本

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
是關(guān)于抑制難辨梭狀芽孢桿菌(clostridiumdifficile)。更具體來說，本發(fā)明內(nèi)容是關(guān)于fe3-δo4納米粒子于抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的新穎用途。

背景技術(shù)：

部分細(xì)菌會(huì)通過形成孢子存活于諸如紫外光照射、干燥、高溫、極冷及化學(xué)消毒劑處理等嚴(yán)峻及養(yǎng)份缺乏的環(huán)境中。一旦環(huán)境轉(zhuǎn)換，孢子可再活化為營養(yǎng)狀態(tài)(vegetativestate)。因此，芽孢桿菌(bacillus)及梭狀芽孢桿菌等會(huì)形成孢子的病原體乃為臨床疾病治療及預(yù)防的一重大挑戰(zhàn)。難辨梭狀芽孢桿菌是一種會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生危害的病原體，難辨梭狀芽孢桿菌感染(c.difficileinfection,cdi)會(huì)造成抗生素治療相關(guān)腹瀉、偽膜性腸炎(pseudomembranouscolitis)、腹痛、發(fā)燒及死亡。目前僅有少數(shù)抗生素可用以治療難辨梭狀芽孢桿菌感染。然而，第一線抗生素的失效率及治療后的復(fù)發(fā)率往往偏高。有鑒于此，難辨梭狀芽孢桿菌于感染后30天的死亡率約為6.9％，感染1年后的死亡率則約為16.7％。

難辨梭狀芽孢桿菌的孢子是造成難辨梭狀芽孢桿菌感染的主因之一。相較于對(duì)氧氣敏感的營養(yǎng)細(xì)菌(vegetativebacteria)，難辨梭狀芽孢桿菌孢子可于嚴(yán)峻的環(huán)境下存活數(shù)個(gè)月。已知腸道中的正常菌叢會(huì)抑制難辨梭狀芽孢桿菌，并以此抑制難辨梭狀芽孢桿菌感染。然而，長期使用抗生素的病患通常是感染難辨梭狀芽孢桿菌的主要族群，且其感染源多是源自醫(yī)療人員身上的孢子。一旦孢子進(jìn)入人類的腸胃道，并接觸到牛膽酸鹽(taurocholate)或其衍生物后，該些孢子會(huì)發(fā)芽(germinate)，進(jìn)而群聚于結(jié)腸。難辨梭狀芽孢桿菌的毒性多是取決定tcda及tcdb基因的表現(xiàn)，其會(huì)分別表現(xiàn)毒素a(toxina，一種腸毒素)及毒素b(toxinb，一種細(xì)胞毒素)。二種毒素皆會(huì)造成腸道發(fā)炎，并促使嗜中性球(neutrophil)侵潤至感染部位。

有鑒于感染率逐年增加，如何有效控制難辨梭狀芽孢桿菌感染已變成一亟需解決的重要議題。已知包含甲硝唑(metronidazole)、萬古霉素(vancomycin)及非達(dá)霉素(fidaxomicin)等不同的抗生素可用以治療難辨梭狀芽孢桿菌感染。該些抗生素雖可減緩或阻斷難辨梭狀芽孢桿菌感染所造成的癥狀，然其也會(huì)導(dǎo)致具有抗性的難辨梭狀芽孢桿菌增生。此外，對(duì)化學(xué)消毒劑具有抗性的孢子會(huì)加重臨床上難辨梭狀芽孢桿菌感染處理的難辨性。某些新穎的膽酸鹽(cholate)衍生物或可治療難辨梭狀芽孢桿菌感染，然其多屬臨床前研究階段。次氯酸鈉(sodiumhypochlorite)為一種消毒劑，具有顯著的抗菌活性，正因?yàn)樵擄@著的抗菌活性次氯酸鈉也同時(shí)會(huì)對(duì)組織產(chǎn)生腐蝕性及刺激性等副作用。

基于目前已知的治療無法有效治療難辨梭狀芽孢桿菌感染，相關(guān)領(lǐng)域研究人員正亟力研發(fā)可用以解決此健康議題的新穎方法。在該些研究中，納米粒子已證實(shí)可通過產(chǎn)生自由基(reactiveoxygenspecies)、破壞細(xì)胞膜、釋放毒性離子及/或與硫基結(jié)合等不同機(jī)制產(chǎn)生抗菌功效。該些具有抗菌功效的納米粒子包含銀(ag)、氧化鋅(zno)、二氧化鈦(tio2)及零價(jià)鐵(zero-valentiron)納米粒子。然而，多數(shù)抗菌納米粒子僅對(duì)營養(yǎng)細(xì)胞(vegetativecell)具有生物毒殺活性，而不會(huì)對(duì)孢子產(chǎn)生殺孢子功效。

有鑒于此，相關(guān)領(lǐng)域亟需一種有效且具生物兼容性的孢子抑制劑，以此控制孢子的發(fā)芽并治療難辨梭狀芽孢桿菌感染。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明內(nèi)容旨在提供本公開內(nèi)容的簡化摘要，以使閱讀者對(duì)本發(fā)明內(nèi)容具備基本的理解。此發(fā)明內(nèi)容并非本發(fā)明內(nèi)容的完整概述，且其用意并非在指出本發(fā)明實(shí)施例的重要/關(guān)鍵組件或界定本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明內(nèi)容是關(guān)于fe3-δo4納米粒子于抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的新穎用途，其中δ為一介于0到0.3之間的數(shù)值。據(jù)此，fe3-δo4納米粒子可用以制備一種用以治療難辨梭狀芽孢桿菌感染的藥物。

本發(fā)明內(nèi)容的第一實(shí)施例因此是關(guān)于一種于活體外抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的方法。該方法包含將難辨梭狀芽孢桿菌的孢子與一有效量的fe3-δo4納米粒子共同培養(yǎng)，其中δ為一介于0到0.3之間的數(shù)值。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，納米粒子為一截角八面體粒子(truncatedoctahedronnanoparticle)；其中，截角八面體的各邊長度約為5到25納米。在一實(shí)施方式中，各邊長度約為14納米。在另一實(shí)施方式中，各邊長度約為22納米。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，納米粒子的有效量至少為每毫升5微克；較佳的情況是，約為每毫升5到500微克。

本發(fā)明內(nèi)容也提供一種用以治療難辨梭狀芽孢桿菌感染的醫(yī)藥組合物及/或用以治療一罹患或疑以患有難辨梭狀芽孢桿菌感染的個(gè)體的方法。據(jù)此，該組合物包含一有效量的fe3-δo4納米粒子，其中δ為一介于0到0.3之間的數(shù)值；以及一藥學(xué)上可接受的載體。依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，該納米粒子為一截角八面體粒子，且八面體的各邊長度約為5到25納米。在一較佳實(shí)施方式中，各邊長度約為14納米。在另一特定實(shí)施方式中，各邊長度約為22納米。

該方法包含投予該個(gè)體一治療有效量的本發(fā)明組合物，以此減緩難辨梭狀芽孢桿菌感染的病征。依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，約投予該個(gè)體每公斤體重0.4到4毫克的fe3-δo4納米粒子；較佳的情況是，約投予該個(gè)體每公斤體重2到4毫克的fe3-δo4納米粒子。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，可以口服、鼻腔或非口服方式投予本發(fā)明fe3-δo4納米粒子。一般來說，非口服方法可以是經(jīng)由肌肉注射、靜脈注射、皮下注射或腹腔注射來投予。

在參閱下文實(shí)施方式后，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者當(dāng)可輕易了解本發(fā)明的基本精神及其他發(fā)明目的，以及本發(fā)明所采用的技術(shù)手段與實(shí)施方式。

附圖說明

為讓本發(fā)明的上述與其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)與實(shí)施例能更明顯易懂，所附圖式的說明如下：

第1圖是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例1.1所繪示的難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽動(dòng)態(tài)，其中該孢子是分別以(a)氧化鋅(zno)納米粒子，(b)銀(ag)納米粒子，(c)三氧化二鐵(fe2o3)納米粒子，(d)四氧化三鐵(fe3o4)納米粒子，(e)非氧化鐵核-金殼層納米粒子(以下簡稱為fe@au納米粒子)，及(f)本發(fā)明fe3-δo4納米粒子進(jìn)行處理；

圖2是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例1.2所繪示的難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽動(dòng)態(tài)，其中該孢子是分別以每毫升500微克的22納米的fe3-δo4(▲)、每毫升500微克的14納米的fe3-δo4(■)、每毫升50微克的22納米的fe3-δo4(□)、每毫升50微克的14納米的fe3-δo4(△)及3％漂白劑(●)進(jìn)行處理；

圖3是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例1.3所繪示的難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽動(dòng)態(tài)，其中菌株ccug19126(a)及atccbaa-1805(b)是分別以每毫升500微克的fe3-δo4(▲)、每毫升50微克的fe3-δo4每毫升5微克的fe3-δo4(△)及3％漂白劑(●)進(jìn)行處理；

圖4是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例2所繪示的細(xì)胞存活柱狀圖，其中難辨梭狀芽孢桿菌營養(yǎng)細(xì)胞(vegetativecell)是分別以控制組、fe3-δo4納米粒子及漂白劑進(jìn)行處理；

圖5是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例2所繪示的難辨梭狀芽孢桿菌孢子的電子顯微照片，其中該難辨梭狀芽孢桿菌孢子是分別以對(duì)照組(未經(jīng)處理的孢子)、每毫升50微克的fe3-δo4及每毫升500微克的fe3-δo4進(jìn)行處理；上方照片是以10,000倍的放大倍率拍攝，下方照片則是以30,000倍的放大倍率拍攝；

圖6是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例2所繪示的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-polyacrylamidegelelectrophoresis,sds-page)照片，其是關(guān)于未經(jīng)(第1-3蛋白條)或經(jīng)(第4-6蛋白條)fe3-δo4納米粒子處理的難辨梭狀芽孢桿菌孢子的胞外蛋白(上圖)及胞內(nèi)蛋白(下圖)表現(xiàn)量；

圖7a是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.1所繪示的柱狀圖，其是關(guān)于經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌孢子感染的小鼠的平均體重改變量，其中白色柱狀代表接受fe3-δo4納米粒子處理的小鼠，而黑色柱狀則代表未接受fe3-δo4納米粒子處理的小鼠；

圖7b是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.1所繪示的柱狀圖，其是關(guān)于經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌孢子感染的小鼠的盲腸重量，其中白色柱狀代表接受fe3-δo4納米粒子處理的小鼠，而黑色柱狀則代表未接受fe3-δo4納米粒子處理的小鼠；

圖7c是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.1所繪示的盲腸的發(fā)炎狀態(tài)，該些盲腸是分別取自接受及未接受fe3-δo4納米粒子處理的小鼠，并利用活體影像系統(tǒng)(invivoimagingsystems，ivis，左圖)偵測后，以柱狀圖分析表示(右圖)；

圖7d是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.1所繪示的結(jié)腸組織病理照片，該些結(jié)腸是分別取自經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌孢子感染，且接受(右圖)或不接受(左圖)fe3-δo4納米粒子治療的小鼠；照片是以物鏡20倍或40倍的放大倍率拍攝；

圖7e是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.1所繪示的柱狀圖，其是關(guān)于特定發(fā)炎基因的rna相對(duì)表現(xiàn)量，其中該些rna是分別取自經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌孢子感染，且接受(黑色柱狀)或不接受(白色柱狀)fe3-δo4納米粒子治療的小鼠的結(jié)腸；以及

圖8是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例3.2所繪示的盲腸的發(fā)炎狀態(tài)，該些盲腸是分別取自經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌感染，且分別以每公斤體重0、2或4毫克的fe3-δo4納米粒子治療的小鼠，并利用活體影像系統(tǒng)(上圖)偵測后，以柱狀圖分析表示(下圖)。

根據(jù)慣常的作業(yè)方式，圖中各種特征與組件并未依比例繪制，其繪制方式是為了以最佳的方式呈現(xiàn)與本發(fā)明相關(guān)的具體特征與組件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的組件符號(hào)來表示相似的組件/部件。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明內(nèi)容的敘述更加詳盡與完備，下文針對(duì)了本發(fā)明的實(shí)施方式與具體實(shí)施例提出了說明性的描述；但這并非實(shí)施或運(yùn)用本發(fā)明具體實(shí)施例的唯一形式。實(shí)施方式中涵蓋了多個(gè)具體實(shí)施例的特征以及用以建構(gòu)與操作這些具體實(shí)施例的方法步驟與其順序。然而，也可利用其他具體實(shí)施例來達(dá)成相同或均等的功能與步驟順序。

雖然用以界定本發(fā)明較廣范圍的數(shù)值范圍與參數(shù)界是約略的數(shù)值，此處已盡可能精確地呈現(xiàn)具體實(shí)施例中的相關(guān)數(shù)值。然而，任何數(shù)值本質(zhì)上不可避免地含有因個(gè)別測試方法所致的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在此處，「約」通常是指實(shí)際數(shù)值在一特定數(shù)值或范圍的正負(fù)10％、5％、1％或0.5％之內(nèi)。或者是，「約」一詞代表實(shí)際數(shù)值落在平均值的可接受標(biāo)準(zhǔn)誤差之內(nèi)，視本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者的考慮而定。除了實(shí)驗(yàn)例之外，或除非另有明確的說明，當(dāng)可理解此處所用的所有范圍、數(shù)量、數(shù)值與百分比(例如用以描述材料用量、時(shí)間長短、溫度、操作條件、數(shù)量比例及其他相似者)均經(jīng)過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請(qǐng)專利范圍所發(fā)明的數(shù)值參數(shù)皆為約略的數(shù)值，且可視需求而更動(dòng)。至少應(yīng)將這些數(shù)值參數(shù)理解為所指出的有效位數(shù)與套用一般進(jìn)位法所得到的數(shù)值。在此處，將數(shù)值范圍表示成由一端點(diǎn)至另一段點(diǎn)或介于二端點(diǎn)之間；除非另有說明，此處所述的數(shù)值范圍皆包含端點(diǎn)。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學(xué)與技術(shù)詞匯的含義與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文沖突的情形下，本說明書所用的單數(shù)名詞涵蓋該名詞的復(fù)數(shù)型；而所用的復(fù)數(shù)名詞時(shí)也涵蓋該名詞的單數(shù)型。

在本說明書中，「非化學(xué)計(jì)量」(nonstoichiometric)一詞是用以闡述一具有元素組成的化學(xué)化合物，其中該元素組成無法以明確定義的自然數(shù)比例來表示，因此違反定比定律。也即，一非化學(xué)計(jì)量化合物在重量上不包含完全相同比例的元素。

「治療」(treating)一詞包含部份或完全預(yù)防、改善、減輕及/或處理難辨梭狀芽孢桿菌感染的相關(guān)病征(symptom)、次要病征(secondarydisorder)或癥狀(condition)?！钢委煛?treating)一詞于本說明書中也指應(yīng)用或投予本發(fā)明內(nèi)容的fe3-δo4納米粒子及/或其醫(yī)藥組合物至一個(gè)體，其是患有難辨梭狀芽孢桿菌感染的相關(guān)病征、次要病征或癥狀，以達(dá)到部份或完全減輕、減緩、治愈疾病、延遲發(fā)病、抑制病程發(fā)展、降低疾病嚴(yán)重性，及/或降低一或多個(gè)癌癥的相關(guān)病征、癥狀、或次要病征的發(fā)生。難辨梭狀芽孢桿菌感染的相關(guān)病征、次要病征及/或癥狀包含，但不局限于，腹瀉、腹痛、發(fā)燒、糞便味道異常、偽膜性腸炎及死亡。在此「治療」(treating)也可以是施用至患有早期該些病征或癥狀的個(gè)體，以降低該個(gè)體發(fā)展成為難辨梭狀芽孢桿菌感染的相關(guān)病征、次要病征及/或癥狀的風(fēng)險(xiǎn)。在此「治療」(treating)為可以有效地減少一個(gè)或多個(gè)病征或臨床標(biāo)記。換句話說，在此治療也可以是降低、減緩或終止疾病病程、病征或癥狀的發(fā)展。

「有效量」(effectiveamount)在此處是指一藥物的用量足以產(chǎn)生所欲的療效反應(yīng)。具體的有效量取決于多種因素，如欲治療的特定狀況、患者的生理?xiàng)l件(如患者體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳動(dòng)物或動(dòng)物的類型、治療持續(xù)時(shí)間、目前療法(如果有的話)的本質(zhì)以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。有效量也指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。舉例來說，可將有效量表示成藥物的總重量(譬如以克(g)、毫克(mg)或微克(μg)為單位)，或表示成藥物重量與體重的比例(其單位為毫克/公斤(mg/kg))。也或是，有效量可以醫(yī)藥組合物中活性成份的濃度來表示，例如莫耳濃度(molarconcentration)、重量濃度(massconcentration)、體積濃度(volumeconcentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(molefraction)、重量分率(massfraction)及混合比例(mixingratio)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可依據(jù)動(dòng)物模式的劑量來計(jì)算藥物(如本發(fā)明內(nèi)容的納米粒子)的人體等效劑量(humanequivalentdose,hed)。舉例來說，習(xí)知技藝者可依據(jù)美國食品藥物管理局(usfoodanddrugadministration,fda)所公告的「估算成人健康志愿者在初始臨床治療測式的最大安全起始劑量」(estimatingthemaximumsafestartingdoseininitialclinicaltrialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers)來估算人體使用的最高安全劑量。

「個(gè)體」(subject)一詞是指包含人類的動(dòng)物，其是依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容的方法，能接受本發(fā)明內(nèi)容的納米粒子的治療。除非特定指出，否則「個(gè)體」(subject)一詞同時(shí)意指男性及女性，且可以是任何年齡，例如兒童或成人。

本發(fā)明是關(guān)于fe3-δo4納米粒子于抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的新穎用途，其中δ為一介于0到0.3之間的數(shù)值。據(jù)此，fe3-δo4納米粒子可用以治療難辨梭狀芽孢桿菌感染。

本發(fā)明內(nèi)容的一實(shí)施例是關(guān)于一種活體外抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的方法。該方法包含將難辨梭狀芽孢桿菌的孢子與一有效量的fe3-δo4納米粒子共同培養(yǎng)，其中δ為一介于0到0.3之間的數(shù)值，以此抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽。相較于fe3o4(即磁鐵礦，magnetite)或γ-fe2o3(即磁赤鐵礦，maghemite)，本發(fā)明內(nèi)容的fe3-δo4為一部份氧化且非化學(xué)計(jì)量的納米粒子，其δ為一介于0到0.3之間的非正數(shù)數(shù)值。

可利用任何習(xí)知技藝人士所熟知的方法來制備本發(fā)明fe3-δo4。舉例來說，可以利用本發(fā)明內(nèi)容實(shí)施例所述的方法來進(jìn)行制備。一般來說，該方法包含：

(1)將乙酰丙酮鐵(ironacetylacetonate)溶于油酸(oleicacid)及三辛胺(trioctylamine)中，以形成一混合溶液；

(2)于惰性環(huán)境(例如真空或包含氮?dú)饣驓鍤獾沫h(huán)境)中，分餾步驟(1)的混合液約30分鐘；

(3)以磁鐵收集步驟(2)的沉淀物；

(4)以甲苯(toluene)洗滌步驟(3)所收集的沉淀物；

(5)以磁鐵收集步驟(4)所洗滌的沉淀物；

(6)將步驟(5)收集的沉淀物加至包含聚苯乙烯順丁烯二酸(poly(styrene-alt-maleicacid))的氯仿溶液中，以形成fe3-δo4納米粒子；以及

(7)以磁鐵收集步驟(6)中的fe3-δo4納米粒子。

依據(jù)上述方法所制得的fe3-δo4納米粒子為一截角八面體(truncatedoctahedronnanoparticle)粒子，其中截角八面體的各邊長度約為5到25納米。舉例來說，該截角八面體的各邊長度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25納米。在一實(shí)施方式中，fe3-δo4納米粒子的邊長約為14納米。在另一實(shí)施方式中，fe3-δo4納米粒子的邊長約為22納米。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，不論邊長為14納米或22納米，二種fe3-δo4納米粒子皆可有效抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽。在一實(shí)施例中，該難辨梭狀芽孢桿菌孢子是源自ccug37780菌株。在另一實(shí)施例中，該難辨梭狀芽孢桿菌孢子是源自ccug19126菌株。在再另一實(shí)施例中，該難辨梭狀芽孢桿菌孢子是源自atccbaa-1805菌株。

依據(jù)其他實(shí)施方式，本發(fā)明內(nèi)容的fe3-δo4納米粒子具有殺孢子活性，而不會(huì)干擾正常菌落中營養(yǎng)細(xì)胞的生長。

在本發(fā)明內(nèi)容的實(shí)施方式中，相較于氧化鋅納米粒子、銀納米粒子、fe2o3納米粒子、fe3o4納米粒子及fe@au納米粒子，fe3-δo4納米粒子更可有效地抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容一實(shí)施方式，fe3-δo4納米粒子可直接結(jié)合至難辨梭狀芽孢桿菌的孢子表面，以此破壞孢子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，造成孢子內(nèi)蛋白的釋出。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，為抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽，需投予每毫升至少5微克的納米粒子至標(biāo)的位置；較佳的情況是，約投予每毫升5到500微克的納米粒子。在一實(shí)施例中，納米粒子的有效量為每毫升50微克；在另一實(shí)施例中，納米粒子的有效量為每毫升500微克。

本發(fā)明內(nèi)容的另一實(shí)施例是關(guān)于一種用以治療一罹患或疑以患有難辨梭狀芽孢桿菌感染的個(gè)體的方法。該方法包含投予該個(gè)體一治療有效量的fe3-δo4納米粒子，以減緩難辨梭狀芽孢桿菌感染的相關(guān)癥狀；其中該fe3-δo4納米粒子為一部份氧化的納米粒子，且δ為一介于0到0.3之間的非整數(shù)數(shù)值。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，fe3-δo4納米粒子的治療功效并不局限于由特定難辨梭狀芽孢桿菌菌株(例如ccug37780、ccug19126或baa-1805菌株)的孢子所引起的感染，而是可治療由任何難辨梭狀芽孢桿菌菌秼的孢子所引發(fā)的感染。

適用于投予至個(gè)體的fe3-δo4納米粒子為一邊長為5到25納米的截角八面體粒子；舉例來說，該邊長可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25納米。在本發(fā)明內(nèi)容一實(shí)施方式中，fe3-δo4納米粒子的邊長約為14納米；在另一實(shí)施方式中，fe3-δo4納米粒子的邊長約為22納米。

依據(jù)本發(fā)明內(nèi)容某些實(shí)施方式，可利用口服、鼻腔或非口服等方式將fe3-δo4納米粒子投予至個(gè)體；投予的劑量約為每公斤體重0.4到4毫克；也即，投予的劑量可以是每公斤體重0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1,2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0毫克。較佳的情況是，投予的劑量約為每公斤2到4毫克。

可于難辨梭狀芽孢桿菌感染時(shí)及/或感染后投予本發(fā)明內(nèi)容fe3-δo4納米粒子。在一實(shí)施方式中，是于難辨梭狀芽孢桿菌感染時(shí)投予本發(fā)明fe3-δo4納米粒子；在該情況下，投予每公斤2毫克的fe3-δo4納米粒子即足以減緩由難辨梭狀芽孢桿菌感染所引發(fā)的癥狀。在另一實(shí)施方式中，是于難辨梭狀芽孢桿菌感染后投予本發(fā)明fe3-δo4納米粒子；在該實(shí)施方式中，不論是投予每公斤2毫克或每公斤4毫克的fe3-δo4納米粒子皆可有效治療難辨梭狀芽孢桿菌感染。

在某些實(shí)施方式中，是利用非口服的方式將fe3-δo4納米粒子投予至個(gè)體，其中非口服的方式包含，但不限于，肌肉注射、靜脈注射、皮下注射及腹腔注射。在其他實(shí)施方式中，則是利用口服方式來投予fe3-δo4納米粒子。

本發(fā)明內(nèi)容提供了一種用以解決難辨梭狀芽孢桿菌感染及相關(guān)臨床醫(yī)療問題的方法。下文提出多個(gè)實(shí)驗(yàn)例將用以闡述fe3-δo4納米粒子于抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽及/或治療難辨梭狀芽孢桿菌感染的用途。在本發(fā)明內(nèi)容較佳的實(shí)施方式中，fe3-δo4納米粒子可用以減緩難辨梭狀芽孢桿菌孢子所引發(fā)的結(jié)腸炎。該些實(shí)驗(yàn)例僅為說明本發(fā)明的某些實(shí)施方式，以利本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者實(shí)作本發(fā)明，且不應(yīng)將這些實(shí)驗(yàn)例視為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。據(jù)信習(xí)知技藝者在閱讀了此處提出的說明后，可在不需過度解讀的情形下，完整利用并實(shí)踐本發(fā)明。此處所引用的所有公開文獻(xiàn)，其全文皆視為本說明書的一部分。

實(shí)施例

材料及方法

培養(yǎng)細(xì)菌及純化孢子

由歌德堡大學(xué)的菌種保存中心(瑞典)購買難辨梭狀芽孢桿菌ccug37780及ccug19126，由美國菌種保存中心(manassas,va)購買atccbaa1805。所有菌種皆是培養(yǎng)于包含0.5％酵母萃(yeastextract,212750,bddifco)及0.1％l-半胱胺酸(7048046,amresco,solon,ho)的補(bǔ)充腦心浸液(supplementedbrainheartinfusionmedium,bhis；237500,bddifco,franklinlakes,nj)中，并培養(yǎng)于37℃厭氧環(huán)境下。依據(jù)先前研究方法(“bilesaltsandglycineascogerminantsforclostridiumdifficilespores.“jbacteriol2008,190:2505-2512)，并佐以些微的修改來制備及純化孢子。簡單來說，加入新鮮bhis培養(yǎng)液來稀釋培養(yǎng)于bhis培養(yǎng)液中的難辨梭狀芽孢桿菌，至到其光學(xué)密度600納米(opticdensity600nm,od600)的數(shù)值達(dá)0.2。將900微升的稀釋細(xì)胞懸浮液加至包含bhis洋菜膠的6孔盤中，并將其培養(yǎng)于37℃的厭氧罐(o-hp011a,thermooxoid,oxoidltd.,basingstoke,英國)中4天。以1毫升的冰無菌水收集6孔盤中的細(xì)胞，而后置于4℃至隔日。以冰無菌水洗滌5次后，加入3毫升的冰無菌水。于一離心管中加入10毫升的50％(重量/體積)蔗糖溶液(409704,j.t.bakerchemicalco.,phillipsburg,pa)后，將懸浮液加至該蔗糖溶液的上方，以3,500g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，將孢子與營養(yǎng)細(xì)胞分離。以冰無菌水洗滌位于離心管底部的純化孢子5次，以此移除蔗糖。將純化的孢子置于4℃保存，以供后續(xù)分析使用。

孢子發(fā)芽

本發(fā)明是利用2至10mm的牛膽酸鹽來檢測難辨梭狀芽孢桿菌ccug37780的孢子發(fā)芽反應(yīng)。相較于其他種菌株，ccug37780由于缺乏tcda及tcdb基因，往往被視為較為安全的菌株。本發(fā)明即是利用ccug37780菌株來測試納米粒子于抑制孢子發(fā)芽的活性。相較于其他濃度，以10mm的牛膽酸鹽處理后的難辨梭狀芽孢桿菌孢子可觀察到最為顯著的發(fā)芽曲線(p<0.0001,杜克多重比較試驗(yàn)(tukey’smultiplecomparisontest))。因此，后續(xù)的分析即以10mm的牛膽酸鹽來預(yù)處理難辨梭狀芽孢桿菌孢子。

制備納米粒子

本發(fā)明是利用熱分解(thermaldecomposition)來制備fe3-δo4納米粒子。簡單來說，將1.42克的乙酰丙酮鐵(ironacetylacetonate,517003,sigma-aldrich,st.louis,mo)、0.57毫升的油酸(oleicacid,27726,sigma-aldrich)及20毫升的三辛胺(trioctylamine,t81000,sigma-aldrich)均勻混合。在含氬的環(huán)境中，以325℃分餾溶液30分鐘。將溶液冷卻至室溫后，以磁鐵收集沉淀物，并以甲苯洗滌3次。以磁鐵收集fe3-δo4納米粒子后，將其轉(zhuǎn)置于包含每毫升0.4毫克的聚苯乙烯順丁烯二酸(662631,sigma-aldrich)的氯仿溶液(un1888,merck,whitehousestation,nj)中作用2小時(shí)。收集fe3-δo4納米粒子，并以純水洗滌3次。

以下述方法來制備fe@au納米粒子。將包含6克溴化十六烷基三甲銨(cetyltrimethylammoniumbromide,ctab,h6269,sigma-aldrich)的2.4毫升feso4(0.5m,31236,riedel-deseelze,德國)、5克1-丁醇(1-butanol,33065,sigma-aldrich)、15克辛烷(octane,296988,sigma-aldrich)及2.4毫升的1.0mnabh4(71320,sigma-aldrich)均勻混合于純水中，作用5分鐘以形成鐵納米粒子溶液。將1.8毫升的0.44mhaucl4(16961-25-4,alfaaesar,wardhill,ma)及1.8毫升的1.6mnabh4加至鐵納米粒子溶液中，持續(xù)攪拌30分鐘。以99.9％乙醇(800605,j.t.bakerchemicalco.)及磁鐵洗滌該fe@au納米粒子。

利用化學(xué)浴沉淀系統(tǒng)(chemicalbathdepositionsystem)來制備氧化鋅納米粒子。將0.1m的六水合硝酸鋅(zincnitratehexahydrate,263-00335,wako,osaka,日本)、0.1m的六亞甲四胺(hexamethylenetetramine,081-00332,wako)與si(100)受質(zhì)(waferworkscorporation,臺(tái)灣)于95℃作用8小時(shí)。之后，以無菌水洗滌氧化鋅納米粒子5次。

依據(jù)下述方法制備銀納米粒子。簡單來說，將3.4mm的硝酸銀(s6506,sigma-aldrich)及0.46mm的檸檬酸鈉(sodiumcitratetribasicdihydrate,s4641,sigma-aldrich)于室溫持續(xù)攪拌以均勻混合。將8.8mm的硼氫化鈉(sodiumborohydride)加至混合液中，并于室溫持續(xù)攪拌10分鐘。之后將合成的銀納米粒子保存于99.9％乙醇中。

由臺(tái)灣圓點(diǎn)納米技術(shù)(taiwanadvancednanotech,uspio-101)購買6納米的fe3o4納米粒子。

以光學(xué)密度600納米來測量孢子發(fā)芽

在進(jìn)行相關(guān)測試前，先將孢子懸浮液置于60℃的環(huán)境中30分鐘，以去除營養(yǎng)細(xì)胞。將該些熱處理后的孢子置于冰上。將包含孢子的懸浮液調(diào)至od600為0.5的濃度后，與不同及/或不同濃度(每毫升5到500微克)的納米粒子共同培養(yǎng)于含有bhis的96孔盤中20分鐘。在本實(shí)驗(yàn)中，是以3％漂白劑(197-02206,wako)處理孢子作為正對(duì)照組，而以培養(yǎng)于bhis的孢子作為負(fù)對(duì)照組。經(jīng)共同培養(yǎng)后，加入10mm的牛膽酸鹽(t4009,sigma)，引發(fā)孢子發(fā)芽。于室溫下，利用分光亮度計(jì)(16039400,tecan,austria)來觀測孢子的od600讀值，每分鐘觀察1次，持續(xù)觀察12分鐘。依據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)所觀察到的od讀值來繪示孢子發(fā)芽的動(dòng)力曲線圖。

發(fā)芽動(dòng)力試驗(yàn)

將純化且經(jīng)熱處理后的孢子在有或無fe3-δo4(每毫升50微克)處理的情況下，培養(yǎng)于包含bhis的96孔盤中20分鐘；之后，分別以2、5、10、20、40或50mm牛膽酸鹽進(jìn)行處理。在本實(shí)驗(yàn)中，是以3％漂白劑作為抑制發(fā)芽的正對(duì)照組。加入牛膽酸鹽后立即檢測od600的讀值。

孢子結(jié)合試驗(yàn)

將od600讀值為0.5的難辨梭狀芽孢桿菌baa1805孢子與fe3-δo4納米粒子(每毫升500微克)共同培養(yǎng)于包含bhis的96孔盤中20分鐘。無添加fe3-δo4納米粒子的孢子是作為本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。利用磁鐵與各檢體作用5分鐘，以移除各檢體的上清液。以1倍生理食鹽水分別洗滌會(huì)與磁鐵作用的檢體及其上清液，各3次。將檢體溶于無菌的去離子水中。利用穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,tem,jem-1400,jeol,日本)來觀察孢子及納米粒子。

蛋白滲漏試驗(yàn)(proteinleakageassay)

將od600讀值為0.5的孢子與fe3-δo4納米粒子(每毫升500微克)共同培養(yǎng)于包含無菌水的96孔盤中20分鐘。以3,500g的轉(zhuǎn)速離心檢體10分鐘。移除上清液后，回溶沉淀物并進(jìn)行音波振蕩處理。利用離心(8000g,4℃,10分鐘)的方式收集細(xì)菌的溶解產(chǎn)物，以此測量孢子內(nèi)的蛋白含量。之后，以15％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染套組(17-1150-01,amershambiosciences,sppsala,瑞士)分析各細(xì)菌孢子的蛋白含量。

活體內(nèi)難辨梭狀芽孢桿菌感染

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是飼養(yǎng)于無菌空間，所有試驗(yàn)皆是在成功大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)許可下進(jìn)行。各小鼠在試驗(yàn)起啟階段的體重約為25克。

為直接檢測結(jié)腸的發(fā)炎反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)是利用nf-κb-相關(guān)報(bào)導(dǎo)小鼠來進(jìn)行，其中該小鼠包含利用nf-κb來調(diào)控轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)的熒光素酶(luciferase)轉(zhuǎn)殖基因(nf-κb-re-熒光素酶)；并以難辨梭狀芽孢桿菌孢子來進(jìn)行感染。在喂食孢子前，先將抗生素混合液(每毫升0.4毫克的康霉素(kanamycin)、每毫升0.035毫克的建它霉素(gentamicin)及每毫升0.057毫克的柯利霉素(colistin))加至小鼠飲用水中48小時(shí)；之后每24小時(shí)置換一次新鮮抗生素混合液，共置換2次。每12小時(shí)灌食小鼠200微升的質(zhì)子泵抑制劑(protonpumpinhibitor,ppi,每毫升2毫克)一次，共進(jìn)行2天；之后，感染難辨梭狀芽孢桿菌孢子。

分別以ccug19126及baa-1805二種難辨梭狀芽孢桿菌孢子來感染小鼠。在感染ccug19126的組別中，是分別將2x10⁵菌落形成單位(colonyformingunit,cfu)的難辨梭狀芽孢桿菌孢子ccug19126與包含或不包含每毫升500微克的fe3-δo4的100微升無菌水共同培養(yǎng)20分鐘；之后喂食小鼠(約每公斤體重2毫克)。在孢子與fe3-δo4納米粒子共同培養(yǎng)的同時(shí)，先灌食小鼠50微升的質(zhì)子泵抑制劑(每毫升2毫克)，并以腹腔注射的方式注入氯林絲菌素(clindamycin,每公斤4毫克)。在感染難辨梭狀芽孢桿菌孢子后，將包含抗生素混合液的飲用水置換為一般飲用水。

在感染baa-1805的組別中，先灌食小鼠50微升的質(zhì)子泵抑制劑(每毫升2毫克)，并以腹腔注射的方式注入氯林絲菌素(每公斤4毫克)；之后，喂食小鼠難辨梭狀芽孢桿菌孢子baa-1805(2x10⁵cfu)。24小時(shí)后，分別投予各小鼠100微升的每毫升0、500及1000微克的fe3-δo4納米粒子(每公斤體重約為0、2及4毫克)；每24小時(shí)投予一次，共2天。

通過觀察小鼠的腹瀉、體重變化、駝背姿勢及死亡來量測難辨梭狀芽孢桿菌感染后的病癥。感染72小時(shí)后，以腹腔注射方式注入每公斤150毫克的熒光素酶受質(zhì)－熒光素(luciferin,xenogen,perkinelmer,waltham,ma)，以此引發(fā)nf-κb活化所導(dǎo)致的發(fā)光表現(xiàn)。利用異氟醚(isoflurane)/氧氣麻醉小鼠后，以活體影像系統(tǒng)(invivoimagingsystems,ivis,xenogen)進(jìn)行觀察。通過活體影像軟件(software,xenogen)來分析結(jié)果，熒光素酶活體是以質(zhì)子/秒/平方公分/立體弧度(p/s/cm²/sr)來表示。得到ivis影像后，以tri試劑(t9424,sigma)來萃取結(jié)腸rna。再利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(real-timepcr,steponeplus,appliedbiosystems)來分析發(fā)炎基因的表現(xiàn)量。為評(píng)估難辨梭狀芽孢桿菌感染率，收集糞便，通過dna萃取套組(11814770001,roche)純化其中dna。利用pcr來偵測小鼠糞便中的tcdb基因。

組織病理分析

利用組織病理分析來評(píng)估經(jīng)難辨梭狀芽孢桿菌感染后，黏膜的損傷情況及發(fā)炎反應(yīng)。以4％甲醛(以生食鹽水稀釋)固定結(jié)腸組織后，再將其包埋于石蠟中。制作厚度為6微米的檢體切片，將其去石蠟后，以蘇木精(hematoxylin)及伊紅(eosin)進(jìn)行染色，再利用顯微鏡進(jìn)行組織病理分析。孢子組及經(jīng)fe3-δo4處理的孢子組皆是隨機(jī)選取10個(gè)視野來計(jì)數(shù)視野中的嗜中性球數(shù)量。

統(tǒng)計(jì)分析

利用graphpadprism5.01版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究所有的實(shí)驗(yàn)皆是三重復(fù)，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±standarderrorofthemean(sem))來表示。在孢子發(fā)芽曲線分析中，是利用單向anova(one-wayanova)及杜克多重比較試驗(yàn)(tukey’smultiplecomparisontest)來計(jì)算；在其他感染抑制的試驗(yàn)中，則是利用student’st-test來分析。二種統(tǒng)計(jì)方法皆是以p<0.05、0.01或0.001來表示顯著性。

實(shí)施例1fe3-δo4納米粒子的殺孢子活性

本實(shí)施例將評(píng)估fe3-δo4納米粒子于抑制難辨梭狀芽孢桿菌的孢子發(fā)芽的功效。

1.1fe3-δo4納米粒子對(duì)于難辨梭狀芽孢桿菌孢子的毒殺活性

已知不同的納米粒子具有殺菌特性，而不會(huì)對(duì)周遭組織造成傷害。然而，納米粒子與細(xì)菌孢子發(fā)芽間的關(guān)聯(lián)性仍尚待研究厘清。為了解孢子發(fā)芽與殺菌納米粒子間的作用，本研究將分別測試氧化鋅納米粒子、銀納米粒子、fe2o3納米粒子、fe3o4納米粒子、fe@au納米粒子及fe3-δo4納米粒子的毒殺功效。以漂白劑處理孢子20分鐘以去除其活性是為本實(shí)驗(yàn)的正對(duì)照組。將細(xì)菌孢子與每毫升5、50或500微克的納米粒子共同培養(yǎng)20分鐘后，加入10mm牛膽酸鹽引發(fā)孢子發(fā)芽。

圖1的結(jié)果指出，包含氧化鋅(第1a圖)、銀(圖1b)及fe3o4(第1d圖)等已知具有殺菌功效的納米粒子，僅能產(chǎn)生些微的抑制孢子發(fā)芽功效。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，難辨梭狀芽孢桿菌ccug37780不會(huì)對(duì)完全氧化的fe2o3納米粒子(第1c圖)及fe@au納米粒子(第1e圖)產(chǎn)生反應(yīng)。雖然每毫升5微克的fe3-δo4納米粒子也僅產(chǎn)生微量的抑制功效，然而，每毫升50及500微克的fe3-δo4納米粒子可明顯觀察到抑制孢子發(fā)芽的功效(第1f圖)。特別是每毫升500微克的fe3-δo4納米粒子，其所產(chǎn)生的抑制功效與漂白劑正對(duì)組組所產(chǎn)生的抑制效果在統(tǒng)計(jì)上并無顯著的差異(p>0.5，杜克多重比較試驗(yàn)，第1f圖)。

該些結(jié)果指出，相較于已知的殺菌納米粒子，本發(fā)明內(nèi)容的fe3-δo4納米粒子具有優(yōu)越的殺孢子活性；不論是每毫升50或500微克的fe3-δo4納米粒子皆可有效抑制孢子形成具有活性的營養(yǎng)細(xì)胞。

1.2不同大小的fe3-δo4納米粒子的殺孢子活性

有鑒于fe3-δo4納米粒子可合成為具有不同邊長(由5到25納米)的截角八面體粒子，本實(shí)施例將進(jìn)一步了解不同大小的fe3-δo4納米粒子在抑制孢子發(fā)芽時(shí)所產(chǎn)生的功效。據(jù)此，利用二種fe3-δo4納米粒子(邊長分別為14及22納米)來治療ccug37780孢子的感染。圖2的結(jié)果顯示，二種納米粒子于抑制孢子發(fā)芽的活性并不具有顯著的差異(每毫升500微克濃度的差異為p＝0.5195，每毫升50微克濃度的差異則為p>0.99，利用杜克多重比較試驗(yàn)來分析統(tǒng)計(jì))。因此，相較于納米粒子的大小，fe3-δo4納米粒子的濃度在抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子發(fā)芽時(shí)扮演著更為關(guān)鍵的角色。

1.3fe3-δo4納米粒子于抑制不同菌株的難辨梭狀芽孢桿菌孢子時(shí)所產(chǎn)生的殺孢子活性

本實(shí)施例將檢測fe3-δo4納米粒子對(duì)于具有tcda及tcdb基因的難辨梭狀芽孢桿菌(即ccug19126及atccbaa-1805)所產(chǎn)生的抑制活性。據(jù)此，分別將ccug19126及atccbaa-1805與不同濃度(即每毫升5、50及500微克)的fe3-δo4納米粒子共同培養(yǎng)20分鐘后，以10mm牛膽酸鹽進(jìn)行處理。結(jié)果繪示于圖3。

如圖3所示，每毫升500微克的fe3-δo4納米粒子對(duì)于ccug19126(第3a圖)及atccbaa-1805(第3b圖)具有相似的抑制功效；而ccug19126則會(huì)對(duì)每毫升50微克以下的fe3-δo4納米粒子具有抗性(圖3a)。

該些結(jié)果顯示，fe3-δo4納米粒子對(duì)于孢子發(fā)芽的抑制活性并不局限于特定的難辨梭狀芽孢桿菌菌株。換言的，fe3-δo4納米粒子可有效抑制不同的難辨梭狀芽孢桿菌菌株。

1.4fe3-δo4納米粒子對(duì)難辨梭狀芽孢桿菌的營養(yǎng)細(xì)胞的殺菌活性

除了抑制孢子發(fā)芽的功效，本實(shí)施例將進(jìn)一步利用不同的難辨梭狀芽孢桿菌菌株，來了解fe3-δo4納米粒子對(duì)營養(yǎng)細(xì)胞的殺菌活性。以每毫升500微克的fe3-δo4納米粒子處理營養(yǎng)細(xì)胞20分鐘后，將其涂布于bhis洋菜膠盤，并進(jìn)行后續(xù)的菌落形成單位分析。如第4圖所示，以fe3-δo4納米粒子處理后的細(xì)胞與負(fù)對(duì)照組細(xì)胞具有相似的生長量；相較的下，以3％漂白劑處理后的細(xì)胞則幾乎完全死亡。

總結(jié)上述，本發(fā)明內(nèi)容fe3-δo4納米粒子可有效抑制包含ccug37780、ccug19126及atccbaa-1805等各種難辨梭狀芽孢桿菌菌株的孢子，而不會(huì)影響其營養(yǎng)細(xì)胞的生長。

實(shí)施例2fe3-δo4納米粒子對(duì)難辨梭狀芽孢桿菌孢子的抑制機(jī)制

為了解fe3-δo4納米粒子與孢子間的作用，本實(shí)施例利用穿透式電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscopy,tem)來檢測經(jīng)fe3-δo4納米粒子處理后的孢子。結(jié)果顯示，每毫升50微克的fe3-δo4納米粒子即會(huì)與孢子結(jié)合。隨著濃度的增加(如每毫升500微克的fe3-δo4納米粒子)，過量的fe3-δo4納米粒子會(huì)完全覆蓋孢子表面(第5圖)。也即，fe3-δo4納米粒子與難辨梭狀芽孢桿菌孢子的結(jié)合量是與納米粒子的濃度呈正相關(guān)。

為進(jìn)一步了解fe3-δo4納米粒子的結(jié)合是否會(huì)對(duì)孢子產(chǎn)生損害，進(jìn)而破壞孢子的結(jié)構(gòu)，利用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳來分析經(jīng)fe3-δo4納米粒子處理或未經(jīng)fe3-δo4納米粒子處理的孢子，其滲漏蛋白的量。圖6繪示出該結(jié)果。

相較于未經(jīng)處理的孢子，以fe3-δo4納米粒子處理的孢子可明顯觀察到二蛋白帶(第6圖，第1到3蛋白條與第4到6蛋白條)。該結(jié)果指出，一旦fe3-δo4納米粒子結(jié)合至孢子，會(huì)造成孢子結(jié)構(gòu)的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白滲漏至上清液。

整體來看，該些結(jié)果指出本發(fā)明內(nèi)容的fe3-δo4納米粒子可直接結(jié)合至難辨梭狀芽孢桿菌孢子，并損傷其結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例3fe3-δo4納米粒子于治療難辨梭狀芽孢桿菌感染的用途

在本實(shí)施例中，將依據(jù)「材料及方法」所述的步驟，利用nf-κb-相關(guān)報(bào)導(dǎo)小鼠來檢測fe3-δo4納米粒子于治療活體感染難辨梭狀芽孢桿菌的療效。在實(shí)施例3.1中，是以難辨梭狀芽孢桿菌孢子ccug19126感染小鼠，圖7繪示該治療功效。實(shí)施例3.1則是以難辨梭狀芽孢桿菌孢子baa-1805感染小鼠，圖8繪示相關(guān)結(jié)果。

3.1感染ccug19126

如圖7a所示，感染難辨梭狀芽孢桿菌后的小鼠體重會(huì)顯著下降，以fe3-δo4納米粒子治療(每公斤體重2毫克)則可有效減緩體重的減少(p＝0.0119,student’st-test)。此外，還檢測小鼠盲腸的重量來確認(rèn)觀察到的治療功效；結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，經(jīng)fe3-δo4納米粒子治療的小鼠的盲腸會(huì)較重且較為健康(p＝0.0024,student’st-test,第7b圖)，并呈現(xiàn)較輕微的發(fā)炎反應(yīng)(p＝0.0406,student’st-test,第7c圖)。組織病理照片則指出，相較于照組，經(jīng)fe3-δo4納米粒子治療的小鼠，其結(jié)腸組織中嗜中性球浸潤的數(shù)量會(huì)明顯減少(圖7d)。另外，在基因表現(xiàn)上，實(shí)時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)的分析結(jié)果顯示，經(jīng)fe3-δo4納米粒子治療后，小鼠結(jié)腸內(nèi)包含腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)、干擾素-γ(interferon-γ,ifn-γ)及介白素-1β(interleukin-1β,il-1β)等發(fā)炎基因的表現(xiàn)皆會(huì)顯著地低于對(duì)照組小鼠結(jié)腸內(nèi)的基因表現(xiàn)(tnf-α的p＝0.0088，ifn-γ的p＝0.0276，而il-1β的p＝0.0097，student’st-test，以上皆是與未經(jīng)處理的孢子組進(jìn)行比較分析，圖7e)。相對(duì)于對(duì)照組，fe3-δo4納米粒子治療可減少難辨梭狀芽孢桿菌的感染率(對(duì)照組為66％，治療組為33％)(結(jié)果未顯示)。

該些結(jié)果證明每公斤2毫克的fe3-δo4可有效減緩由難辨梭狀芽孢桿菌孢子ccug19126所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)。

3.2感染baa-1805

本實(shí)施例將檢測fe3-δo4納米粒子對(duì)另一種難辨梭狀芽孢桿菌孢子－baa-1805的治療功效。為更進(jìn)一步模擬臨床狀況，先以孢子baa-1805感染小鼠24小時(shí)后，再以每公斤0、2或4毫克的fe3-δo4納米粒子進(jìn)行治療。

依據(jù)圖8的結(jié)果，對(duì)照組小鼠(即未經(jīng)處理的孢子組)結(jié)腸中的發(fā)炎反應(yīng)會(huì)較fe3-δo4納米粒子治療組更為嚴(yán)重(p<0.05)。不論是投予每公斤2或4毫克的fe3-δo4納米粒子皆可有效抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子baa-1805所引發(fā)的發(fā)炎反應(yīng)。

因此，可于難辨梭狀芽孢桿菌感染時(shí)或感染后投予本發(fā)明fe3-δo4納米粒子，且不論投予的時(shí)間點(diǎn)為何，皆可有效抑制由難辨梭狀芽孢桿菌感染所引發(fā)的相關(guān)癥狀。

總結(jié)上述，fe3-δo4納米粒子可抑制難辨梭狀芽孢桿菌的胞子發(fā)芽。相較于其他具有殺菌活性的納米粒子，fe3-δo4納米粒子具有顯著的殺孢子活性。更重要的是，fe3-δo4納米粒子的抑制功效并不局限于特定的難辨梭狀芽孢桿菌菌株，而是可有效抑制各種難辨梭狀芽孢桿菌菌株的孢子的發(fā)芽及/或感染。此外，低劑量(例如活體外的每毫升5微克，及活體內(nèi)的每公斤2毫克)的fe3-δo4納米粒子即足以抑制難辨梭狀芽孢桿菌孢子的發(fā)芽，并治療感染難辨梭狀芽孢桿菌的病患，而不會(huì)影響正常菌落中營養(yǎng)細(xì)胞的生長。

雖然上文實(shí)施方式中揭露了本發(fā)明的具體實(shí)施例，然其并非用以限定本發(fā)明，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者，在不悖離本發(fā)明的原理與精神的情形下，當(dāng)可對(duì)其進(jìn)行各種更改與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以附隨申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。