本發(fā)明屬于肺纖維化的防治
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種羅漢果提取物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：肺纖維化(pulmonaryfibrosis,pf)是由各種肺內(nèi)外致病因素所致的，是一系列慢性肺部損傷或疾病發(fā)展到晚期的結(jié)果，嚴(yán)重危害人類健康。肺纖維化的病因包括遺傳性免疫功能異常、病毒感染、藥物及化學(xué)品、放射線、空氣污染(霧霾、吸煙、粉塵)等因素。肺纖維化的病理生理過(guò)程復(fù)雜，早期以肺部炎癥為主，肺泡壁彌漫性增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中晚期膠原纖維大量生成、沉積，肺泡變形、閉索，正常肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，功能喪失。肺纖維化的臨床表現(xiàn)主要有刺激性干咳、限制性通氣功能障礙、進(jìn)行性呼吸困難、彌散功能降低和低血氧癥等。近年來(lái)，肺纖維化仍是一種高死亡率的疾病，臨床上缺乏有效的治療手段；傳統(tǒng)治療藥物仍以抗炎、免疫抑制、抗凝血為主，臨床常用的有糖皮質(zhì)類激素、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、秋水仙堿和青霉胺等，但療效不佳且副作用大。因此，尋找有效抗肺纖維化藥物成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)的迫切需要。相關(guān)研究表明，體內(nèi)許多細(xì)胞因子均能夠影響肺纖維化的形成發(fā)展，如可以促進(jìn)纖維化形成的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(tgf-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(ctgf)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(pdgf)等。其中tgf-β1扮演了很重要的角色，促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，刺激多種細(xì)胞因子的合成、分泌，調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化等，是一種強(qiáng)力的致纖維化因子，可以刺激細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)，還可以改變基質(zhì)降解酶成分的活性,直接加劇ecm的沉積。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中，起到關(guān)鍵性作用的是肺成纖維細(xì)胞的活化、增殖，同時(shí)釋放大量促纖維因子，進(jìn)而增加平滑肌肌動(dòng)蛋白α-sma的表達(dá)和膠原蛋白的蓄積，導(dǎo)致ecm的沉積，最終引發(fā)肺纖維化。以抑制促纖維化因子為切入點(diǎn)開發(fā)治療肺纖維化的藥物是目前的研究熱點(diǎn)。氣管滴注博萊霉素誘導(dǎo)鼠肺纖維化的動(dòng)物模型是國(guó)內(nèi)外研究肺纖維化藥物的經(jīng)典動(dòng)物模型，該法復(fù)制的肺纖維化動(dòng)物模型與人肺纖維化近似，并可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生組織炎癥及纖維化，引起體內(nèi)氧化與抗氧化失衡，促纖維化標(biāo)志物tgf-β1、α-sma等的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積及纖維組織增生形成肺纖維化。目前肺纖維化的治療藥物以糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑為主，但尚無(wú)特效藥。鑒于此，有必要研制新型的高效、安全的治療肺纖維化的藥物。羅漢果為葫蘆科(cucurbitaceae)植物羅漢果(siratiagrosvenorii(swingle)c.jeffrey)的成熟果實(shí)，主產(chǎn)于廣西永福、臨桂和龍勝等縣，為廣西著名特產(chǎn)。羅漢果性涼、味甘，歸肺、大腸經(jīng)，具有潤(rùn)肺止咳、清熱解暑、利咽開音、涼血滑腸的功效，是我國(guó)特有的藥食同源性經(jīng)濟(jì)作物，同時(shí)被收載于中華人民共和國(guó)藥典，作為常用中藥使用，在治療咽喉炎、百日咳、急慢性氣管炎、胃腸疾病方面療效顯著。羅漢果總苷是羅漢果中主要的有效成分，具有廣泛的生物特性和藥理價(jià)值。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，羅漢果總苷不僅具有鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎、調(diào)節(jié)消化道功能之功效，還能增強(qiáng)免疫力、保肝降酶、治療急性肺損傷、抗氧化以及防衰老。羅漢果提取物的主要成分為羅漢果苷，羅漢果中的總苷為葫蘆烷型三萜苷類化合物，包括羅漢果苷v(mogrosidev)；羅漢果苷ive(mogrosideive)；羅漢果苷iiie(mogrosideiiie)；羅漢果苷iia2(mogrosideiia2)；羅漢果苷iiia1(mogrosideiiia1)；羅漢果苷iva(mogrosideiva)；羅漢果苷vi(mogrosidevi)；賽門苷i(siamenosidei)；11-o-羅漢果苷v(11-oxomogrosidev)等。天然提取的羅漢果總苷里面羅漢果苷v的含量最高，羅漢果總苷采用β-葡萄糖苷酶水解之后，根據(jù)酶解時(shí)間長(zhǎng)短可以得到含有不同羅漢果苷成分比例的提取物。羅漢果醇是羅漢果苷類化合物的苷元，可以通過(guò)酸水解得到。迄今為止，尚無(wú)羅漢果提取物在抗肺纖維化中的應(yīng)用報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種羅漢果提取物的醫(yī)藥新用途，即其可用于制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案：羅漢果提取物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。所述羅漢果提取物中羅漢果總苷的質(zhì)量百分比≥50％。優(yōu)選羅漢果總苷質(zhì)量百分比≥80％。羅漢果提取物的酶解物或水解物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。所述羅漢果提取物的酶解物或水解物中至少含有羅漢果苷iiie、羅漢果苷ive或羅漢果醇中的一種或多種。優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的酶解物中至少含有羅漢果苷iiie：優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的水解物中至少含有羅漢果醇：優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的酶解物中至少含有羅漢果苷ive：進(jìn)一步，可將羅漢果提取物或其酶解物或水解物與其他人體可接受的藥用輔料制成片劑、顆粒劑、湯劑或膠囊。進(jìn)一步，所述藥物或保健品為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物或保健品。所述藥物或保健品為能減輕炎癥程度，抑制膠原形成、保護(hù)肺組織的抗肺纖維化的藥物或保健品。所述藥物或保健品為通過(guò)抗炎及抑制肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)化而發(fā)揮抗肺纖維化的藥物或保健品。有益效果：肺纖維化是多種肺部疾病或肺損傷發(fā)展到晚期的一種常見的病理變化，臨床研究結(jié)果顯示糖皮質(zhì)激素治療肺纖維化后患者生存率無(wú)明顯改變，目前尚無(wú)明確治療藥物。本發(fā)明從傳統(tǒng)的潤(rùn)肺止咳中藥羅漢果中制備得到。目前，沒(méi)有任何研究報(bào)道羅漢果苷類成分可用于肺纖維化的治療，本發(fā)明人通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive和羅漢果苷類成分的苷元——羅漢果醇、羅漢果總苷均能顯著改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化；且羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive、羅漢果醇和羅漢果總苷均具有較好的穩(wěn)定性，可以用于制備治療相應(yīng)疾病的藥物；由此得出：羅漢果提取物具有抗肺纖維化的作用。本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自原植物，原植物分別范圍廣，成本低，提取物活性明確，具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1羅漢果總苷對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢(shì)圖。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖2羅漢果總苷對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠小鼠肺系數(shù)變化的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.001；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖3羅漢果總苷對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型各組小鼠肺組織纖維化程度的影響(masson染色)。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖4羅漢果總苷對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后第14天的肺纖維化小鼠肺組織中hyp含量的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，**p<0.01。圖5羅漢果總苷對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中α-sma蛋白表達(dá)水平的影響。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。圖6羅漢果苷iiie對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢(shì)圖。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖7羅漢果苷iiie對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠小鼠肺系數(shù)變化的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.001；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖8羅漢果苷iiie對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型各組小鼠肺組織纖維化癥程度的影響(masson染色)。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖9羅漢果苷iiie對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠肺組織中hyp含量的影響。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05。圖10羅漢果苷iiie對(duì)tgf-β1誘導(dǎo)后人肺泡ii型上皮細(xì)胞中α-sma表達(dá)量的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05。圖11羅漢果苷ive對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢(shì)圖。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖12羅漢果苷ive對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠小鼠肺系數(shù)變化的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.001；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖13羅漢果苷ive對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型各組小鼠肺纖維化程度(masson染色)的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖14羅漢果醇對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠體重變化趨勢(shì)圖。與對(duì)照組相比，#p<0.05；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。圖15羅漢果醇對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型各組小鼠肺組織肺纖維化程度(masson染色)的影響。與對(duì)照組相比，##p<0.01；與模型組相比，*p<0.05,**p<0.01；陽(yáng)性對(duì)照藥物:醋酸潑尼松。具體實(shí)施方式羅漢果提取物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明中，羅漢果提取物即羅漢果采用現(xiàn)有技術(shù)提取得到的物質(zhì)。所述羅漢果提取物中羅漢果總苷的質(zhì)量百分比≥50％。優(yōu)選羅漢果總苷質(zhì)量百分比≥80％。羅漢果提取物的酶解物或水解物在制備預(yù)防和/或治療肺纖維化疾病的藥物和/或保健品中的應(yīng)用。所述羅漢果提取物的酶解物或水解物中至少含有羅漢果苷iiie、羅漢果苷ive或羅漢果醇中的一種或多種。優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的酶解物中至少含有羅漢果苷iiie。優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的水解物中至少含有羅漢果醇。優(yōu)選的，所述的羅漢果提取物的酶解物中至少含有羅漢果苷ive。。進(jìn)一步，可將羅漢果提取物或其酶解物或水解物與其他人體可接受的藥用輔料制成片劑、顆粒劑、湯劑或膠囊。進(jìn)一步，所述藥物或保健品為降低肺纖維化組織間質(zhì)中膠原堆積量的藥物或保健品。所述藥物或保健品為能減輕炎癥程度，抑制膠原形成、保護(hù)肺組織的抗肺纖維化的藥物或保健品。所述藥物或保健品為通過(guò)抗炎及抑制肺泡上皮細(xì)胞間質(zhì)化而發(fā)揮抗肺纖維化的藥物或保健品。羅漢果總苷采用現(xiàn)有方法提取即可。本發(fā)明是經(jīng)過(guò)研究證明羅漢果總苷提取物可改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察masson染色后肺組織病理切片、測(cè)定各組肺臟系數(shù)、體重變化及在不同時(shí)期檢測(cè)各組小鼠肺組織中hyp含量及α-sma表達(dá)情況。體外實(shí)驗(yàn)考察羅漢果苷類化合物可顯著抑制lps誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞raw264.7的no釋放。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明中的羅漢果總苷提取物可改善模型小鼠肺組織纖維化程度，降低模型肺組織膠原沉積，改善上皮間質(zhì)化，顯示對(duì)小鼠肺纖維化模型的治療作用，具有可用于治療肺纖維化疾病的新醫(yī)藥用途。本發(fā)明以羅漢果總苷(實(shí)施例1)、羅漢果苷iiie(實(shí)施例2)，羅漢果苷ive(實(shí)施例3)和羅漢果醇(實(shí)施例4)為例來(lái)驗(yàn)證羅漢果提取物抗肺纖維化疾病的部分藥效學(xué)試驗(yàn)及結(jié)果。羅漢果總苷采用市售羅漢果提取物，購(gòu)自桂林萊茵生物科技股份有限公司生產(chǎn)的80％羅漢果總苷提取物(mogrosides>80％，產(chǎn)品代碼mov09)。本發(fā)明羅漢果苷iiie，羅漢果苷ive和羅漢果醇的制備：羅漢果苷iiie采用市售羅漢果提取物，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上。或參考中國(guó)專利2010105610299制備羅漢果苷ⅳ的方法，將市售羅漢果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上。羅漢果苷ive采用市售羅漢果提取物，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上?；騾⒖贾袊?guó)專利2010105610299制備羅漢果苷ⅳ的方法，將市售羅漢果提取物用β-葡萄糖苷酶水解后，經(jīng)大孔樹脂分離，高壓反相制備色譜分離得到。純度95％以上。羅漢果醇采用市售羅漢果提取物，用5％的硫酸水解，經(jīng)硅膠純化得到。純度95％以上。實(shí)施例180％羅漢果總苷提取物改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維選取桂林萊茵生物科技股份有限公司生產(chǎn)的80％羅漢果總苷提取物(即羅漢果總苷質(zhì)量占提取物總質(zhì)量80％的羅漢果提取物)(mogrosides>80％，產(chǎn)品代碼mov09)進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,是國(guó)際上普遍采用的一種方法，而且與人類肺間質(zhì)纖維化疾病相近。羅漢果總苷用于抗肺纖維化使用時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥量為50mg～100mg/kg，分別設(shè)定為羅漢果總苷-h、l組。羅漢果總苷(mogrosides)又稱為羅漢果甜苷，是藥食同源植物羅漢果的有效部位。羅漢果總苷包含了包括羅漢果苷v(mogrosidev)；羅漢果苷ive(mogrosideiv)；羅漢果苷iiie(mogrosideiiei)；羅漢果苷iia2(mogrosideiia2)；羅漢果苷iiia1(mogrosideiiia1)；羅漢果苷iva(mogrosideiva)；羅漢果苷vi(mogrosidevi)；賽門苷i(siamenosidei)；11-o-羅漢果苷v(11-oxomogrosidev)等葫蘆烷型三萜苷類化合物。1.1實(shí)驗(yàn)方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚(yáng)州比較醫(yī)學(xué)中心提供。將20只小鼠作為空白對(duì)照組(圖1中的對(duì)照組)，其他80只用來(lái)造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進(jìn)行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對(duì)照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來(lái)霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他80只小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果總苷提取物高劑量組(100mg/kg,羅漢果總苷-h)、羅漢果總苷提取物低劑量組(50mg/kg, 羅漢果總苷-l)，每組各20只?？瞻讓?duì)照組、模型組每天灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果總苷提取物分高、低劑量組，分別灌胃100mg/kg/d和50mg/kg/d，連續(xù)灌胃至第28天，于14、28天處死部分小鼠。稱體重記錄，解剖取出肺組織，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。將實(shí)驗(yàn)28天小鼠左小肺放入4％中性甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。其他肺葉分葉保存，用于hyp含量的測(cè)定。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±s.d(x±s)表示。應(yīng)用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.2.1羅漢果總苷對(duì)模型小鼠體重的影響與模型組小鼠體重相比較，實(shí)驗(yàn)第14、28天后羅漢果總苷提取物的高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果總苷在100mg/kg和50mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩肺纖維化模型小鼠體重下降程度(圖1)。1.2.2羅漢果總苷對(duì)模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量的影響博來(lái)霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細(xì)胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測(cè)14天時(shí)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量(如表1所示)。博來(lái)霉素(blm)處理后第14天小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集。與空白對(duì)照組相比較，blm組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著升高(##p<0.01)。經(jīng)羅漢果總苷高劑量(100mg/kg)處理后，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨(dú)給予blm組明顯下降(*p<0.05)。提示羅漢果總苷能夠減少blm誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的滲出。表1對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)組別細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組12.17±3.981.32±0.21blm組55.38±21.46##19.32±6.22##羅漢果總苷-h(100mg/kg)30.81±17.53**10.18±4.32*羅漢果總苷-l(50mg/kg)41.65±13.12*14.18±6.431.2.3羅漢果總苷對(duì)模型小鼠肺系數(shù)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)； 與模型組小鼠體重相比較，給藥14、21天后羅漢果總苷高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果總苷在100mg/kg和50mg/kg劑量下可不同程度的減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(圖2)。1.2.4羅漢果總苷對(duì)模型小鼠肺組織的影響取第28天肺病理組織切片經(jīng)masson染色，結(jié)果表明空白對(duì)照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出物，無(wú)成纖維細(xì)胞增生；空白對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)急成纖維細(xì)胞增生，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點(diǎn)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)藥物治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。給藥各組及陽(yáng)性藥組與模型組相比，纖維化程度均減輕(圖3)。1.2.5羅漢果總苷對(duì)模型小鼠肺組織hyp含量所產(chǎn)生的影響羥脯氨酸(hyp)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14％，對(duì)膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，由于膠原是唯一含hyp較多的蛋白質(zhì)，因此，測(cè)定hyp含量能反映組織膠原的總量變化。采用消化法檢測(cè)肺組織中hyp的含量。與空白對(duì)照組相比，28天時(shí)模型組肺組織hyp含量顯著增加(p<0.01)，與模型組相比，藥物可明顯降低肺組織中hyp含量(p<0.05)。提示羅漢果總苷在100mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化(圖4)。1.2.6羅漢果總苷對(duì)模型小鼠肺組織α-sma水平的影響肺泡上皮細(xì)胞本身就可以通過(guò)一個(gè)叫做上皮細(xì)胞一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的過(guò)程獲得間質(zhì)細(xì)胞表型而作為肺成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的重要來(lái)源。肺泡上皮間質(zhì)化被看作纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。從上皮細(xì)胞分化過(guò)來(lái)的成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞常常通過(guò)形態(tài)變化，成纖維細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞特異標(biāo)記的獲得(例如，肌動(dòng)蛋白a-sma高表達(dá))，上皮特征標(biāo)記的丟失(例如，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白〔e-cadherin和緊密連接蛋白)和這些上皮組織融為一體。采用westernblot發(fā)分析各組肺組織中α-sma表達(dá)水平。與空白對(duì)照組相比，28天時(shí)模型組肺組織hyp含量α-sma表達(dá)水平顯著增加(p<0.01)，與模型組相比，羅漢果總苷提取物可明顯降低肺組織中α-sma表達(dá)水平(p<0.05)，結(jié)果提示羅漢果總苷可降低模型肺組織α-sma表達(dá)水平，改善blm誘導(dǎo)的小鼠肺纖維程度(如圖5)。1.3討論與模型組相比，羅漢果總苷高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，肺組織中hyp含量、α-sma 表達(dá)水平(p<0.05or0.01)，且病理結(jié)果顯示羅漢果總苷的肺臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)受損及肺泡間隔增厚程度都明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，膠原纖維含量減少。與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應(yīng)，從而啟動(dòng)體內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而在給予羅漢果總苷提取物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，提示藥物可以保護(hù)肺細(xì)胞免受損傷從而防治肺纖維化。實(shí)施例2羅漢果苷iiie改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維選取上述羅漢果苷iiie進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。氣管內(nèi)注入博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型,是國(guó)際上普遍采用的一種方法，而且與人類肺間質(zhì)纖維化相近。2.1實(shí)驗(yàn)方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚(yáng)州比較醫(yī)學(xué)中心提供。將20只小鼠作為空白對(duì)照組(圖6中的對(duì)照組)，其他80只用來(lái)造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進(jìn)行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對(duì)照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來(lái)霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他80只小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果苷iiie高劑量組(50mg/kg，羅漢果苷iiie-h)、羅漢果苷iiie低劑量組(10mg/kg，羅漢果苷iiie-l)，每組各20只?？瞻讓?duì)照組、模型組每天灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果苷iiie分高、低劑量組，分別灌胃50mg/kg/d和10mg/kg/d，連續(xù)灌胃至第28天，于14、28天處死小鼠。稱體重記錄，解剖取出肺組織，冰生理鹽水洗凈，吸水紙吸干后稱重，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。將左小肺放入4％中性甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。其他肺葉分葉保存，用于hyp含量的測(cè)定。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應(yīng)用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.2.1羅漢果苷iiie對(duì)模型小鼠體重的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體重明顯下降且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、28天后羅漢果苷iiie高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑 尼松)組的體重均有明顯上升，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷iiie在20mg/kg和10mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩肺纖維化模型小鼠體重下降程度，結(jié)果如圖6所示。2.2.2羅漢果苷iiie對(duì)模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量的影響博來(lái)霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細(xì)胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細(xì)胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過(guò)各種生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過(guò)度增多。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測(cè)14天時(shí)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量(如表2所示)。博來(lái)霉素(blm)處理后第14天小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集。與空白對(duì)照組相比較，blm組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對(duì)照組相比，##p<0.01)。經(jīng)羅漢果苷iiie處理后，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨(dú)給予blm組明顯下降(與blm組相比，*p<0.05)。提示羅漢果苷iiie能夠減少blm誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的滲出。表2對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)2.2.3羅漢果苷iiie對(duì)模型小鼠肺系數(shù)的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠肺系數(shù)相比較，給藥14、28天后，羅漢果苷iiie藥物組和醋酸潑尼松組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、21天后羅漢果苷iiie高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷iiie在20mg/kg和10mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(參見圖7)。2.2.4羅漢果苷iiie對(duì)模型小鼠肺組織的影響取第28天肺病理組織切片經(jīng)masson染色，結(jié)果表明空白對(duì)照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，腔內(nèi)未見明顯滲出物，無(wú)成纖維細(xì)胞增生；空白對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小 鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)急成纖維細(xì)胞增生，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點(diǎn)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果苷iiie治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。經(jīng)陽(yáng)性藥物醋酸潑尼松治療后，陽(yáng)性組小鼠肺泡間隔較寬，肺泡腔變窄，較多成纖維細(xì)胞增生，病變程度較模型組減輕。給藥各組及陽(yáng)性藥組與模型組相比，纖維化程度均減輕(參見圖8)。2.2.5羅漢果苷iiie對(duì)模型小鼠肺組織hyp含量所產(chǎn)生的影響。羥脯氨酸(hyp)是由結(jié)締組織蛋白質(zhì)水解所得的一種氨基酸，約占膠原重量的14％，對(duì)膠原蛋白的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用，由于膠原是唯一含hyp較多的蛋白質(zhì)，因此，測(cè)定hyp含量能反映組織膠原的總量變化。采用消化法檢測(cè)肺組織中hyp的含量。與空白對(duì)照組相比，28天時(shí)模型組肺組織hyp含量顯著增加(p<0.01)，與模型組相比，藥物可明顯降低肺組織中hyp含量(p<0.05)。提示羅漢果苷iiie在50mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，羅漢果苷iiie可降低模型肺組織膠原纖維含量，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(如圖9)。2.2.6羅漢果苷iiie對(duì)tgf-β1誘導(dǎo)的人肺泡ii型上皮細(xì)胞α-sma水平的影響肺泡上皮細(xì)胞可以通過(guò)上皮細(xì)胞一間質(zhì)轉(zhuǎn)化(emt)的過(guò)程獲得間質(zhì)細(xì)胞表型而作為肺成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的重要來(lái)源。在這個(gè)新的模式中，肺泡上皮間質(zhì)化應(yīng)該被看作纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。在成熟細(xì)胞中，損傷可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，因此促成了很多器官的纖維化。從上皮細(xì)胞分化過(guò)來(lái)的成纖維細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞常常通過(guò)形態(tài)變化(例如，從立方細(xì)胞形態(tài)向長(zhǎng)條形或者梭形的改變)，成纖維細(xì)胞或肌纖維母細(xì)胞特異標(biāo)記的獲得(例如，α-sma)，上皮特征標(biāo)記的丟失(例如，上皮細(xì)胞鈣粘蛋白〔e-cadherin和緊密連接蛋白)，和這些上皮組織融為一體。通過(guò)體外試驗(yàn)，以tgf-β1誘導(dǎo)a549細(xì)胞出現(xiàn)上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(emt)，采用westernblot方法分析肌動(dòng)蛋白a-sma表達(dá)水平，探討emt過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中羅漢果苷iiie對(duì)肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究意義。本發(fā)明中將傳代培養(yǎng)2-4代的生長(zhǎng)良好的a549細(xì)胞以1×lo5傳代，分成四組，加無(wú)血清的dmem培養(yǎng)液饑餓處理12小時(shí)，使細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)水平，模型組在無(wú)血清培養(yǎng)基中加入濃度為5ng/ml的tgf-β1，陽(yáng)性藥物組和羅漢果苷iiie組(100μm)加入濃度為5ng/ml的tgf-β1,以及相應(yīng)藥物，培養(yǎng)48小時(shí)之后，在倒置顯微鏡下觀察肺上皮細(xì)胞變化，westernblot檢測(cè)tgf一β1對(duì)a549細(xì)胞上皮轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物蛋白α-sma表達(dá)影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白對(duì)照組相比，a549細(xì)胞在加入tgf-β1后，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-sma表達(dá)上調(diào)(p<0.01)，而羅漢果苷iiie在50μm濃度下可顯著抑制tgf-β1引起的α-sma(如圖10)。2.2.7討論：與模型組相比，羅漢果苷iiie高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，高劑量組的肺組織中hyp含量明顯下降(p<0.05)，且病理結(jié)果顯示羅漢果苷iiie藥物組的肺臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)受損及肺泡間隔增厚程度都明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，膠原纖維含量減少。與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應(yīng)，從而啟動(dòng)體內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，肺組織中hyp含量顯著下降，提示藥物可以保護(hù)肺細(xì)胞免受損傷從而防治肺纖維化。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅漢果苷iiie在50μm濃度可抑制tgf-β1所誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)化，降低肺成纖維母細(xì)胞標(biāo)志物α-sma。綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羅漢果苷iiie可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織炎癥及肺纖維化程度，以及肺組織中膠原蛋白的生成，并有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)因子tgf-β1所引起的人肺泡ii上皮細(xì)胞間質(zhì)化，羅漢果苷iiie具有治療肺纖維化疾病的新用途。實(shí)施例3羅漢果苷ive改善博萊霉素誘導(dǎo)引起的小鼠肺纖維選取上述羅漢果苷ive(式iv)進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。3.1實(shí)驗(yàn)方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚(yáng)州比較醫(yī)學(xué)中心提供。將20只小鼠作為空白對(duì)照組，其他80只用來(lái)造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進(jìn)行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對(duì)照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來(lái)霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉(zhuǎn)后用75％酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他80只小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果苷ive高劑量組(50mg/kg,羅漢果苷ive-h)、羅漢果苷ive低劑量組(50mg/kg,羅漢果苷ive-l)，每組各20只?？瞻讓?duì)照組、模型組每天灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃6.67mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果苷ive分高、低劑量組，兩者分別灌胃50mg/kg/d(高劑量組)和20mg/kg/d(低劑量組)，連續(xù)灌胃至第28天，稱體重記錄；于28天處死小鼠，解剖取出肺組織，計(jì)算肺系數(shù)，肺系數(shù)＝肺重(mg)/體重(g)。將左小肺放入4％中性甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應(yīng)用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1、羅漢果苷ive對(duì)肺纖維化模型小鼠體重的影響與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體重明顯下降且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，給藥14、28天后，羅漢果苷ive高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷ive在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩肺模型小鼠體重下降程度(圖11)。3.2.2、羅漢果苷ive對(duì)模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量的影響博來(lái)霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細(xì)胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細(xì)胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過(guò)各種生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過(guò)度增多。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測(cè)n14天時(shí)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量(結(jié)果如表3)。博來(lái)霉素(blm)處理后第14天小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯的聚集。與空白對(duì)照組相比較，blm組肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對(duì)照組相比，##p<0.01)。經(jīng)處理后，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨(dú)給予blm組明顯下降(與blm組相比，*p<0.05)。提示羅漢果苷ive能夠減少blm誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的滲出。表3對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)組別細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組12.26±3.741.36±0.23blm組58.93±21.47##19.26±9.65##羅漢果苷ive高劑量組(50mg/kg)30.84±16.49*3.97±3.89*3.2.3羅漢果苷ive對(duì)模型小鼠肺系數(shù)的影響造模之后的第28天測(cè)定肺系數(shù)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠肺系數(shù)相比較，羅漢果苷ive藥物組和醋酸潑尼松組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺系數(shù)明顯增高且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01或0.05)；與模型組小鼠體重相比較，羅漢果苷ive高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的肺系數(shù)均有明顯下降，具有顯著性差異(p<0.01)。提示羅漢果苷ive在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊 霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，減緩模型小鼠肺纖維化發(fā)展程度(圖12)。3.2.4羅漢果苷ive對(duì)模型小鼠肺組織的影響病理組織切片經(jīng)masson染色，結(jié)果表明空白對(duì)照組的小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔未增厚，肺泡腔透亮，無(wú)成纖維細(xì)胞增生；空白對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點(diǎn)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果苷ive治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。給藥各組及陽(yáng)性藥組與模型組相比，纖維化程度均減輕(圖13)。3.2.5、討論：與模型組相比，羅漢果苷ive高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，病理結(jié)果顯示羅漢果苷ive和羅漢果醇藥物組的肺臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應(yīng)，從而啟動(dòng)體內(nèi)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，提示藥物可以保護(hù)肺細(xì)胞免受損傷從而防治肺纖維化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羅漢果苷ive可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織炎癥及肺纖維化程度，以及肺組織中膠原蛋白的生成，羅漢果苷ive具有治療肺纖維化疾病的新用途。實(shí)施例4羅漢果醇改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維選取上述羅漢果醇(式ix)進(jìn)行下述體內(nèi)藥效學(xué)研究。4.1實(shí)驗(yàn)方法icr小鼠，雄性，體重25-30g，100只，由揚(yáng)州比較醫(yī)學(xué)中心提供。將20只小鼠作為空白對(duì)照組，其他80只用來(lái)造模，將上述所有小鼠腹腔注射4％的水合氯醛進(jìn)行麻醉，注射體積10ml/kg，小鼠麻醉后，固定小鼠，消毒小鼠頸部；用剪刀縱向剪開小鼠頸部皮膚，用鑷子縱向鈍性撕開筋膜與肌肉，暴露氣管；注射器刺入氣管，空白對(duì)照組小鼠注入生理鹽水，其余小鼠均注入博來(lái)霉素(5mg/kg)；然后迅速將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)鼠板，觀察小鼠呼吸情況，旋轉(zhuǎn)后用75％酒精棉消毒頸部傷口，縫合傷口，并在縫合處滴1-2滴青霉素注射液。將術(shù)后小鼠放回干燥潔凈的鼠籠休息，等待蘇醒，大約l-2h后蘇醒，之后正常飼養(yǎng)。造模后第7天開始，將其他小鼠隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性藥(醋酸潑尼松)組、羅漢果醇高劑量組(50mg/kg,羅漢果醇-h)、羅漢果醇低劑量組(20mg/kg,羅漢果醇-l)，每組各20只?？瞻讓?duì)照組、模型組每天灌胃生理鹽水，陽(yáng)性藥組灌胃7.0mg/kg/d醋酸潑尼松，羅漢果 醇高、低劑量組，連續(xù)灌胃至第28天，稱體重記錄。于28天處死小鼠；解剖取出肺組織，4％中性甲醛中固定，逐級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋后，常規(guī)切片，masson染色，觀察肺組織形態(tài)、肺損傷及肺纖維化程度。所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±sd(x±s)表示。應(yīng)用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析(one-wayanova)，p<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1、羅漢果醇對(duì)肺纖維化模型小鼠體重的影響與模型組小鼠體重相比較，羅漢果醇高、低劑量組和陽(yáng)性藥物(醋酸潑尼松)組的體重均有明顯上升。提示羅漢果醇在50mg/kg和20mg/kg劑量下可不同程度的改善博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化小鼠的體質(zhì)，減緩模型小鼠體重下降程度(圖14)。4.2.2、羅漢果醇對(duì)模型小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量的影響博來(lái)霉素引起的小鼠肺組織損傷，則白細(xì)胞數(shù)量增加，尤其是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起肺泡炎癥，炎癥細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)no、tnf-α等及各種細(xì)胞因子，一方面加重肺組織損傷，另一方面又通過(guò)各種生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原產(chǎn)生過(guò)度增多。本實(shí)驗(yàn)按照試劑盒的要求規(guī)范操作，比色法檢測(cè)14天時(shí)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量(結(jié)果如表4)。與空白對(duì)照組相比較，博來(lái)霉素誘導(dǎo)后模型組小鼠肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量均顯著升高(與空白對(duì)照組相比，##p<0.01)。經(jīng)羅漢果醇(50mg/kg)處理后，肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞的數(shù)量的數(shù)量較單獨(dú)給予blm組明顯下降(與blm組相比，*p<0.05)。提示羅漢果醇能夠減少blm誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞的滲出。表4對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)后小鼠支氣管肺泡灌洗液中的細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)量的影響(×104，n＝5)組別細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)空白對(duì)照組13.16±3.741.96±0.65blm組65.13±21.57##18.26±9.45##羅漢果醇高劑量組(50mg/kg)34.72±17.83**4.16±4.26**4.2.3羅漢果醇對(duì)模型小鼠肺組織的影響空白對(duì)照組小鼠的肺組織內(nèi)可見少量染成藍(lán)色的膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。模型組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增寬，大量膠原沉積，肺纖維化形成，masson染色后可見多量致密被染成藍(lán)色的膠原纖維，呈束狀或片狀沉積，基本符合肺纖維化的特點(diǎn)，則說(shuō)明實(shí)驗(yàn)小鼠肺纖維化模型制備成功。經(jīng)羅漢果醇高、低劑量(50、20mg/kg)治療后，可見小鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡間隔略增厚，成纖維細(xì)胞增生程度均比模型組輕。給藥各組與模型組相比，纖維化程度均減輕(圖15)。4.2.5、討論：與模型組相比，羅漢果醇高、低劑量組能明顯降低肺臟指數(shù)，病理結(jié)果顯示羅漢果醇藥物組的肺臟組織結(jié)構(gòu)明顯改善。與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明在模型組中博萊霉素引起炎性反應(yīng)，而在給予藥物后，小鼠炎癥及纖維化程度有不同程度的減輕，提示藥物可以保護(hù)肺細(xì)胞免受損傷從而防治肺纖維化。羅漢果醇作為葫蘆烷型四環(huán)三萜羅漢果苷類化合物的苷元，具有此類化合物結(jié)構(gòu)骨架中共同母核體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羅漢果醇可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織肺纖維化程度，預(yù)示這此類成分在制備預(yù)防或治療肺纖維化疾病藥物中的新用途。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明羅漢果提取物以及羅漢果提取物進(jìn)水解處理得到的羅漢果iiie、羅漢果ive或羅漢果醇均可改善博萊霉素小鼠肺纖維化模型中肺組織炎癥及肺纖維化程度，以及肺組織中膠原蛋白的生成，羅漢果總苷具有治療肺纖維化疾病的新用途。當(dāng)前第1頁(yè)12