發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于保護(hù)母豬的后代免于豬流行性腹瀉病毒(pedv)感染的疫苗以及保護(hù)母豬的后代免于pedv感染的方法。
背景技術(shù)：
：豬流行性腹瀉病毒(pedv)是冠狀病毒科、甲型冠狀病毒屬的成員。其為正義(positive-sense)、有包膜、單鏈rna病毒。在1971年首次在英國(guó)育肥型和肥育豬中觀察到豬流行性腹瀉(ped)。在1980年代和1990年代，ped在整個(gè)歐洲，在國(guó)家諸如比利時(shí)、英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)、荷蘭和瑞士流行。這些爆發(fā)相對(duì)溫和，且可以控制。目前，沒有跡象表明歐洲存在pedv。伴隨高死亡率的嚴(yán)重的pedv爆發(fā)在亞洲是常見的，其中它在某些地區(qū)可能已變得流行性。自2010年以來，中國(guó)已經(jīng)出現(xiàn)了爆發(fā)的大幅增加，這是由于新毒株的出現(xiàn)，而目前pedv是導(dǎo)致亞洲養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失的主要病原體之一。亞洲樣pedv毒株在2013年4月首次進(jìn)入美國(guó)，并且已傳播至加拿大和拉丁美洲。pedv最通常經(jīng)由與受感染的豬的糞-口接觸來傳播，并且也可能通過受污染的設(shè)備、污染物或人員引入。受感染的豬、骯臟的鞋子、衣服、手、設(shè)備或卡車可以傳播該疾病。但也有跡象表明pedv可以通過空氣傳播。衛(wèi)生和生物安全是最佳的預(yù)防手段。在豬中，疾病的嚴(yán)重程度是可變的，并且取決于畜群的流行病學(xué)狀況。主要且通常唯一的臨床體征是急性水樣腹瀉和嘔吐。在未接種疫苗的動(dòng)物中，可以在所有年齡的豬中都觀察到嘔吐、急性水樣腹瀉和食欲不振；發(fā)病率接近100％。尤其乳豬是非常易感的，并且它們通常表現(xiàn)出水樣腹瀉、脫水和代謝性酸中毒，其中死亡率通常在50％和80％之間。另一方面，育肥型和生長(zhǎng)型豬表現(xiàn)出腹瀉、厭食和抑郁癥，其發(fā)病率高，但死亡率低(1-3％)。當(dāng)將pedv感染的豬引入未接種疫苗的場(chǎng)所時(shí)，臨床體征通常在4-5天內(nèi)出現(xiàn)。pedv不能傳播至人類。發(fā)明目標(biāo)本發(fā)明的目標(biāo)是設(shè)計(jì)適于保護(hù)幼豬免于pedv感染的疫苗。本領(lǐng)域中描述了旨在用于所有年齡的動(dòng)物抵抗pedv感染的疫苗。然而，在許多情況下未報(bào)告或未明確報(bào)告實(shí)際保護(hù)。需要能夠在幼豬中提供水平與典型豬在野生型感染后獲得的抗體水平相當(dāng)?shù)牟《局泻涂贵w(“vn”)的疫苗。發(fā)明概述為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，已經(jīng)設(shè)計(jì)了用于通過以對(duì)應(yīng)于至少3.0e6(即3.0x106)tcid50殺死的全pedv的抗原的劑量向母豬施用疫苗而保護(hù)母豬(術(shù)語(yǔ)“母豬”不排除雌性動(dòng)物實(shí)際上是小母豬)的后代免于豬流行性腹瀉病毒感染的疫苗，所述疫苗包含非活性pedv抗原和含油佐劑。已經(jīng)顯示，用該疫苗，母豬可以安全地免疫并且能夠達(dá)到至少與pedv野生型感染后存活的動(dòng)物中獲得的典型滴度相當(dāng)?shù)膙n滴度。油性佐劑看起來優(yōu)于廣泛使用的明礬佐劑，并且對(duì)于該特定疫苗是安全的(油的典型最小量為1％，但可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10%或甚至更高)。本發(fā)明部分基于這樣的認(rèn)識(shí)：鑒于當(dāng)前疫苗能夠在接種疫苗的豬中誘導(dǎo)非常高滴度的vn抗體，接種疫苗的母豬的后代將獲得相同水平或甚至更高水平的抗體，因?yàn)?，如通常已知，母豬能夠甚至進(jìn)一步將這些抗體集中于其初乳中。這與母豬能夠經(jīng)由哺乳額外提供細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的事實(shí)相結(jié)合，提供了當(dāng)前疫苗完全適合于通過哺乳保護(hù)接種疫苗的母豬的后代免于pedv感染(通常稱為生乳免疫)。優(yōu)選地，母豬在懷孕時(shí)接種疫苗，但母豬也可以在臨懷孕之前接種疫苗。實(shí)際上，天然水平滴度可以在至少四個(gè)月期間保護(hù)豬(參見：nationalhogfarmer,sep2,2014michaelmurtaugh,cheryldvorak,suzannestonedepartmentofveterinaryandbiomedicalsciences,universityofminnesota,st.paul;www.nationalhogfarmer.com)。因此，鑒于懷孕持續(xù)少于4個(gè)月的事實(shí)，在懷孕之前誘導(dǎo)高滴度應(yīng)當(dāng)能夠經(jīng)由哺乳提供對(duì)后代的保護(hù)，特別是當(dāng)母豬進(jìn)行重復(fù)接種疫苗時(shí)。例如，每8、10、12、14、16、18、20、22、24或26周(2、2?、3、3?、4、4?、5、5?或6個(gè)月)重復(fù)的常規(guī)一次性接種疫苗被認(rèn)為足以誘導(dǎo)并保持所需水平的滴度水平。此外，當(dāng)通過引發(fā)-加強(qiáng)接種疫苗(在通常2至4周的非常短時(shí)間段內(nèi)的兩次接種疫苗)替換(每次)一次性接種疫苗時(shí)，可以進(jìn)一步改善滴度。本發(fā)明還涉及保護(hù)母豬的后代免于豬流行性腹瀉病毒(pedv)感染的方法，所述方法包括向懷孕母豬施用包含非活性pedv抗原和含油佐劑的疫苗，其中所述疫苗包含對(duì)應(yīng)于至少3.0e6tcid50殺死的全pedv的劑量的抗原。定義疫苗是保護(hù)免于接種疫苗后感染病原微生物的組合物，即預(yù)防或減少微生物感染或免于由感染導(dǎo)致的臨床疾病的組合物，所述保護(hù)、預(yù)防或減少通常通過在接種疫苗的宿主中例如經(jīng)由抗體干擾微生物本身來實(shí)現(xiàn)。接種疫苗因此預(yù)防或至少降低感染水平和/或預(yù)防或至少降低由該感染導(dǎo)致的臨床疾病的水平。安全疫苗是這樣的疫苗，其在施用疫苗之后的頭24小時(shí)內(nèi)引發(fā)典型的低于2.0℃、優(yōu)選低于1.5℃、優(yōu)選低于1.0℃的直腸溫度升高，同時(shí)，如果其產(chǎn)生局部反應(yīng)，所述反應(yīng)必須是溫和的(腫脹低于10cm2，優(yōu)選低于5cm2，更優(yōu)選低于3cm2，甚至更優(yōu)選低于2cm2，最優(yōu)選低于1cm2)和短暫的(在2周內(nèi)、優(yōu)選1周內(nèi)、更優(yōu)選3天內(nèi)、最優(yōu)選一天內(nèi)消失)。非活的豬流行性腹瀉病毒抗原意指不同于活的(能夠復(fù)制的)全病毒的pedv抗原。具體而言，其涵蓋殺死的病毒和病毒亞單位，后者任選地被重組表達(dá)。不可代謝的油是在動(dòng)物的壽命期間(對(duì)于豬，這直到豬為26-30周齡)，在施用之后不被個(gè)體動(dòng)物代謝的油(礦物、天然或合成來源的液體物質(zhì)，其不能與水自由混合)。所述油可以分布在動(dòng)物體內(nèi)，但不會(huì)被動(dòng)物的代謝過程降解。實(shí)例是礦物油諸如液體石蠟油或重礦物油、天然油諸如角鯊?fù)?氫化的鯊魚肝油)、以及合成油諸如合成c15-c17烴類。對(duì)應(yīng)于至少“x”tcid50殺死的全pedv的非活抗原的劑量意指非活性抗原(即，不同于能夠復(fù)制的全微生物的抗原)的劑量使得用非活抗原至少獲得與用每劑量包含“x”tcid50殺死的全ped病毒的疫苗可以獲得的vn滴度相同的vn滴度。殺死的全病毒意指由殺死(滅活)活的全病毒導(dǎo)致的抗原性構(gòu)成。這不排除病毒顆粒在滅活或任何進(jìn)一步下游處理期間至少部分破裂。對(duì)應(yīng)于蛋白(的一部分)的多肽意指所述多肽至少含有該蛋白(的部分)，其在蛋白(的該部分)的長(zhǎng)度上與天然存在的蛋白具有至少80％的序列同源性，優(yōu)選至少81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99直至最高達(dá)100％的序列同源性。pedv的刺突蛋白是約1400個(gè)氨基酸長(zhǎng)的大型i型跨膜蛋白。像冠狀病毒的其它刺突蛋白一樣，所述蛋白是高度糖基化的。所述刺突蛋白被布置在兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中：稱為s1的負(fù)責(zé)受體結(jié)合的n-末端結(jié)構(gòu)域和負(fù)責(zé)融合的c-末端s2結(jié)構(gòu)域。實(shí)施方案在根據(jù)本發(fā)明使用的疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原的劑量對(duì)應(yīng)于至少1.5e7tcid50殺死的全pedv。在該劑量下，看起來可能獲得對(duì)應(yīng)于pedv野生型感染后誘導(dǎo)的峰值水平的滴度水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述油是不可代謝的油。不可代謝的油，盡管在許多情況下對(duì)豬不安全，但看起來優(yōu)于其它佐劑，諸如廣泛使用的可代謝的油和氫氧化鋁凝膠，并且當(dāng)以有限量施用時(shí)，特別是當(dāng)油以小于50%v/v、優(yōu)選小于40%v/v的量存在時(shí)，不可代謝的油對(duì)于該特定疫苗是安全的。降低油的量預(yù)期甚至進(jìn)一步增加安全性。優(yōu)選地，油的量在10％和40％之間，更優(yōu)選地在15％和30％之間。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述油乳化在親水性溶劑中。在親水性溶劑諸如例如水中乳化所述油，預(yù)期進(jìn)一步增加疫苗的安全性。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，除了不可代謝的油以外，所述疫苗還包含維生素e乙酸酯。該油性、可生物降解的物質(zhì)可以進(jìn)一步改進(jìn)疫苗功效和穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原含有對(duì)應(yīng)于pedv的刺突蛋白的s1結(jié)構(gòu)域的c末端三分之二的多肽。ped病毒的該部分已經(jīng)證明能夠并提供所需vn滴度。優(yōu)選地，所述多肽對(duì)應(yīng)于pedv的刺突蛋白的s1結(jié)構(gòu)域或甚至pedv的整個(gè)刺突蛋白。一種將刺突蛋白呈遞至免疫系統(tǒng)的簡(jiǎn)單方法是提供殺死的全pedv作為抗原。實(shí)施例實(shí)施例1病毒中和測(cè)定在vero細(xì)胞上使用病毒中和(vn)測(cè)定法測(cè)試血清中針對(duì)pedv的中和抗體的存在。簡(jiǎn)言之，在含有抗生素青霉素和鏈霉素的amem-tpb細(xì)胞培養(yǎng)基中制備測(cè)試樣品或參考血清的連續(xù)兩倍稀釋液。每種稀釋物與等體積的100tcid50的感染性pedv毒株混合，所述感染性pedv毒株在感染易感vero細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)。在37℃下預(yù)溫育1小時(shí)后，將病毒/血清稀釋混合物轉(zhuǎn)移至含有vero-ccl81細(xì)胞的96孔微量滴定板。在37℃下溫育48小時(shí)后，通過顯微鏡測(cè)定指示病毒復(fù)制的gfp熒光的程度。將抗體滴度計(jì)算為其中表明無病毒復(fù)制的最高血清稀釋度的倒數(shù)的log2。獲得的vn滴度被表示為從重復(fù)測(cè)量計(jì)算的平均值。以該方式，確定了在感染后存活的野生型pedv感染的豬中的vn滴度為5.0log2/ml或更高的水平，其中峰值水平為8.0至9.0log2。實(shí)施例2佐劑類型的影響研究設(shè)計(jì)20只pedv血清陰性的仔豬可用于該試驗(yàn)。當(dāng)仔豬為大約五周齡時(shí)，將它們經(jīng)由肌內(nèi)(im)途徑接種疫苗，并在其后2周加強(qiáng)。所有施加都給予至頸部中。所述疫苗在2ml中含有1.5·107tcid50的1mm雙乙烯亞胺(bei)滅活的殺死的全pedv(細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的dr13)。在臨第一次接種疫苗之前和其后一、二、三、四和五周收集血液樣品。從血液樣品收集血清，并測(cè)定病毒中和抗體滴度。在每次接種疫苗當(dāng)天和其后測(cè)量直腸溫度。將動(dòng)物分成四組，每組五只動(dòng)物(參見表1)。第一組接受市售佐劑xsolve?(可得自msdanimalhealth,boxmeer,thenetherlands)中配制的殺死的全病毒疫苗，使得最終疫苗包含21%v/v的不可代謝的油marcol?52和1.25%v/v的可代謝的油維生素e乙酸酯。第二組接受市售佐劑diluvacforte?(可得自msdanimalhealth,boxmeer,thenetherlands)中配制的相同抗原，使得最終疫苗包含7.5%v/v的可代謝的油維生素e乙酸酯。第三組接受含有明礬水凝膠的疫苗prosystem?ce(可得自merckanimalhealth,usa)中配制的相同抗原。第四組接受無佐劑的水中配制的相同抗原。表1.動(dòng)物組及其處理的概述組別仔豬數(shù)pedv抗原劑量佐劑15殺死的全病毒1.5e7tcid50xsolve25殺死的全病毒1.5e7tcid50diluvacforte35殺死的全病毒1.5e7tcid50prosystemce45殺死的全病毒1.5e7tcid50-結(jié)果體溫每組的平均體溫的概述顯示于表2中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，沒有一種疫苗引起超過1℃的嚴(yán)重溫度升高，并且xsolve誘導(dǎo)了所測(cè)試的三種佐劑中的最大溫度升高。在該組中觀察到的最高個(gè)體溫度升高為1.7℃。表2.第一次或第二次接種疫苗后取得的平均直腸溫度。病毒中和測(cè)定每組的計(jì)算的平均vn滴度圖示顯示于圖1中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，殺死的全病毒抗原能夠誘導(dǎo)良好的vn滴度。佐劑的貢獻(xiàn)如下：基于不可代謝的油的佐劑產(chǎn)生最高滴度，隨后是基于可代謝的油的佐劑，其后是基于氫氧化鋁凝膠的佐劑。實(shí)施例3非活抗原類型的影響研究設(shè)計(jì)60只pedv血清陰性的仔豬可用于該試驗(yàn)。當(dāng)仔豬為大約五周齡時(shí)，將它們用2ml疫苗經(jīng)由肌內(nèi)(im)途徑免疫，并在其后3周加強(qiáng)。所有施加都給予至頸部中。實(shí)驗(yàn)組的概述在表3中給出。在第一次接種疫苗之前和其后兩、三、四、五和六周收集血液樣品。從血液樣品收集血清，并測(cè)定病毒中和抗體滴度。在接種疫苗當(dāng)天和其后4和24小時(shí)測(cè)量直腸溫度。在每次接種疫苗后，在接種疫苗后2、4、6、8、10、12和14天在接種疫苗部位上觸診所有仔豬。表3.動(dòng)物組及其處理的概述材料和方法亞單位疫苗本研究中使用的亞單位疫苗中存在的抗原基于pedv刺突(s)蛋白的s1結(jié)構(gòu)域。s1氨基酸序列源自與指標(biāo)毒株usa/colorado/2013相同的美國(guó)分離株。使用全長(zhǎng)s1結(jié)構(gòu)域以及s1結(jié)構(gòu)域的n-末端三分之一或c-末端三分之二。為了促進(jìn)蛋白純化和改善免疫原性，將一些s1蛋白用源自人或豬免疫球蛋白的fc片段c-末端標(biāo)記。所有蛋白都在hek293t細(xì)胞中表達(dá)，純化，并測(cè)定蛋白含量。簡(jiǎn)言之，用編碼所需pedv多肽(任選地具有小鼠fc標(biāo)簽)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后一天，用新鮮培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后六天，收集細(xì)胞培養(yǎng)基并將其通過離心澄清。隨后通過與a蛋白瓊脂糖珠結(jié)合來純化多肽。在允許多肽結(jié)合珠粒后，將其使用pbs洗滌三次，并且將多肽洗脫于0.5mhacph3中。通過使用3mtrisph8.8中和ph(最終ph7.5)。最后，使用nanodrop在od280處測(cè)定多肽濃度。將多肽儲(chǔ)存在-80℃下。s1蛋白的概述在圖2中給出。在xsolve中以10μgs1蛋白/2ml劑量配制亞單位疫苗。殺死的病毒疫苗kv疫苗含有用1mmbei滅活的殺死的全pedv。該毒株，細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)的d13，與usa/colorado/2013共享93.3％的其氨基酸。將kv抗原在xsolve中配制為即用型制劑。病毒中和測(cè)定在vero細(xì)胞上使用病毒中和(vn)測(cè)定法測(cè)試血清中針對(duì)pedv的中和抗體的存在。簡(jiǎn)言之，在含有抗生素青霉素和鏈霉素的amem-tpb細(xì)胞培養(yǎng)基中制備測(cè)試樣品或參考血清的連續(xù)兩倍稀釋液。每種稀釋物與等體積的100tcid50的感染性pedv毒株混合，所述感染性pedv毒株在感染易感vero細(xì)胞后表達(dá)綠色熒光蛋白(gfp)。在37℃下預(yù)溫育1小時(shí)時(shí)段后，將病毒/血清稀釋混合物轉(zhuǎn)移至含有vero-ccl81細(xì)胞的96孔微量滴定板。在37℃下溫育48小時(shí)后，通過顯微鏡測(cè)定指示病毒復(fù)制的gfp熒光的程度。將抗體滴度計(jì)算為其中表明無病毒復(fù)制的最高血清稀釋度的倒數(shù)的log2(每50μl)。獲得的vn滴度被表示為從重復(fù)測(cè)量計(jì)算的平均值。在允許使用毒株dr13或毒株gd01的替代vn測(cè)試中測(cè)試合并的血清。由于gd01需要胰蛋白酶用于感染，如下修改上述方法：在37℃下共溫育1小時(shí)后，將病毒/血清混合物在vero-ccl81細(xì)胞上在37℃下放置2小時(shí)。然后除去混合物，將細(xì)胞用pbs洗滌兩次，并且在加有10μg/ml胰蛋白酶的amem-tpb(對(duì)于gd01)(或在毒株dr13用于該程序的情況下，無胰蛋白酶的amem-tpb)存在的情況下，將細(xì)胞在37℃下溫育48小時(shí)。pedv抗體elisa在抗體elisa中測(cè)定血清中的針對(duì)源自u(píng)sa/colorado/2013的pedv刺突蛋白的s1部分的抗體。為此，將板用100μlpedvs1(0.25μg/ml)包被。將血清在pbs0/1%bsa中1:900稀釋，并添加至包被的孔中，隨后在37℃下溫育1小時(shí)。在用pbs0/0.05%tween-20兩次洗滌后，將100μlpbs0/1%bsa/0.5%tween20中1:10,000稀釋的兔α豬igghrpo綴合物添加至孔中，并且將板在37℃下溫育1小時(shí)。用pbs0/0.05%tween-20三次洗滌后，向每個(gè)孔中添加100μl/孔的tmb“超緩慢”底物，隨后在室溫下溫育10分鐘(在黑暗中)。通過向每孔添加100μl的25％硫酸終止反應(yīng)。用elisa閱讀器測(cè)量在405nm處的光密度(od)。包括來自天然感染的豬的血清作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果體溫每組的平均體溫的概述顯示于表4中?？梢缘贸鼋Y(jié)論，沒有一種疫苗引起超過1攝氏度的嚴(yán)重的平均溫度升高。在接種疫苗后4小時(shí)看到最大的溫度升高，但在大多數(shù)情況下，在接種疫苗后24小時(shí)溫度恢復(fù)至正常水平。對(duì)于組6中的一只動(dòng)物，在加強(qiáng)接種疫苗后4小時(shí)，觀察到最高的個(gè)體溫度升高(2.3℃)。表4.第一次或第二次接種疫苗后取得的平均直腸溫度。局部反應(yīng)在接種疫苗后2、4、6、8、10、12和14天，在肌內(nèi)疫苗施加部位觸診動(dòng)物。從長(zhǎng)度和寬度(以cm計(jì))，計(jì)算局部反應(yīng)(即腫脹)的表面。組2b中的一只動(dòng)物在加強(qiáng)接種疫苗后直接顯示非常溫和(<1cm2)和短暫的(在一天內(nèi)消失)腫脹。對(duì)于所有其它59只動(dòng)物，沒有觀察到局部反應(yīng)。病毒中和抗體對(duì)于殺死的全病毒疫苗，使用待通過血清抗體中和的dr13毒株進(jìn)行病毒中和測(cè)定。每組的計(jì)算的平均vn滴度呈現(xiàn)于表5中。從該表可以得出結(jié)論，dr13kv抗原以明顯的劑量反應(yīng)方式誘導(dǎo)良好的vn滴度?？雌饋?，對(duì)應(yīng)于3.0e6tcid50殺死的全pedv的最小劑量是誘導(dǎo)高于5log2的vn滴度所必需的。本實(shí)施例的結(jié)果證實(shí)了實(shí)施例2的結(jié)果。表5.pedv中和抗體滴度(log2/50μl)。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時(shí)間(t)。對(duì)于亞單位疫苗，使用替代vn測(cè)試。這是因?yàn)樵谄渌黺n測(cè)試中使用的dr13-gfp毒株的刺突蛋白與衍生s1亞單位的us分離株的刺突蛋白約93.3％相同，并且與毒株gd01的刺突約92.7％相同。該序列差異可能解釋為什么在其它測(cè)試中不能檢測(cè)到vn抗體。因此，在每組中合并血清，并在允許使用dr13-gfp或gd01毒株的替代vn測(cè)試中測(cè)定血清中和抗體的存在。結(jié)果概述于表6中。表6.合并血清中的pedv中和抗體滴度(log2/50μl)。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時(shí)間(t)。實(shí)際上，dr13毒株看起來不適合于檢測(cè)由亞單位疫苗誘導(dǎo)的vn滴度。然而，殺死的全病毒疫苗的合并血清中的dr13中和抗體滴度看起來與在第一次接種疫苗后4、5和6周個(gè)別測(cè)定的vn滴度的組平均值良好對(duì)應(yīng)(結(jié)果未顯示)。該結(jié)果證明：(i)可以合并血清以建立每組的vn滴度，和(ii)用于測(cè)定合并血清中的vn滴度的替代vn測(cè)定法提供與針對(duì)dr13-gfp專門開發(fā)的vn測(cè)定法相似的結(jié)果。如果測(cè)定gd01中和抗體滴度，則s1亞單位的結(jié)果(如表6、右側(cè)欄中所示)如下：除了s1-n-fc，它們都誘導(dǎo)vn滴度。數(shù)據(jù)顯示：(i)完整s1或其c-末端部分是用于觸發(fā)vn抗體應(yīng)答的良好抗原，和(ii)具有fc片段的c-末端延伸改善免疫應(yīng)答。此外，顯示10μg的s1亞單位能夠誘導(dǎo)vn滴度，其至少與用每劑量包含3e06tcid50殺死的全ped病毒的疫苗獲得的水平相同。因此，10μg的s1亞單位是對(duì)應(yīng)于至少3e06tcid50殺死的全ped病毒的劑量。為了檢查這后一種對(duì)應(yīng)關(guān)系，使用x-solve佐劑和0.4μg-2.0μg-10μg-50μg的s1亞單位的劑量范圍制作劑量-反應(yīng)曲線。在im接種疫苗(引發(fā)-加強(qiáng)方案，其具有三周的時(shí)間間隔)之后，較低劑量導(dǎo)致約僅1的最大vn滴度(log2/50μl，接種疫苗后6周)，而10μg組具有6.5的vn滴度，而50μg組具有7.0的vn滴度。這證實(shí)了10μg的s1亞單位是對(duì)應(yīng)于至少3e06tcid50殺死的全ped病毒(即，確定的能夠誘導(dǎo)至少5的vn滴度的最小劑量)的劑量。針對(duì)刺突的s1亞單位的抗體在接種疫苗后的最后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)上述合并的血清進(jìn)行elisa。elisa數(shù)據(jù)與vn滴度良好對(duì)應(yīng)(參見表7)。表7.s1elisa中測(cè)量的1:900稀釋的血清的od450值。以第一次接種疫苗后的周數(shù)表示時(shí)間(t)。當(dāng)前第1頁(yè)12