(nèi)加等量srbc，art管內(nèi)加1/2量srbc，500r/min離心5min，ert管置于4℃冰箱過(guò)夜，art管棄去適量上清液加0.25％戊二醛1滴，靜置1min，顆?；靹?，置4℃冰箱內(nèi)15～20min，顆?；靹颍科?，干后姬薩姆染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，凡結(jié)合3個(gè)以上srbc者為art細(xì)胞，計(jì)算百分?jǐn)?shù)。ert管過(guò)夜后亦按同法檢查計(jì)數(shù)。

4.2淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(ltt)

按常規(guī)制備rpmi1640用于ltt培養(yǎng)基，按無(wú)菌要求采靜脈血0.4ml，立即注入培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，置于37℃孵箱內(nèi)72h，孵育中每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2次。棄去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)上清液，使剩下約0.5ml培養(yǎng)基，混勻，吸入毛細(xì)塑料吸管內(nèi)，封住一端，2500r/min離心20min，取白細(xì)胞層涂片，甲醇固定，姬薩姆染色，油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，按下式計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：

4.3病例選擇。全部256例受檢者均為住院接受抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療的乙型肝炎患者，其中急性乙肝96例，慢性乙肝(活動(dòng)型)160例?；颊咦≡汉笾委熐凹打?yàn)血一次，以后在治療中一月左右和出院前再各查一次。另，任選健康獻(xiàn)血員30例驗(yàn)血一次作對(duì)照。

4.4檢查結(jié)果

4.4.1正常人和乙肝病例的ert、art和ltt。

急性乙肝和慢性乙肝病例的外周血平均ert、art和ltt均低于正常人，除慢性乙肝平均ert降低不太明顯外，其余均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。

表5正常人和乙肝病例的ert、ert和ltt

4.4.2乙肝病例經(jīng)抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療前后ert、art和ltt變化。

急慢性乙肝病例在接受特異胎盤肽治療后，平均ert、art和ltt均較治療前增多，其中除急性乙肝治療后art升高不明顯外，其余均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；出院前檢查，急性乙肝的平均ert、art和ltt增加明顯，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而慢性乙肝均明顯增多，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6-7。說(shuō)明抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品可使乙肝病例體內(nèi)t淋巴細(xì)胞增多、活化，增強(qiáng)病體免疫功能。

表6急性乙肝治療前后ert、ert和ltt變化

表7慢性乙肝治療前后ert、ert和ltt變化

4.5討論

經(jīng)檢測(cè)觀察，乙肝病例在接受治療前，平均ert、art和ltt均低于正常人，但在接受抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療后，特別是慢性乙肝病例，平均ert、art和ltt均明顯增多。說(shuō)明乙肝病例在接受抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療后，不僅t淋巴細(xì)胞有所增加，而且活性亦有增強(qiáng)。這一點(diǎn)與小白鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。

t淋巴細(xì)胞在人體免疫功能中具有重要的意義，特別在乙肝慢性化、病情遷延不愈和不能清除體內(nèi)hbv中，公認(rèn)具有密切關(guān)系，主要是因t淋巴細(xì)胞免疫功能低所致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察已初步證明抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品具有增進(jìn)t淋巴細(xì)胞免疫功能作用。

實(shí)施例4

將本專利所得抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品分裝成注射劑，進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示含有23種多肽的抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)乙型肝炎有治療效果。

1、臨床ii期試驗(yàn)

臨床研究單位：第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍傳染病?？浦行?；試驗(yàn)研究設(shè)計(jì)：收入97例病人。①分組pstf組(a組)，正常胎盤轉(zhuǎn)移因子組(b組)，豬苓多糖加乙肝疫苗組(c組)，空白對(duì)照組(d組)。方法：a組:pstf4ml(每ml含多肽0.8mg)，肌注，每日一次，3個(gè)月為一療程。b組：正常胎盤轉(zhuǎn)移因子4m1(每ml含多肽0.8mg)，肌注，每日一次，3個(gè)月為一療程。c組：豬苓多糖40mg，肌注，每日一次，用藥20天，休息10天為一療程，連續(xù)治療三個(gè)療程；同時(shí)皮下注射乙肝疫苗30μg，半月一次，共6次。d組：只進(jìn)行基礎(chǔ)治療。結(jié)果：結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療組的hbeag、hbv-dna陰轉(zhuǎn)率及抗hbe陽(yáng)轉(zhuǎn)率在治療結(jié)束時(shí)分別為53.6％、50.0％和42.9％，均顯著高于正常胎盤轉(zhuǎn)移因子治療組(9.1％，p<0.05)和空白對(duì)照組(6.3％，p<0.01)；隨訪3個(gè)月均為46.2％，均顯著高于空白對(duì)照組(8.7％，p<0.01)。正常胎盤轉(zhuǎn)移因子治療組和豬苓多糖加乙肝疫苗治療組與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。結(jié)論：抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品是一種有效、價(jià)廉、使用方便的抗乙型肝炎病毒藥物。

2、臨床iii期試驗(yàn)

臨床單位：解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)、河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所、重慶醫(yī)科大學(xué)、北京地壇醫(yī)院、山東泰安解放軍第88醫(yī)院。試驗(yàn)研究：入選370例慢性乙肝病人；①分組：a組pstf治療組；b、c組為對(duì)照組，b組是hbv標(biāo)志均為陰性胎盤提取的轉(zhuǎn)移因子(ptf)，c組為豬苓多糖+乙肝疫苗。②方法：a組與b組分別注射pstf和ptf4ml，1/d,20d為一療程，連續(xù)3療程；乙肝疫苗30μg每15d皮下注射一次，共6次。結(jié)果：治療結(jié)束后，a組alt復(fù)常率明顯高于c組(p<0.01)，但血清膽紅素(sb)復(fù)常率組間無(wú)顯著差異；a組hbv復(fù)制指標(biāo)陰轉(zhuǎn)率均顯著高于對(duì)照組(p<0.01)；a組hbv-dna及其與hbeag雙陽(yáng)性的陰轉(zhuǎn)率均顯著高于對(duì)照組。結(jié)論：抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)于改善臨床癥狀和體征，恢復(fù)肝功能及hbeag、hbvdna等病毒復(fù)制指標(biāo)的轉(zhuǎn)換均顯著優(yōu)于普通胎盤轉(zhuǎn)移因子、豬苓多糖+乙肝疫苗。

3.治療乙型肝炎肝硬變臨床研究：

臨床單位：解放軍第88醫(yī)院肝病研究所。試驗(yàn)研究：全部病例(258例)抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品，2-4ml肌注，每天1次，平均治療5月；并存少量腹水者口服適量利尿劑；同時(shí)均口服一般量維生素b1和c，不給其它治療肝病藥物。在自覺(jué)征象消失、肝功能正?；蚪咏＃_(dá)臨床治愈后再出院鞏固治療6-12月。結(jié)果：達(dá)到自覺(jué)征象消失、肝功能正?；蚪咏潓倥R床治愈,共180例(69.8％)；肝功能除絮狀試驗(yàn)和蛋白尚未正常外，其它均正常，劃屬臨床基本治愈，共31例(12.0％)；自覺(jué)征象消失,肝功能有進(jìn)步列為進(jìn)步共42例(16.3％)；活檢后未見(jiàn)明確效果5例(1.9％)；黃疸升高者平均治后40.0天下降正常，谷丙轉(zhuǎn)氨酶平均治后2月95.7％正常；絮狀試驗(yàn)、白球蛋白比和蛋白電泳r-球蛋白恢復(fù)較緩慢,平均治后4～5月70.1％正?；蚪咏＃籬bsag治后平均104.7天15例(5.9％)陰轉(zhuǎn)，活檢后平均54.0天15例出現(xiàn)hbsab，但二者并非見(jiàn)于同一病人；hbeag平均治后82.2天81例(55.5％)陰轉(zhuǎn)。結(jié)論：抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品對(duì)乙型肝炎肝硬化患者的癥狀和生化指標(biāo)有較好的改善作用。

4、聯(lián)合拉米夫定用藥對(duì)比研究

聯(lián)合用藥治療乙型肝炎臨床研究-1：臨床單位：廣西中醫(yī)學(xué)院附屬瑞康醫(yī)院。試驗(yàn)研究：①慢性乙型肝炎患者隨機(jī)分為2組，對(duì)照組：給予拉米夫定100mg，每日早晨空腹服用；治療組：給予拉米夫定100mg(服用同對(duì)照組)，同時(shí)給予抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品4ml(肌肉注射，每日1次)。2組療程均為3個(gè)月。方法：治療3個(gè)月，治療組的hbv-dna陰轉(zhuǎn)率和alt復(fù)常率均顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，外周血cd4亞群水平上，cd4/cd8比值趨于正常，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)。結(jié)果：治療3個(gè)月后，治療組的hbv-dna陰轉(zhuǎn)率和alt復(fù)常率均顯著高于對(duì)照組(p<0.05)，外周血cd4亞群水平上調(diào)，cd4/cd8比值趨于正常，與對(duì)照組相比有顯著性差異(p<0.05)。結(jié)論：抗乙肝特異胎盤轉(zhuǎn)移因子是一種有效、價(jià)廉、使用方便的抗乙型肝炎病毒藥物。

聯(lián)合用藥治療乙型肝炎臨床研究-2：臨床單位：杭州市第六人民醫(yī)院。試驗(yàn)研究：①分組：治療組--拉米夫定聯(lián)合抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品，對(duì)照組--單用拉米夫定。②方法：在一般對(duì)癥支持保肝治療基礎(chǔ)上，聯(lián)合治療給予拉米夫定口服，每天1次，療程24月，同時(shí)予抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品4ml/次肌注，前6個(gè)月每天一次，后隔日一次，療程12個(gè)月；對(duì)照組僅給予拉米夫定100mg口服，每天1次，療程24月。結(jié)果：治療結(jié)束后，聯(lián)合治療組hbeag血清轉(zhuǎn)換優(yōu)于對(duì)照組(p<0.05)；聯(lián)合治療組ymdd變異低于對(duì)照組(p<0.01)。結(jié)論：拉米夫定聯(lián)合抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子生物制品治療病毒復(fù)制活躍的活動(dòng)性肝硬化在hbeag血清轉(zhuǎn)換、ymdd變異上比單用拉米夫定有更好的臨床作用。

其他實(shí)施方案

在本說(shuō)明書中公開的全部特征可以以任意組合方式進(jìn)行組合。在本說(shuō)明書中所公開每個(gè)特征可以被服務(wù)于相同、等價(jià)或類似目的的備選特征替換。因此，除非另外清楚地說(shuō)明，所公開的每個(gè)特征僅僅是一般系列的等價(jià)或相似特征的實(shí)例。

由以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征，并且在不脫離其精神和范圍的情況下，可以做出本發(fā)明的各種變化和改變以使其適應(yīng)用途和條件。因此，其他實(shí)施方案也在權(quán)利要求之內(nèi)。