本申請(qǐng)要求2014年7月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/020,163號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文中。

發(fā)明背景

信使RNA治療(MRT)正在成為治療各種疾病的越來(lái)越重要的方法。MRT涉及將信使RNA(mRNA)施用到需要用于產(chǎn)生由患者體內(nèi)的mRNA編碼的蛋白質(zhì)的治療的患者中。脂質(zhì)納米粒常用于包封mRNA以用于mRNA的有效體內(nèi)遞送。然而，用于產(chǎn)生負(fù)載mRNA的脂質(zhì)納米顆粒的當(dāng)前方法遭受不良的包封效率，低mRNA回收率和/或不均勻的粒度。

發(fā)明概要

本發(fā)明尤其提供了一種用于脂質(zhì)納米顆粒配制和mRNA包封的改良方法。具體地說(shuō)，本發(fā)明基于以下出乎意料的發(fā)現(xiàn)：在混合之前預(yù)加熱mRNA溶液和/或脂質(zhì)溶液產(chǎn)生顯著改善的包封效率、mRNA回收率以及更均勻和更小的粒度(例如，小于100nm)。

因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種將信使RNA(mRNA)包封在脂質(zhì)納米顆粒中的方法，其包括混合mRNA溶液和脂質(zhì)溶液的步驟，其中mRNA溶液和/或脂質(zhì)溶液處于大于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度下。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度為等于或大于約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度介于約25-70℃、約30-70℃、約35-70℃、約40-70℃、約45-70℃、約50-70℃或約60-70℃的范圍內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度為約65℃。

在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液和脂質(zhì)溶液在混合前分別被加熱至預(yù)定溫度。在一些實(shí)施方案中，在混合之前，mRNA溶液被加熱至預(yù)定溫度且脂質(zhì)溶液處于環(huán)境溫度下。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將環(huán)境溫度下的mRNA儲(chǔ)備溶液添加到加熱的緩沖溶液中達(dá)到預(yù)定溫度而將mRNA溶液加熱至預(yù)定溫度。在一些實(shí)施方案中，緩沖溶液具有不大于約4.5(例如，不大于約4.4、4.2、4.0或3.8)的pH。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)無(wú)脈流泵混合mRNA溶液和脂質(zhì)溶液。在一些實(shí)施方案中，合適的泵是齒輪泵。在一些實(shí)施方案中，合適的泵是蠕動(dòng)泵。在一些實(shí)施方案中，合適的泵是離心泵。

在一些實(shí)施方案中，在介于約150-250ml/分鐘、250-500ml/分鐘、500-1000ml/分鐘、1000-2000ml/分鐘、2000-3000ml/分鐘、3000-4000ml/分鐘或4000-5000ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合mRNA溶液。在一些實(shí)施方案中，在約200ml/分鐘、約500ml/分鐘、約1000ml/分鐘、約2000ml/分鐘、約3000ml/分鐘、約4000ml/分鐘或約5000ml/分鐘的流速下混合mRNA溶液。

在一些實(shí)施方案中，在介于約25-75ml/分鐘、約75-200ml/分鐘、約200-350ml/分鐘、約350-500ml/分鐘、約500-650ml/分鐘、約650-850ml/分鐘或約850-1000ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合脂質(zhì)溶液。在一些實(shí)施方案中，在約50ml/分鐘、約100ml/分鐘、約150ml/分鐘、約200ml/分鐘、約250ml/分鐘、約300ml/分鐘、約350ml/分鐘、約400ml/分鐘、約450ml/分鐘、約500ml/分鐘、約550ml/分鐘、約600ml/分鐘、約650ml/分鐘、約700ml/分鐘、約750ml/分鐘、約800ml/分鐘、約850ml/分鐘、約900ml/分鐘、約950ml/分鐘或約1000ml/分鐘的流速下混合脂質(zhì)溶液。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括首先通過(guò)混合檸檬酸鹽緩沖液與mRNA儲(chǔ)備溶液產(chǎn)生mRNA溶液的步驟。在某些實(shí)施方案中，合適的檸檬酸鹽緩沖液包含約10mM檸檬酸鹽、約150mMNaCl、約4.5的pH。在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA儲(chǔ)備溶液含有濃度等于或大于約0.10mg/mL、1mg/ml、約10mg/ml、約50mg/ml或約100mg/ml的mRNA。

在一些實(shí)施方案中，在介于約100-300ml/分鐘、300-600ml/分鐘、600-1200ml/分鐘、1200-2400ml/分鐘、2400-3600ml/分鐘、3600-4800ml/分鐘或4800-6000ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合檸檬酸鹽緩沖液。在一些實(shí)施方案中，在約220ml/分鐘、約600ml/分鐘、約1200ml/分鐘、約2400ml/分鐘、約3600ml/分鐘、約4800ml/分鐘或約6000ml/分鐘的流速下混合檸檬酸鹽緩沖液。

在一些實(shí)施方案中，在介于約10-30ml/分鐘、約30-60ml/分鐘、約60-120ml/分鐘、約120-240ml/分鐘、約240-360ml/分鐘、約360-480ml/分鐘或約480-600ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合mRNA儲(chǔ)備溶液。在一些實(shí)施方案中，在約20ml/分鐘、約40ml/分鐘、約60ml/分鐘、約80ml/分鐘、約100ml/分鐘、約200ml/分鐘、約300ml/分鐘、約400ml/分鐘、約500ml/分鐘或約600ml/分鐘的流速下混合mRNA儲(chǔ)備溶液。

在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)溶液在乙醇中含有一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、一種或多種輔助脂質(zhì)、一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)和PEG脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，將mRNA溶液和脂質(zhì)溶液混合于20％乙醇中，得到脂質(zhì)納米顆粒的懸浮液。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒通過(guò)切向流過(guò)濾進(jìn)一步純化。

在一些實(shí)施方案中，大于約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的純化納米顆粒具有小于約100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的大小。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化納米顆粒具有小于100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的大小。

在一些實(shí)施方案中，大于約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的純化納米顆粒具有介于約40-90nm(例如，約40-85nm、約40-80nm、約40-75nm、約40-70nm、約40-65nm或約40-60nm)的范圍內(nèi)的大小。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化納米顆粒具有介于約40-90nm(例如，約40-85nm、約40-80nm、約40-75nm、約40-70nm、約40-65nm或約40-60nm)的范圍內(nèi)的大小。

在一些實(shí)施方案中，純化的納米顆粒具有大于約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的包封效率。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生大于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mRNA回收率。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種將信使RNA(mRNA)包封在脂質(zhì)納米顆粒中的方法，其包括(a)將mRNA溶液和/或脂質(zhì)溶液分別加熱至大于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度；(b)將加熱的mRNA溶液和/或加熱的脂質(zhì)溶液混合以產(chǎn)生脂質(zhì)納米顆粒的懸浮液；和(c)使脂質(zhì)納米顆粒純化。

在另一方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)本文所述的方法產(chǎn)生的脂質(zhì)納米顆粒的組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含純化脂質(zhì)納米顆粒的組合物，其中大于約90％的純化脂質(zhì)納米顆粒具有小于約100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的單個(gè)粒度且大于約70％的純化脂質(zhì)納米顆粒將mRNA包封在每個(gè)單獨(dú)顆粒內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，大于約95％、96％、97％、98％或99％的純化脂質(zhì)納米顆粒具有小于約100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的單個(gè)粒度。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化脂質(zhì)納米顆粒具有小于約100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的單個(gè)粒度。在一些實(shí)施方案中，大于約75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的純化脂質(zhì)納米顆粒將mRNA包封在每個(gè)單獨(dú)顆粒內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化脂質(zhì)納米顆粒將mRNA包封在每個(gè)單獨(dú)顆粒內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物含有至少約1mg、5mg、10mg、100mg、500mg或1000mg包封的mRNA。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)單獨(dú)的脂質(zhì)納米顆粒包含一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、一種或多種輔助脂質(zhì)、一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)和PEG脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)選自由以下所組成的組：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003及其組合。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)選自DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿)、DPPC(1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿)、DOPE(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿)、DPPE(1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸(1'-外消旋-甘油))。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)是膽固醇或聚乙二醇化膽固醇。在一些實(shí)施方案中，一種或多種經(jīng)PEG修飾的脂質(zhì)包含共價(jià)連接至具有C₆-C₂₀長(zhǎng)度的烷基鏈的脂質(zhì)的長(zhǎng)度最高達(dá)5kDa的聚乙二醇鏈。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于包封含有一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸的mRNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明用于包封未修飾的mRNA。

在下面的詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求中，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，詳細(xì)描述、附圖和權(quán)利要求在指示本發(fā)明的實(shí)施方案時(shí)僅以說(shuō)明而非限制的方式給出。在本發(fā)明的范圍內(nèi)的各種改變和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。

附圖簡(jiǎn)述

附圖僅用于說(shuō)明的目的而不是為了限制。

圖1：示出了利用均質(zhì)流泵進(jìn)行的示例性大規(guī)模脂質(zhì)納米顆粒包封mRNA的配制過(guò)程的示意圖。

圖2：描繪了用于脂質(zhì)納米顆粒的示例性純化和緩沖液交換系統(tǒng)。

圖3：描繪了利用蠕動(dòng)泵進(jìn)行的示例性大規(guī)模脂質(zhì)納米顆粒包封mRNA的配制過(guò)程的示意圖。

圖4：描繪了用于純化和緩沖液交換的替代性的示例性切向流過(guò)濾系統(tǒng)。

圖5：描繪了利用蠕動(dòng)泵進(jìn)行的示例性大規(guī)模脂質(zhì)納米顆粒包封mRNA的配制過(guò)程的替代性示意圖。

定義

為了更容易地理解本發(fā)明，首先在下文中定義某些術(shù)語(yǔ)。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中闡述了以下術(shù)語(yǔ)和其它術(shù)語(yǔ)的附加定義。

大約或約：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“大約”或“約”在應(yīng)用于感興趣的一個(gè)或多個(gè)值時(shí)是指類似于規(guī)定的參考值的值。在某些實(shí)施方案中，除非另有說(shuō)明或另外從上下文中明顯看出，否則術(shù)語(yǔ)“大約”或“約”是指落在規(guī)定參考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范圍內(nèi)的一系列值(除了這樣的數(shù)值將超過(guò)可能值的100％以外)。

包封：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“包封”或語(yǔ)法等價(jià)物是指將單個(gè)mRNA分子限制在納米顆粒內(nèi)的過(guò)程。

提高、增加或減少：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“提高”、“增加”或“減少”或語(yǔ)法等價(jià)物指示相對(duì)于基線測(cè)量(諸如在開(kāi)始本文所述的治療前在同一個(gè)體中的測(cè)量，或在不存在本文所述的治療的情況下在對(duì)照受試者(或多個(gè)對(duì)照受試者)中的測(cè)量)的值?！皩?duì)照受試者”是患有與所治療的受試者相同形式的疾病的受試者，其與所治療的受試者具有大約相同的年齡。

雜質(zhì)：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“雜質(zhì)”是指在有限量的液體、氣體或固體內(nèi)的物質(zhì)，其不同于目標(biāo)材料或化合物的化學(xué)組成。雜質(zhì)也被稱為污染物。

體外：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“體外”是指發(fā)生在人工環(huán)境中(例如，在試管或反應(yīng)容器中、在細(xì)胞培養(yǎng)物中等)，而非多細(xì)胞生物體內(nèi)的事件。

體內(nèi)：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)”是指發(fā)生在多細(xì)胞生物體(如人類和非人類動(dòng)物)中的事件。在基于細(xì)胞的系統(tǒng)的情況下，該術(shù)語(yǔ)可以用于指發(fā)生在活細(xì)胞中的事件(而不是例如體外系統(tǒng))。

分離的：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指這樣的物質(zhì)和/或?qū)嶓w，它們已經(jīng)(1)與在最初產(chǎn)生時(shí)(無(wú)論在自然界中和/或在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中)與其結(jié)合的組分的至少一些分離，和/或(2)由人工生產(chǎn)、制備和/或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可以與約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或大于約99％的最初與它們結(jié)合的其它組分分離。在一些實(shí)施方案中，分離的試劑的純度為約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或大于約99％。如本文中所用，如果物質(zhì)大體上不含其它組分，則該物質(zhì)是“純的”。如本文中所用，分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w的百分比純度的計(jì)算不應(yīng)包括賦形劑(例如，緩沖劑、溶劑、水等)。

信使RNA(mRNA)：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“信使RNA(mRNA)”是指編碼至少一種多肽的多核苷酸。本文所用的mRNA包括修飾的和未修飾的RNA。mRNA可以含有一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)。

核酸：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”在其最廣泛的意義上是指并入或可以并入多核苷酸鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，核酸是經(jīng)由磷酸二酯鍵并入或可以并入多核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，“核酸”是指?jìng)€(gè)別核酸殘基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些實(shí)施方案中，“核酸”是指包含個(gè)別核酸殘基的多核苷酸鏈。在一些實(shí)施方案中，“核酸”包括RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或cDNA。此外，術(shù)語(yǔ)“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或類似術(shù)語(yǔ)包括核酸類似物，即不具有磷酸二酯主鏈的類似物。例如，本領(lǐng)域中已知的且在主鏈中具有肽鍵而不是磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括互為彼此的簡(jiǎn)并形式和/或編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列可以包括內(nèi)含子。核酸可以從天然來(lái)源純化，使用重組表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生并任選地純化，化學(xué)合成等。在合適的情況下，例如在化學(xué)合成分子的情況下，核酸可以包含核苷類似物，例如具有化學(xué)修飾的堿基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另有說(shuō)明，否則核酸序列是以5’至3’方向呈現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷，胸苷、鳥(niǎo)苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥(niǎo)苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥(niǎo)苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥(niǎo)苷、O(6)-甲基鳥(niǎo)嘌呤和2-硫代胞苷)；化學(xué)修飾的堿基；生物修飾的堿基(例如，甲基化堿基)；插入的堿基；修飾的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修飾的磷酸基團(tuán)(例如，硫代磷酸酯鍵和5’-N-亞磷酰胺鍵)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明明確地涉及“未修飾的核酸”，意思是未經(jīng)化學(xué)修飾以促進(jìn)或?qū)崿F(xiàn)遞送的核酸(例如，多核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)。

鹽：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“鹽”是指源自或可能源自酸和堿之間的中和反應(yīng)的離子性化合物。

大體上：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“大體上”是指表現(xiàn)出全部或接近全部范圍或程度的感興趣的特性或性質(zhì)的定性條件。生物領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解的是，生物和化學(xué)現(xiàn)象幾乎從不完全發(fā)生和/或進(jìn)行到完全或?qū)崿F(xiàn)或避免絕對(duì)的結(jié)果。因此，本文中使用術(shù)語(yǔ)“大體上”來(lái)體現(xiàn)許多生物和化學(xué)現(xiàn)象中固有的潛在完全性缺乏。

產(chǎn)率：如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)率”是指在包封后回收的mRNA相對(duì)于作為起始材料的總mRNA的百分比。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“回收率”可與術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)率”互換使用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種用于脂質(zhì)納米顆粒配制和mRNA包封的改良方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種將信使RNA(mRNA)包封在脂質(zhì)納米顆粒中的方法，其包括混合mRNA溶液和脂質(zhì)溶液的步驟，其中mRNA溶液和/或脂質(zhì)溶液處于大于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度下。

在以下章節(jié)中詳細(xì)描述了本發(fā)明的各個(gè)方面。章節(jié)的使用無(wú)意限制本發(fā)明。每個(gè)章節(jié)可以應(yīng)用于本發(fā)明的任何方面。在本申請(qǐng)中，除非另外說(shuō)明，否則使用“或”意指“和/或”。

mRNA

本發(fā)明可以用于包封任何mRNA。mRNA通常被認(rèn)為是將來(lái)自DNA的信息攜帶至核糖體中的RNA類型。mRNA的存在通常非常短暫，并且包括加工和翻譯，隨后降解。通常，在真核生物中，mRNA加工包括在N末端(5’端)添加“帽”，以及在C末端(3’端)添加“尾部”。典型的帽是7-甲基鳥(niǎo)苷帽，它是通過(guò)5’-5’-三磷酸酯鍵連接到第一個(gè)轉(zhuǎn)錄核苷酸的鳥(niǎo)苷。帽的存在對(duì)于提供對(duì)大多數(shù)真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核酸酶的抗性是重要的。所述尾部通常是聚腺苷酸化事件，通過(guò)該事件將聚腺苷?；糠痔砑拥絤RNA分子的3’端。這種“尾部”的存在用于保護(hù)mRNA免受核酸外切酶降解。信使RNA由核糖體翻譯成構(gòu)成蛋白質(zhì)的一系列氨基酸。

mRNA可以根據(jù)多種已知方法中的任一種來(lái)合成。例如，根據(jù)本發(fā)明的mRNA可以經(jīng)由體外轉(zhuǎn)錄(IVT)來(lái)合成。簡(jiǎn)言之，通常利用含有啟動(dòng)子的線性或環(huán)狀DNA模板、三磷酸核糖核苷酸池、可以包括DTT和鎂離子的緩沖系統(tǒng)以及合適的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制劑來(lái)進(jìn)行IVT。確切的條件將根據(jù)具體應(yīng)用而變化。

在一些實(shí)施方案中，體外合成的mRNA可以在配制和包封之前進(jìn)行純化以除去非所需的雜質(zhì)，包括在mRNA合成期間使用的各種酶和其它試劑。

本發(fā)明可以用于配制和包封各種長(zhǎng)度的mRNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于配制和包封體外合成的長(zhǎng)度為等于或大于約1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb 6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的mRNA。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于配制和包封體外合成的長(zhǎng)度介于約1-20kb、約1-15kb、約1-10kb、約5-20kb、約5-15kb、約5-12kb、約5-10kb、約8-20kb或約8-15kb的范圍內(nèi)的mRNA。

本發(fā)明可以用于配制和包封未修飾的mRNA或含有通常增強(qiáng)穩(wěn)定性的一種或多種修飾的mRNA。在一些實(shí)施方案中，修飾選自修飾的核苷酸、修飾的糖磷酸主鏈、5’和/或3’非翻譯區(qū)。

在一些實(shí)施方案中，mRNA的修飾可以包括RNA的核苷酸的修飾。根據(jù)本發(fā)明的修飾的mRNA可以包括例如主鏈修飾、糖修飾或堿基修飾。在一些實(shí)施方案中，mRNA可以由以下合成：天然存在的核苷酸和/或核苷酸類似物(修飾的核苷酸)，包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶C)、尿嘧啶(U))；以及嘌呤和嘧啶的修飾的核苷酸類似物或衍生物，如(例如)1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-異戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-異戊烯腺嘌呤、2-硫代胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、2,2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氫尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-(羧基羥甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基假尿嘧啶、辮苷、.β.-D-甘露糖基辮苷、懷丁苷(wybutoxosine)和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脫氮鳥(niǎo)苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。本領(lǐng)域技術(shù)人員從例如美國(guó)專利第4,373,071號(hào)、美國(guó)專利第4,401,796號(hào)、美國(guó)專利第4,415,732號(hào)、美國(guó)專利第4,458,066號(hào)、美國(guó)專利第4,500,707號(hào)、美國(guó)專利第4,668,777號(hào)、美國(guó)專利第4,973,679號(hào)、美國(guó)專利第5,047,524號(hào)、美國(guó)專利第5,132,418號(hào)、美國(guó)專利第5,153,319號(hào)、美國(guó)專利第5,262,530號(hào)和第5,700,642號(hào)了解此類類似物的制備，這些專利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用全部包括在本文中。

通常，mRNA合成包括在N末端(5’端)添加“帽”，以及在C末端(3’端)添加“尾部”。帽的存在對(duì)于提供對(duì)大多數(shù)真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核酸酶的抗性是重要的?！拔膊俊钡拇嬖谟糜诒Ｗo(hù)mRNA免受核酸外切酶降解。

因此，在一些實(shí)施方案中，mRNA包括5’帽結(jié)構(gòu)。5’帽的添加通常如下：首先，RNA末端磷酸酶從5’核苷酸去除一個(gè)末端磷酸基團(tuán)，留下兩個(gè)末端磷酸酯；然后通過(guò)鳥(niǎo)苷酰轉(zhuǎn)移酶將三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)添加到末端磷酸酯上，產(chǎn)生5’5’5三磷酸酯鍵；然后通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶使鳥(niǎo)嘌呤的7-氮甲基化。2’-O-甲基化也可以發(fā)生在7-甲基鳥(niǎo)苷三磷酸殘基之后的第一堿基和/或第二堿基上。帽結(jié)構(gòu)的實(shí)例包括但不限于m7GpppNp-RNA、m7GpppNmp-RNA和m7GpppNmpNmp-RNA(其中m指示2’-O甲基殘基)。

在一些實(shí)施方案中，mRNA包括5’和/或3’非翻譯區(qū)。在一些實(shí)施方案中，5’非翻譯區(qū)包括影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯的一個(gè)或多個(gè)元件，例如鐵反應(yīng)元件。在一些實(shí)施方案中，5’非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度可以介于約50個(gè)核苷酸和500個(gè)核苷酸之間。

在一些實(shí)施方案中，3’非翻譯區(qū)包括下列中的一個(gè)或多個(gè)：聚腺苷酸化信號(hào)、影響mRNA在細(xì)胞中的位置穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)或miRNA的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，3’非翻譯區(qū)的長(zhǎng)度可以介于約50個(gè)核苷酸和500個(gè)核苷酸之間或更長(zhǎng)。

雖然由體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)提供的mRNA在一些實(shí)施方案中可以是理想的，但預(yù)期了在本發(fā)明的范圍內(nèi)的其它來(lái)源的mRNA，包括由細(xì)菌、真菌、植物和/或動(dòng)物產(chǎn)生的mRNA。

本發(fā)明可以用于配制和包封編碼各種蛋白質(zhì)的mRNA。適用于本發(fā)明的mRNA的非限制性實(shí)例包括編碼脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1(SMN)、α-半乳糖苷酶(GLA)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS1)、螢火蟲(chóng)熒光素酶、因子IX(FIX)、苯丙氨酸羥化酶(PAH)和囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)受體(CFTR)的mRNA。在實(shí)施例部分中詳細(xì)描述了示例性mRNA序列。

mRNA溶液

mRNA可以在待與脂質(zhì)溶液混合的溶液中提供，這樣使得mRNA可以包封在脂質(zhì)納米顆粒中。合適的mRNA溶液可以是含有將以各種濃度包封的mRNA的任何水溶液。例如，合適的mRNA溶液可以含有濃度大于約0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的mRNA。在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA溶液可以含有濃度介于約0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml或0.5-0.6mg/ml的范圍內(nèi)的mRNA。在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA溶液可以含有濃度為至多約5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml或0.05mg/ml的mRNA。

通常，合適的mRNA溶液還可以含有緩沖劑和/或鹽。通常，緩沖劑可以包括HEPES、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀和磷酸鈉。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑的合適濃度可以介于約0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑的合適濃度等于或大于0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。

示例性鹽可以包括氯化鈉、氯化鎂和氯化鉀。在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液中的合適的鹽濃度可以介于約1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM的范圍內(nèi)。合適的mRNA溶液中的鹽濃度為等于或大于約1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。

在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA溶液可以具有在約3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5.、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5的范圍內(nèi)的pH。在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA溶液可以具有不大于約3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3和6.5的pH。

可以使用各種方法來(lái)制備適用于本發(fā)明的mRNA溶液。在一些實(shí)施方案中，mRNA可以直接溶解于本文所述的緩沖溶液中。在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液可以通過(guò)在與用于包封的脂質(zhì)溶液混合之前混合mRNA儲(chǔ)備溶液和緩沖溶液來(lái)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液可以通過(guò)在與用于包封的脂質(zhì)溶液混合前即刻混合mRNA儲(chǔ)備溶液和緩沖溶液來(lái)產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，合適的mRNA儲(chǔ)備溶液可以含有在水中的濃度為等于或大于約0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。

在一些實(shí)施方案中，使用泵混合mRNA儲(chǔ)備溶液與緩沖溶液。示例性泵包括但不限于齒輪泵、蠕動(dòng)泵和離心泵。

通常，緩沖溶液的混合速率大于mRNA儲(chǔ)備溶液的混合速率。例如，緩沖溶液可以在比mRNA儲(chǔ)備溶液的速率高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的速率下混合。在一些實(shí)施方案中，在介于約100-6000ml/分鐘(例如，約100-300ml/分鐘、300-600ml/分鐘、600-1200ml/分鐘、1200-2400ml/分鐘、2400-3600ml/分鐘、3600-4800ml/分鐘、4800-6000ml/分鐘或60-420ml/分鐘)的范圍內(nèi)的流速下混合緩沖溶液。在一些實(shí)施方案中，在等于或大于約60ml/分鐘、100ml/分鐘、140ml/分鐘、180ml/分鐘、220ml/分鐘、260ml/分鐘、300ml/分鐘、340ml/分鐘、380ml/分鐘、420ml/分鐘、480ml/分鐘、540ml/分鐘、600ml/分鐘、1200ml/分鐘、2400ml/分鐘、3600ml/分鐘、4800ml/分鐘或6000ml/分鐘的流速下混合緩沖溶液。

在一些實(shí)施方案中，在介于約10-600ml/分鐘(例如，約5-50ml/分鐘、約10-30ml/分鐘、約30-60ml/分鐘、約60-120ml/分鐘、約120-240ml/分鐘、約240-360ml/分鐘、約360-480ml/分鐘或約480-600ml/分鐘)的范圍內(nèi)的流速下混合mRNA儲(chǔ)備溶液。在一些實(shí)施方案中，在等于或大于約5ml/分鐘、10ml/分鐘、15ml/分鐘、20ml/分鐘、25ml/分鐘、30ml/分鐘、35ml/分鐘、40ml/分鐘、45ml/分鐘、50ml/分鐘、60ml/分鐘、80ml/分鐘、100ml/分鐘、200ml/分鐘、300ml/分鐘、400ml/分鐘、500ml/分鐘或600ml/分鐘的流速下混合mRNA儲(chǔ)備溶液。

脂質(zhì)溶液

根據(jù)本發(fā)明，脂質(zhì)溶液含有適于形成用于包封mRNA的脂質(zhì)納米顆粒的脂質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液是基于乙醇的。例如，合適的脂質(zhì)溶液可以含有溶解在無(wú)水乙醇(即，100％乙醇)中的所需脂質(zhì)的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液是基于異丙醇的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液是基于二甲亞砜的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液是合適的溶劑(包括但不限于乙醇、異丙醇和二甲亞砜)的混合物。

合適的脂質(zhì)溶液可以含有不同濃度的所需脂質(zhì)的混合物。例如，合適的脂質(zhì)溶液可以含有總濃度等于或大于約0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或100mg/ml的所需脂質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液可以含有總濃度介于約0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml的范圍內(nèi)的所需脂質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液可以含有總濃度為至多約100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml或10mg/ml的所需脂質(zhì)的混合物。

任何所需脂質(zhì)可以以適于包封mRNA的任何比率混合。在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液含有包括陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)(例如，非陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或膽固醇脂質(zhì))和/或聚乙二醇化脂質(zhì)的所需脂質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液含有包括一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、一種或多種輔助脂質(zhì)(例如，非陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或膽固醇脂質(zhì))和一種或多種聚乙二醇化脂質(zhì)的所需脂質(zhì)的混合物。

陽(yáng)離子脂質(zhì)

如本文中所使用，短語(yǔ)“陽(yáng)離子脂質(zhì)”是指在選定的pH(如生理pH)下具有凈正電荷的多個(gè)脂質(zhì)物種中的任一個(gè)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了幾種陽(yáng)離子脂質(zhì)，其中許多是市售的。特別合適在本發(fā)明的組合物和方法中使用的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括在國(guó)際專利公開(kāi)WO 2010/053572(并且具體地說(shuō)，在段落[00225]處描述的C12-200)和WO 2012/170930中描述的陽(yáng)離子脂質(zhì)，這兩個(gè)文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文中。在某些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的組合物和方法的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括描述于2012年3月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/617,468(通過(guò)引用并入本文)中的可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)，如例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)。

在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的組合物和方法的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括描述于WO 2013063468和標(biāo)題為“Lipid Formulations for Delivery of Messenger RNA”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)中的陽(yáng)離子脂質(zhì)，這兩個(gè)文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文中。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)包含式I-c1-a的化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中：

每個(gè)R²獨(dú)立地為氫或C_1-3烷基；

每個(gè)q獨(dú)立地為2至6；

每個(gè)R'獨(dú)立地為氫或C_1-3烷基；

且每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為氫、甲基或乙基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為氫或甲基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²為氫。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)q獨(dú)立地為3至6。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)q獨(dú)立地為3至5。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)q為4。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R'獨(dú)立地為氫、甲基或乙基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R'獨(dú)立地為氫或甲基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R'獨(dú)立地為氫。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為正C_8-12烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_9-11烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為正C_9-11烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為C₁₀烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為正C₁₀烷基。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²獨(dú)立地為氫或甲基；每個(gè)q獨(dú)立地為3至5；每個(gè)R'獨(dú)立地為氫或甲基；且每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²為氫；每個(gè)q獨(dú)立地為3至5；每個(gè)R'為氫；且每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。

在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R²為氫；每個(gè)q為4；每個(gè)R'為氫；且每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。

在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)包含式I-g的化合物：

或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_8-12烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為正C_8-12烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為C_9-11烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為正C_9-11烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L獨(dú)立地為C₁₀烷基。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)R^L為正C₁₀烷基。

在具體實(shí)施方案中，合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)是cKK-E12，或(3,6-雙(4-(雙(2-羥基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)。cKK-E12的結(jié)構(gòu)如下所示：

在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)可以是N-[l-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨或"DOTMA"。(Feigner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美國(guó)專利第4,897,355號(hào))。其它合適的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括例如5-羧基精胺基甘氨酸-二-十八烷基酰胺或"DOGS"、2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙銨或"DOSPA"(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美國(guó)專利第5,171,678號(hào)；美國(guó)專利第5,334,761號(hào))、l,2-二油?；?3-二甲基銨丙烷或"DODAP"、l,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷或"DOTAP"。

其它示例性陽(yáng)離子脂質(zhì)還包括l,2-硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DSDMA"、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DODMA"、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLinDMA"、l,2-二亞麻基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷或"DLenDMA"、N-二油基-N,N-二甲基氯化銨或"DODAC"、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨或"DDAB"、N-(l,2-二肉豆蔻基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨或"DMRIE"、3-二甲氨基-2-(膽甾-5-烯基-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷或"CLinDMA"、2-[5'-(膽甾-5-烯基-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-l-(順式,順式-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷或"CpLinDMA"、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基芐胺或"DMOBA"、1,2-N,N'-二油基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷或"DOcarbDAP"、2,3-二亞油?；趸?Ν,Ν-二甲基丙胺或"DLinDAP"、l,2-N,N'-二亞油基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷或"DLincarbDAP"、l,2-二亞油酰基氨甲?；?3-二甲基氨基丙烷或"DLinCDAP"、2,2-二亞油基-4-二甲氨基甲基-[l,3]-二氧戊環(huán)或"DLin--DMA"、2,2-二亞油基-4-二甲氨基乙基-[l,3]-二氧戊環(huán)或"DLin-K-XTC2-DMA"以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊環(huán)-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA))(參見(jiàn)WO 2010/042877；Semple等人，Nature Biotech.28:172-176(2010))，或其混合物(Heyes,J.等人，J Controlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人，Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公開(kāi)WO2005/121348A1)。在一些實(shí)施方案中，所述陽(yáng)離子脂質(zhì)中的一種或多種包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一個(gè)。

在一些實(shí)施方案中，一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)可以選自XTC(2,2-二亞油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊環(huán))、MC3(((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯)、ALNY-100((3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環(huán)戊烷并[d][1,3]二氧戊環(huán)-5-胺))、NC98-5(4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-二-十一烷基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1,16-二酰胺)、DODAP(1,2-二油基-3-二甲基銨丙烷)、HGT4003(WO 2012/170889，其教導(dǎo)內(nèi)容通過(guò)引用全部并入本文中)、ICE(WO 2011/068810，其教導(dǎo)內(nèi)容通過(guò)引用全部并入本文中)、HGT5000(美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/617,468號(hào)，其教導(dǎo)內(nèi)容通過(guò)引用全部并入本文中)或HGT5001(順式或反式)(臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/617,468號(hào))、氨基醇類脂如WO2010/053572中公開(kāi)的那些、DOTAP(1,2-二油基-3-三甲基銨丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基銨丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.；Palmer,L.；Bremner,K.；MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人“Lipid-likematerials for low-dose in vivo gene silencing”P(pán)NAS 2010,107,1864-1869)。

在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中構(gòu)成總脂質(zhì)的至少約5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)構(gòu)成總脂質(zhì)混合物的約30-70％(例如，約30-65％、約30-60％、約30-55％、約30-50％、約30-45％、約30-40％、約35-50％、約35-45％或約35-40％)。

非陽(yáng)離子/輔助脂質(zhì)

如本文中所使用，短語(yǔ)“非陽(yáng)離子脂質(zhì)”是指任何中性、兩性離子或陰離子脂質(zhì)。如本文中所使用，短語(yǔ)“陰離子脂質(zhì)”是指在選定的H(如生理pH)下攜帶凈負(fù)電荷的多個(gè)脂質(zhì)物種中的任一個(gè)。非陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、二油?；字Ｄ憠A(DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、棕櫚酰油酰基磷脂酰膽堿(POPC)、棕櫚酰油?；?磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油?；?磷脂酰乙醇胺4-(N-馬來(lái)酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂?；?乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油?；?磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其混合物。

在一些實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中可以構(gòu)成總脂質(zhì)的至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中構(gòu)成總脂質(zhì)的約30-50％(例如，約30-45％、約30-40％、約35-50％、約35-45％或約35-40％)。

基于膽固醇的脂質(zhì)

在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液包括一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)。例如，合適的基于膽固醇的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺膽固醇)、l,4-雙(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美國(guó)專利第5,744,335號(hào))或ICE。在一些實(shí)施方案中，基于膽固醇的脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中構(gòu)成總脂質(zhì)的至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些實(shí)施方案中，基于膽固醇的脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中構(gòu)成總脂質(zhì)的約30-50％(例如，約30-45％、約30-40％、約35-50％、約35-45％或約35-40％)。

聚乙二醇化脂質(zhì)

在一些實(shí)施方案中，合適的脂質(zhì)溶液包括一種或多種聚乙二醇化脂質(zhì)。例如，本發(fā)明還預(yù)期了使用經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾的磷脂和衍生的脂質(zhì)，如衍生的神經(jīng)酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-l-[琥珀酰(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8PEG-2000神經(jīng)酰胺)。預(yù)期的經(jīng)PEG修飾的脂質(zhì)包括但不限于共價(jià)連接至具有C₆-C₂₀長(zhǎng)度的烷基鏈的脂質(zhì)的長(zhǎng)度最高達(dá)5kDa的聚乙二醇鏈。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)PEG修飾的或聚乙二醇化脂質(zhì)是聚乙二醇化膽固醇或PEG-2K。在一些實(shí)施方案中，特別有用的可交換脂質(zhì)是具有較短?；?例如，C₁₄或C₁₈)的PEG-神經(jīng)酰胺。

經(jīng)PEG修飾的磷脂和衍生的脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中可以構(gòu)成總脂質(zhì)的至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些實(shí)施方案中，聚乙二醇化脂質(zhì)脂質(zhì)按重量計(jì)或按摩爾計(jì)在合適的脂質(zhì)溶液中構(gòu)成總脂質(zhì)的約30-50％(例如，約30-45％、約30-40％、約35-50％、約35-45％或約35-40％)。

陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)、基于膽固醇的脂質(zhì)和經(jīng)PEG修飾的脂質(zhì)的示例性組合描述于實(shí)施例部分中。例如，合適的脂質(zhì)溶液可以含有cKK-E12、DOPE、chol和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、膽固醇和DMG-PEG2K；HGT5000、DOPE、chol和DMG-PEG2K；HGT5001、DOPE、chol和DMG-PEG2K；cKK-E12、DPPC、chol和DMG-PEG2K；C12-200、DPPC、膽固醇和DMG-PEG2K；HGT5000、DPPC、chol和DMG-PEG2K；或HGT5001、DPPC、chol和DMG-PEG2K。組成脂質(zhì)混合物的陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或經(jīng)PEG修飾的脂質(zhì)的選擇以及此類脂質(zhì)相對(duì)于彼此的摩爾比是基于所選脂質(zhì)的特性及待包封的mRNA的性質(zhì)和特性。額外的考慮因素包括例如烷基鏈的飽和度，以及所選脂質(zhì)的大小、電荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可以相應(yīng)地調(diào)整摩爾比。

混合過(guò)程

本發(fā)明是基于溫度對(duì)mRNA包封效率和回收率的出乎意料的影響的發(fā)現(xiàn)。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種通過(guò)混合本文所述的mRNA溶液和脂質(zhì)溶液將信使RNA(mRNA)包封在脂質(zhì)納米顆粒中的方法，其中將mRNA溶液和/或脂質(zhì)溶液加熱至大于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“環(huán)境溫度”是指室內(nèi)的溫度或在沒(méi)有加熱或冷卻的情況下包圍感興趣的物體(例如，mRNA溶液或脂質(zhì)溶液)的溫度。在一些實(shí)施方案中，環(huán)境溫度是指介于約20-25℃的范圍內(nèi)的溫度。

因此，大于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度通常大于約25℃。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度為等于或大于約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度介于約25-70℃、約30-70℃、約35-70℃、約40-70℃、約45-70℃、約50-70℃或約60-70℃的范圍內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的預(yù)定溫度為約65℃。

可以在混合之前將mRNA溶液或脂質(zhì)溶液或二者加熱至高于環(huán)境溫度的預(yù)定溫度。在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液和脂質(zhì)溶液在混合前分別被加熱至預(yù)定溫度。在一些實(shí)施方案中，mRNA溶液和脂質(zhì)溶液在環(huán)境溫度下混合，但在混合后被加熱至預(yù)定溫度。在一些實(shí)施方案中，將脂質(zhì)溶液加熱至預(yù)定溫度，并與環(huán)境溫度下的mRNA溶液混合。在一些實(shí)施方案中，將mRNA溶液加熱至預(yù)定溫度，并與環(huán)境溫度下的脂質(zhì)溶液混合。

在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將環(huán)境溫度下的mRNA儲(chǔ)備溶液添加到加熱的緩沖溶液中以實(shí)現(xiàn)所需的預(yù)定溫度而將mRNA溶液加熱至預(yù)定溫度。

可以使用泵混合mRNA溶液和脂質(zhì)溶液。因?yàn)榘獬绦蚰軌蛟趶V泛的規(guī)模下進(jìn)行，所以可以使用不同類型的泵以適應(yīng)所需的規(guī)模。然而，通常希望使用無(wú)脈流泵。如本文中所用，無(wú)脈流泵是指可以建立具有穩(wěn)定流速的連續(xù)流的任何泵。合適的泵的類型可以包括但不限于齒輪泵和離心泵。示例性齒輪泵包括但不限于Cole-Parmer或Diener齒輪泵。示例性離心泵包括但不限于由Grainger或Cole-Parmer制造的離心泵。

可以在各種流速下混合mRNA溶液和脂質(zhì)溶液。通常，mRNA溶液的混合速率可以大于脂質(zhì)溶液的混合速率。例如，mRNA溶液可以在比脂質(zhì)溶液的速率高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍的速率下混合。

用于混合的合適流速可以根據(jù)規(guī)模來(lái)確定。在一些實(shí)施方案中，在介于約40-400ml/分鐘、60-500ml/分鐘、70-600ml/分鐘、80-700ml/分鐘、90-800ml/分鐘、100-900ml/分鐘、110-1000ml/分鐘、120-1100ml/分鐘、130-1200ml/分鐘、140-1300ml/分鐘、150-1400ml/分鐘、160-1500ml/分鐘、170-1600ml/分鐘、180-1700ml/分鐘、150-250ml/分鐘、250-500ml/分鐘、500-1000ml/分鐘、1000-2000ml/分鐘、2000-3000ml/分鐘、3000-4000ml/分鐘或4000-5000ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合mRNA溶液。在一些實(shí)施方案中，在約200ml/分鐘、約500ml/分鐘、約1000ml/分鐘、約2000ml/分鐘、約3000ml/分鐘、約4000ml/分鐘或約5000ml/分鐘的流速下混合mRNA溶液。

在一些實(shí)施方案中，在介于約25-75ml/分鐘、20-50ml/分鐘、25-75ml/分鐘、30-90ml/分鐘、40-100ml/分鐘、50-110ml/分鐘、75-200ml/分鐘、200-350ml/分鐘、350-500ml/分鐘、500-650ml/分鐘、650-850ml/分鐘或850-1000ml/分鐘的范圍內(nèi)的流速下混合脂質(zhì)溶液。在一些實(shí)施方案中，在約50ml/分鐘、約100ml/分鐘、約150ml/分鐘、約200ml/分鐘、約250ml/分鐘、約300ml/分鐘、約350ml/分鐘、約400ml/分鐘、約450ml/分鐘、約500ml/分鐘、約550ml/分鐘、約600ml/分鐘、約650ml/分鐘、約700ml/分鐘、約750ml/分鐘、約800ml/分鐘、約850ml/分鐘、約900ml/分鐘、約950ml/分鐘或約1000ml/分鐘的流速下混合脂質(zhì)溶液。

通常，將mRNA溶液和脂質(zhì)溶液混合成溶液，以使得所述脂質(zhì)可以形成包封mRNA的納米顆粒。這種溶液也被稱為配制或包封溶液。合適的配制或包封溶液可以基于溶劑如乙醇。例如，合適的配制或包封溶液可以基于約10％乙醇、約15％乙醇、約20％乙醇、約25％乙醇、約30％乙醇、約35％乙醇或約40％乙醇。

合適的配制或包封溶液可以基于溶劑如異丙醇。例如，合適的配制或包封溶液可以基于約10％異丙醇、約15％異丙醇、約20％異丙醇、約25％異丙醇、約30％異丙醇、約35％異丙醇或約40％異丙醇。

合適的配制或包封溶液可以基于溶劑如二甲亞砜。例如，合適的配制或包封溶液可以基于約10％二甲亞砜、約15％二甲亞砜、約20％二甲亞砜、約25％二甲亞砜、約30％二甲亞砜、約35％二甲亞砜或約40％二甲亞砜。

合適的配制或包封溶液還可以含有緩沖劑或鹽。示例性緩沖劑可以包括HEPES、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀和磷酸鈉。示例性鹽可以包括氯化鈉、氯化鎂和氯化鉀。

純化

通常，在配制和包封后，將脂質(zhì)納米顆粒純化和/或濃縮。可以使用各種純化方法。在一些實(shí)施方案中，使用切向流過(guò)濾純化脂質(zhì)納米顆粒。切向流過(guò)濾(TFF)，也稱為交叉流過(guò)濾，是其中待過(guò)濾的材料切向地穿過(guò)過(guò)濾器，而不是通過(guò)該過(guò)濾器的過(guò)濾類型。在TFF中，非所需的滲透物通過(guò)過(guò)濾器，而所需的滯留物沿過(guò)濾器前行并在下游被收集。重要的是要注意，所需的材料通常包含在TFF的滯留物中，這與通常在傳統(tǒng)死端過(guò)濾種遇到的情況相反。

根據(jù)待過(guò)濾的材料，TFF通常用于微濾或超濾。微濾通常被定義為其中過(guò)濾器具有0.05μm和1.0μm之間(包括0.05μm和1.0μm)的孔徑的情況，而超濾通常涉及具有小于0.05μm的孔徑的過(guò)濾器?？讖竭€確定了特定過(guò)濾器的標(biāo)稱分子量限值(NMWL)，也被稱為截留分子量(MWCO)，其中微濾膜通常具有大于1,000千道爾頓(kDa)的NMWL且超濾過(guò)濾器具有1kDa和1,000kDa之間的NMWL。

切向流過(guò)濾的主要優(yōu)點(diǎn)在于：在傳統(tǒng)的“死端”過(guò)濾期間可能聚集在過(guò)濾器中并堵塞過(guò)濾器的非滲透性顆粒(有時(shí)稱為“濾餅”)相反沿著所述過(guò)濾器的表面前行。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)允許切向流過(guò)濾被廣泛地用于需要連續(xù)操作的工業(yè)過(guò)程中，因?yàn)檫^(guò)濾器一般不需要被移除和清洗，所以停工時(shí)間顯著減少。

切向流過(guò)濾可以用于幾種目的，包括濃縮和滲濾等。濃縮是從溶液中除去溶劑而保留溶質(zhì)分子的過(guò)程。為了有效地濃縮樣品，使用具有大大低于待保留的溶質(zhì)分子的分子量的NMWL或MWCO的膜。通常，技術(shù)人員可以選擇具有比目標(biāo)分子的分子量低三至六倍的NMWL或MWCO的過(guò)濾器。

滲濾是一個(gè)分餾過(guò)程，由此非所需的小顆粒通過(guò)過(guò)濾器，而較大的所需納米顆粒保持在滯留物中而不改變那些納米顆粒在溶液中的濃度。滲濾經(jīng)常被用來(lái)從溶液中去除鹽或反應(yīng)緩沖劑。滲濾可以是連續(xù)的或不連續(xù)的。在連續(xù)滲濾中，滲濾溶液以與生成濾液相同的速率加入到樣品進(jìn)料中。在不連續(xù)滲濾中，首先稀釋溶液，然后將其再濃縮至起始濃度。可以重復(fù)不連續(xù)滲濾，直到達(dá)到納米顆粒的所需濃度。

可以在所需的緩沖液如(例如)PBS中配制純化和/或濃縮的脂質(zhì)納米顆粒。

提供包封mRNA的納米顆粒

相比于現(xiàn)有技術(shù)方法，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生更均勻和更小的粒度(例如，小于100nm)，以及顯著提高的包封效率和/或mRNA回收率。

因此，本發(fā)明提供包含本文所述的純化納米顆粒的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物中的大多數(shù)純化納米顆粒，即大于約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的純化納米顆粒，具有小于約100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的大小。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化納米顆粒具有小于100nm(例如，小于約95nm、約90nm、約85nm、約80nm、約75nm、約70nm、約65nm、約60nm、約55nm或約50nm)的大小。

另外，通過(guò)本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)了具有窄粒度范圍的更均勻的納米顆粒。例如，由本發(fā)明提供的組合物中的大于約70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的純化納米顆粒具有介于約40-90nm(例如，約40-85nm、約40-80nm、約40-75nm、約40-70nm、約40-65nm或約40-60nm)的范圍內(nèi)的大小。在一些實(shí)施方案中，大體上所有的純化納米顆粒具有介于約40-90nm(例如，約40-85nm、約40-80nm、約40-75nm、約40-70nm、約40-65nm或約40-60nm)的范圍內(nèi)的大小。

在一些實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的組合物中的納米顆粒的分散度或分子大小的非均質(zhì)性的量度(PDI)為小于約0.16(例如，小于約0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.10、0.09或0.08)。

在一些實(shí)施方案中，由本發(fā)明提供的組合物中的大于約75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的純化脂質(zhì)納米顆粒將mRNA包封在每個(gè)單獨(dú)顆粒內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，組合物中的大體上所有的純化脂質(zhì)納米顆粒將mRNA包封在每個(gè)單獨(dú)顆粒內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的組合物含有至少約1mg、5mg、10mg、100mg、500mg或1000mg包封的mRNA。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生大于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的mRNA回收率。

實(shí)施例

雖然已經(jīng)根據(jù)某些實(shí)施方案具體地描述了本發(fā)明的某些化合物、組合物和方法，但以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的化合物，并且無(wú)意限制所述化合物。

實(shí)施例1.溫度對(duì)納米顆粒包封過(guò)程的影響

此實(shí)施例證明，在納米顆粒包封過(guò)程中的溫度升高增加產(chǎn)率和/或包封效率。

脂質(zhì)材料

除非另有說(shuō)明，否則在以下實(shí)施例中描述的制劑包含使用不同比率的一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)(例如，非陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或膽固醇脂質(zhì))和PEG化脂質(zhì)的多組分脂質(zhì)混合物，其旨在包封各種核酸材料。用于所述過(guò)程的陽(yáng)離子脂質(zhì)可以包括但不限于DOTAP(l,2-二油基-3-三甲基銨丙烷)、DODAP(l,2-二油基-3-二甲基銨丙烷)、DOTMA(1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基銨丙烷)、DLinDMA(Heyes,J.、Palmer,L.、Bremner,K.、MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276-287)、DLin-KC2-DMA(Semple,S.C.等人“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172-176)、C12-200(Love,K.T.等人“Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing”P(pán)NAS 2010,107,1864-1869)、cKK-E12(3,6-雙(4-(雙(2-羥基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、ICE、二烷基氨基型、咪唑型、胍鎓型等。輔助脂質(zhì)可以包括但不限于DSPC(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿)、DPPC(1,2-二棕櫚?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿)、DOPE(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPC(1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿)、DPPE(1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸(1'-外消旋-甘油))、膽固醇等。聚乙二醇化脂質(zhì)可以包括但不限于共價(jià)連接至具有C6-C20長(zhǎng)度的烷基鏈的脂質(zhì)的長(zhǎng)度最高達(dá)5kDa的聚乙二醇鏈。

信使RNA材料

密碼子優(yōu)化的人類脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1(SMN)信使RNA、精氨基琥珀酸合成酶(ASS1)信使RNA、修飾的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子( CFTR，25％假尿苷，25％5-甲基胞苷)信使RNA、螢火蟲(chóng)熒光素酶(FFL)信使RNA、因子IX(FIX)信使RNA、苯丙氨酸羥化酶(PAH)信使RNA和α-半乳糖苷酶(GLA)信使RNA是通過(guò)從編碼所述基因的質(zhì)粒DNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，隨后添加5’帽結(jié)構(gòu)(帽1)(Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249)和長(zhǎng)度為約250個(gè)核苷酸(如通過(guò)凝膠電泳法所測(cè)定)的3’聚(A)尾部而合成。存在于每種mRNA產(chǎn)物中的5’和3’非翻譯區(qū)分別表示為X和Y，并且定義如下所規(guī)定(參見(jiàn)下文)。

密碼子優(yōu)化的人類脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元1(SMN)mRNA：

XAUGGCCAUGAGCAGCGGAGGCAGCGGCGGAGGAGUGCCCGAGCAGGAGGACAGCGUGCUGUUCAGGAGAGGCACCGGCCAGAGCGAUGACAGCGAUAUCUGGGACGAUACCGCUCUGAUCAAGGCCUACGACAAGGCCGUGGCCAGCUUCAAGCACGCCCUGAAAAACGGCGACAUCUGCGAGACCAGCGGCAAGCCCAAGACAACCCCCAAGAGAAAGCCCGCCAAGAAGAAUAAGAGCCAGAAAAAGAACACCGCCGCCAGCCUGCAGCAGUGGAAGGUGGGCGACAAGUGCAGCGCCAUCUGGAGCGAGGACGGCUGCAUCUACCCCGCCACCAUCGCCAGCAUCGACUUCAAGAGAGAGACCUGCGUGGUCGUGUACACCGGCUACGGCAACAGAGAGGAGCAGAACCUGAGCGACCUGCUGAGCCCCAUUUGUGAGGUGGCCAAUAACAUCGAACAGAACGCCCAGGAGAACGAGAAUGAAAGCCAGGUGAGCACCGACGAGAGCGAGAACAGCAGAUCUCCUGGCAACAAGAGCGACAACAUCAAGCCUAAGUCUGCCCCUUGGAACAGCUUCCUGCCCCCUCCUCCACCCAUGCCCGGACCCAGACUGGGACCCGGAAAACCUGGCCUGAAGUUCAACGGACCACCUCCCCCUCCACCUCCUCCCCCACCUCAUCUCCUGAGCUGCUGGCUGCCACCCUUCCCCAGCGGACCCCCUAUCAUCCCACCACCCCCUCCCAUCUGCCCCGACAGCCUGGACGACGCCGAUGCCCUGGGCAGCAUGCUGAUCAGCUGGUACAUGAGCGGCUACCACACAGGAUACUACAUGGGCUUCAGACAGAACCAGAAGGAGGGCAGAUGCUCCCACUCCCUGAACUGAY

人類α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA：

XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY

密碼子優(yōu)化的人類精氨基琥珀酸合成酶(ASSl)mRNA：XAUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAG

GGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGACCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGAY

密碼子優(yōu)化的螢火蟲(chóng)熒光素酶mRNA：

XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAAY

人類因子IX(FIX)mRNA：

XAUGCAGCGCGUGAACAUGAUCAUGGCAGAAUCACCAGGCCUCAUCACCAUCUGCCUUUUAGGAUAUCUACUCAGUGCUGAAUGUACAGUUUUUCUUGAUCAUGAAAACGCCAACAAAAUUCUGAGGCGGAGAAGGAGGUAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGAGUUUGUUCAAGGGAACCUUGAGAGAGAAUGUAUGGAAGAAAAGUGUAGUUUUGAAGAAGCACGAGAAGUUUUUGAAAACACUGAAAGAACAACUGAAUUUUGGAAGCAGUAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUGCAAGGAUGACAUUAAUUCCUAUGAAUGUUGGUGUCCCUUUGGAUUUGAAGGAAAGAACUGUGAAUUAGAUGUAACAUGUAACAUUAAGAAUGGCAGAUGCGAGCAGUUUUGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCGACUUGCAGAAAACCAGAAGUCCUGUGAACCAGCAGUGCCAUUUCCAUGUGGAAGAGUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAUGUGGACUAUGUAAAUUCUACUGAAGCUGAAACCAUUUUGGAUAACAUCACUCAAAGCACCCAAUCAUUUAAUGACUUCACUCGGGUUGUUGGUGGAGAAGAUGCCAAACCAGGUCAAUUCCCUUGGCAGGUUGUUUUGAAUGGUAAAGUUGAUGCAUUCUGUGGAGGCUCUAUCGUUAAUGAAAAAUGGAUUGUAACUGCUGCCCACUGUGUUGAAACUGGUGUUAAAAUUACAGUUGUCGCAGGUGAACAUAAUAUUGAGGAGACAGAACAUACAGAGCAAAAGCGAAAUGUGAUUCGAAUUAUUCCUCACCACAACUACAAUGCAGCUAUUAAUAAGUACAACCAUGACAUUGCCCUUCUGGAACUGGACGAACCCUUAGUGCUAAACAGCUACGUUACACCUAUUUGCAUUGCUGACAAGGAAUACACGAACAUCUUCCUCAAAUUUGGAUCUGGCUAUGUAAGUGGCUGGGGAAGAGUCUUCCACAAAGGGAGAUCAGCUUUAGUUCUUCAGUACCUUAGAGUUCCACUUGUUGACCGAGCCACAUGUCUUCGAUCUACAAAGUUCACCAUCUAUAACAACAUGUUCUGUGCUGGCUUCCAUGAAGGAGGUAGAGAUUCAUGUCAAGGAGAUAGUGGGGGACCCCAUGUUACUGAAGUGGAAGGGACCAGUUUCUUAACUGGAAUUAUUAGCUGGGGUGAAGAGUGUGCAAUGAAAGGCAAAUAUGGAAUAUAUACCAAGGUAUCCCGGUAUGUCAACUGGAUUAAGGAAAAAACAAAGCUCACUUAAY

密碼子優(yōu)化的人類苯丙氨酸羥化酶(PAH)mRNA：

XAUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCC

CAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAAY

密碼子優(yōu)化的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)子(CFTR)mRNA：

AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGG

UAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA

5’和3’UTR序列

X＝

GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG

Y＝

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU

脂質(zhì)納米顆粒制劑

制備報(bào)告體積的脂質(zhì)(陽(yáng)離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、兩性離子脂質(zhì)、PEG脂質(zhì)等)的混合物的乙醇溶液，并加熱到選定溫度。另外，從1mg/mL儲(chǔ)備溶液制備mRNA的水性緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽/150mM NaCl，pH 4.5)，并加熱到選定溫度5-10分鐘。

對(duì)于小規(guī)模制劑來(lái)說(shuō)，使用注射泵(3.71mL/秒)將脂質(zhì)溶液迅速注入到水性mRNA溶液中，并振蕩所得懸浮液以得到脂質(zhì)納米顆粒的20％乙醇溶液。用1×PBS(pH 7.4)滲濾所得納米顆粒懸浮液，濃縮，并儲(chǔ)存于2-8℃下

25℃下的代表性實(shí)施例

混合cKK-E12、DOPE、Chol和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分試樣并用乙醇稀釋到3mL最終體積。另外，從1mg/mL儲(chǔ)備溶液制備FFL mRNA的水性緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽/150mM NaCl，pH 4.5)。將脂質(zhì)溶液迅速注入到水性mRNA溶液中，并振蕩以得到最終的20％乙醇懸浮液。過(guò)濾所得納米顆粒懸浮液，用1×PBS(pH 7.4)滲濾，濃縮，并儲(chǔ)存于2-8℃下。最終濃度＝0.20mg/mL FFLmRNA(包封)。Z_ave＝91nm PDI(0.16)。

37℃下的配制

混合cKK-E12、DOPE、Chol和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分試樣并用乙醇稀釋到3mL最終體積。另外，從1mg/mL儲(chǔ)備溶液制備FIX mRNA的水性緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽/150mM NaCl，pH 4.5)。將脂質(zhì)溶液迅速注入到水性mRNA溶液中，并振蕩以得到最終的20％乙醇懸浮液。過(guò)濾所得納米顆粒懸浮液，用1×PBS(pH 7.4)滲濾，濃縮，并儲(chǔ)存于2-8℃下。最終濃度＝0.20mg/mL FIX mRNA(包封)。Z_ave＝64nm；PDI(0.12)。

65℃下的配制

混合cKK-E12、DOPE、Chol和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液的等分試樣并用乙醇稀釋到3mL最終體積。另外，從1mg/mL儲(chǔ)備溶液制備FIX mRNA的水性緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽/150mM NaCl，pH 4.5)。將脂質(zhì)溶液迅速注入到水性mRNA溶液中，并振蕩以得到最終的20％乙醇懸浮液。過(guò)濾所得納米顆粒懸浮液，用1×PBS(pH 7.4)滲濾，濃縮，并儲(chǔ)存于2-8℃下。最終濃度＝0.20mg/mL FIX mRNA(包封)。Z_ave＝73nm；PDI(0.13)。

溫度對(duì)納米顆粒包封過(guò)程的影響

乙醇脂質(zhì)溶液和mRNA的水性緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽/150mM NaCl，pH 4.5)在配制過(guò)程前均在不同的選定溫度下加熱，以確定溫度對(duì)制劑的最終產(chǎn)率和包封效率的影響。

針對(duì)大小、大小分散度、包封效率和產(chǎn)率(或回收率)評(píng)價(jià)溫度對(duì)納米顆粒包封過(guò)程的影響。示例性數(shù)據(jù)顯示在表1中。可以看到，溫度升高(例如，高于環(huán)境溫度)的結(jié)果是增加的包封效率和/或產(chǎn)率/回收率，以及減小的粒度和/或大小分散度。

表1.溫度對(duì)納米顆粒形成和mRNA包封的影響

實(shí)施例2.大規(guī)模配制過(guò)程

此實(shí)施例說(shuō)明用于在升高的溫度下包封mRNA的示例性大規(guī)模配制過(guò)程。

示例性的大規(guī)模配制過(guò)程示于圖1中。使用Ismatec可編程數(shù)字驅(qū)動(dòng)泵(Cole Parmer Model#CP 78008-10)。使用Micropump A卡口吸入靴泵頭316SS主體/石墨齒輪/PTFE密封件，0.084mL/轉(zhuǎn)(無(wú)內(nèi)部旁路)(Cole Parmer型號(hào)07002-27)和Pharma Pure管路尺寸14，0.06"ID，1/16"(Spectrum labs零件號(hào)ACTU-P14-25N)。

mRNA的納米顆粒配制和包封是通過(guò)使用‘T’接頭(或“Y”接頭)在檸檬酸鹽緩沖液(10mM檸檬酸鹽緩沖液，150mM NaCl，pH 4.5)中混合乙醇脂質(zhì)溶液和mRNA來(lái)準(zhǔn)備。在檸檬酸鹽緩沖液中的mRNA和在乙醇溶液中的脂質(zhì)的示例性流速分別為200mL/分鐘和50mL/分鐘。在此過(guò)程中，同時(shí)啟動(dòng)兩個(gè)泵。制劑的起始和末尾部分均被丟棄，只有中間制劑被收集。精確的流速和無(wú)脈流是這個(gè)過(guò)程的兩個(gè)重要參數(shù)。

純化和緩沖液交換

從上述步驟得到的制劑的純化和緩沖液交換是利用來(lái)自Spectrum labs的 Research IIi切向流過(guò)濾系統(tǒng)，使用改性聚醚砜中空纖維過(guò)濾器模塊進(jìn)行。用6倍體積的無(wú)菌PBS(pH 7.4)以連續(xù)滲濾形式進(jìn)行緩沖液交換。參見(jiàn)圖2。分析制劑的大小(PDI)和包封(產(chǎn)率)。示例性數(shù)據(jù)呈現(xiàn)在表2中。

表2.大規(guī)模配制的實(shí)例

使用這種方法，實(shí)現(xiàn)了極窄的粒度范圍以及高包封效率(例如，>90％的平均值)。

為了測(cè)試無(wú)脈均質(zhì)流的重要性，將具有一定程度的脈動(dòng)流的蠕動(dòng)泵用于所述配制過(guò)程。參見(jiàn)圖3。在檸檬酸鹽緩沖液中的mRNA和在無(wú)水乙醇中的脂質(zhì)分別在200mL/分鐘和50mL/分鐘的流速下混合。示例性結(jié)果顯示在表3中?？梢钥吹?，在此過(guò)程中使用蠕動(dòng)泵產(chǎn)生具有較大尺寸的納米顆粒的制劑。這可能是由于由脈動(dòng)流所引起的非均勻混合。

表3.使用蠕動(dòng)泵配制的實(shí)例

等效物和范圍

本領(lǐng)域技術(shù)人員僅利用常規(guī)實(shí)驗(yàn)就將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文所描述的本發(fā)明的具體實(shí)施方案的許多等效物。本發(fā)明的范圍無(wú)意受以上描述的限制，而是如以下權(quán)利要求中所闡述。