本發(fā)明涉及一種環(huán)毛蚓溶栓成分的提取方法。
背景技術(shù)：
：環(huán)毛蚓屬的動物體長230-245毫米，體寬7-12毫米。背孔自第12節(jié)與第13節(jié)間開始。背面呈紫紅色或紫灰色。環(huán)帶占3節(jié)，位于第14-16節(jié)，無剛毛。體上具環(huán)生的剛毛，包括鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗環(huán)毛蚓PheretimavulgarisChen、威廉環(huán)毛蚓Pheretimaguillelmi(Michaelsen)、櫛盲環(huán)毛蚓PheretimaPectiniferaMichaelsen和湖北環(huán)毛蚓PheretimahupeienisMichaelsen1895等等。環(huán)毛蚓含地龍素(Lumbritin)、地龍解熱素(Lumbrofebrin，為酪氨酸的衍生物)、地龍毒素(Terrestro-lumbrolysim)、黃嘌呤(Xanthine)、膽堿、膽甾醇、脂肪酸類、類脂化合物、核酸衍生物、多種氨基酸、維生素類及無機(jī)鹽等物質(zhì)，具有溶栓作用。目前，以環(huán)毛蚓制備的溶栓產(chǎn)品主要有龍心素膠囊(國藥準(zhǔn)字z20049005)，其提取方法(參考中華人民共和國藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)：龍心素膠囊)：取鮮地龍(包括威廉環(huán)毛蚓等)2500g，加水適量，加入稀氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值7.8-8.2，使其溶解，于15-20℃靜置18-24小時(shí)，濾過，濾液離心，收集上清液，濃縮至相對密度為1.02-1.06(25℃)的清膏，加入醇使含醇量達(dá)72％靜置4-5小時(shí)，濾過，沉淀物40℃以下真空干燥、粉碎、加淀粉139g，混勻、過篩，裝入膠囊，制成1000粒，即得。現(xiàn)有提取工藝仍然完全有效提取環(huán)毛蚓的溶栓活性成分，有待進(jìn)一步改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種新的的環(huán)毛蚓溶栓成分提取方法。本發(fā)明環(huán)毛蚓溶栓成分的提取方法，它包括如下步驟：(1)預(yù)處理：取環(huán)毛蚓鮮品或速凍品，切斷或絞碎，加1-2倍重量的水，于36～40℃攪拌7-10h，離心，棄沉淀，收集上清液；(2)乙醇沉淀：加乙醇至濃度為73-80％，混勻，離心，收取沉淀物，干燥，即可。優(yōu)選地，乙醇沉淀之前，上清液先進(jìn)行脫色和除重金屬處理：在步驟(1)所得上清液中加入聚氯化鋁或石英砂，攪拌，離心，棄沉淀，收集上清液。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述聚氯化鋁或石英砂的加入量上清液的0.1-0.3％(w/w)。優(yōu)選地，步驟(1)中，所述環(huán)毛蚓為湖北環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓、參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓或櫛盲環(huán)毛蚓。優(yōu)選地，步驟(1)中，所述湖北環(huán)毛蚓按照如下養(yǎng)殖方法制得：a、制備養(yǎng)殖床：翻耕土地，整畦，灑水，使土壤含水量為20-30％；b、蚓種投放：放原生湖北環(huán)毛蚓300—400條/平方米，讓其自動鉆入泥土中，15-20分鐘后，去除未入土之蚓種；c、養(yǎng)殖管理：投料：每隔3天定點(diǎn)投放飼料1次，每次投料180～240g/平方米；濕度：保持土壤含水量在20-30％；溫度：日最高氣溫超過35℃時(shí)，每天灑水3-5次，每次0.1-0.2kg/平方米；冬天時(shí)，養(yǎng)殖地鋪10-20cm厚稻草墊；d、收獲：飼養(yǎng)4-6月，收取成蚓。優(yōu)選地，步驟(1)中，切斷或絞碎至長度為1-2cm。優(yōu)選地，步驟(1)中，加水的同時(shí)加入防腐劑。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述防腐劑為苯甲酸鈉，其終濃度為1-1.5‰(w/w)。優(yōu)選地，步驟(1)中，于38℃攪拌9h。優(yōu)選地，步驟(1)中，攪拌的轉(zhuǎn)速為120-180rmp，優(yōu)選地，步驟(2)中，加乙醇至濃度為75％。優(yōu)選地，步驟(2)中，混勻的方式是攪拌，攪拌的時(shí)間為10min，轉(zhuǎn)速120-180rmp。優(yōu)選地，步驟(2)中，干燥的工藝是：37～42℃下干燥25～34h。優(yōu)選地，所述干燥的工藝是：38℃干燥30h。本發(fā)明還提供了前述方法制備的提取物。本發(fā)明提取方法可以有效提取環(huán)毛蚓的溶栓成分，得到的提取物溶栓活性高于現(xiàn)有提取方法得到的提取物，臨床應(yīng)用前景良好。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明提取方法提取方法：(1)速凍的鮮青蚓，用切藥機(jī)切碎至長度為1-2cm，加1-2倍水(w/w)，同時(shí)加苯甲酸鈉1-1.5‰(w/w)，于38℃下攪拌9小時(shí)，攪拌的轉(zhuǎn)速為 120-180rmp，離心10min，離心的轉(zhuǎn)速為2500rpm，沉淀物棄去，收集上清液備用；(2)除重金屬和脫色：取上清液，加聚氯化鋁或石英砂0.1-0.3％，攪拌10min，轉(zhuǎn)速120-180rmp，離心10min，離心的轉(zhuǎn)速2500rpm，沉淀物棄去，收集離心液；(3)醇沉：將乙醇加入離心液中，使混合液乙醇濃度為75％，攪拌10min使溶液充分混勻，攪拌的轉(zhuǎn)速120-180rmp，離心10min，離心的轉(zhuǎn)速2500rpm，收取沉淀物；(4)干燥：沉淀物于38℃干燥至恒重，粉碎，加賦型物適量，混勻，得干燥粉末；(5)滅菌：密封包裝，輻射滅菌，即得。(6)性狀：氣微腥，有引濕性，含有零星深色微粒的灰白色或微黃色粉末。鮮青蚓(即湖北環(huán)毛蚓)按照如下方法制備：(一)飼料配方糞料20％，植物飼料75％，其它成分5％。1糞料組成：牛糞和豬糞各一份。(由養(yǎng)牛場和養(yǎng)豬場提供)2植物飼料組成稻草20％，玉米桿20％，蔬菜等青飼60％。(由農(nóng)戶提供)3其它成分豬血粉，玉米粉，小麥麩各1份。(由農(nóng)資市場提供)(二)飼料標(biāo)準(zhǔn)及制備方法1飼料標(biāo)準(zhǔn)：棕色或褐色、無酸臭、氨氣等異味，質(zhì)地松軟不沾手，用手抓捏，從指縫中能流出1-2滴水珠，pH值在6—8之間，重金屬含量應(yīng)符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。2飼料制備方法取糞料20％，植物飼料75％，堆料發(fā)酵。堆料植物飼料切成5cm長，先鋪地上20厘米厚，然后鋪糞料10厘米，再鋪植物飼料20厘米，糞料10厘米，直至堆到8層，占地長度和寬度不限，料堆松散，做成方形料堆，慢慢灑水，用水量50-100kg/平方米(即是50--100kg/2.4立方米)，直到四周有水浸出為止，用薄膜覆蓋保溫。發(fā)酵料堆開始自然發(fā)酵升溫，10多天后，料堆溫度達(dá)到60--70℃時(shí)，揭覆蓋膜，進(jìn)行翻堆，即上層翻到下層，四邊的翻到中間，把糞料和草料拌勻，再灑水10--20kg/平方米(即是10--20kg/2.4立方米)濕潤，再覆蓋薄膜保溫，使之充分發(fā)酵。腐熟10天后再翻堆，進(jìn)行第三次重新制堆，蓋膜。經(jīng)過一個(gè)月的堆制 發(fā)酵，得腐熟物。混合將腐熟物與上述其它成分(血粉，玉米粉，小麥麩各1份)混勻，即得。(三)鮮青蚓養(yǎng)殖步驟1養(yǎng)殖床準(zhǔn)備在蔬菜地四周挖：深40cm，寬30cm的排水溝，翻耕土地，深度30厘米，并整理成寬2米的畦，兩畦間隔40cm，在畦中央開溝，溝深30cm，溝寬30cm，在溝中放飼料，再在上面覆蓋10cm厚泥土，灑水，使土壤保持20--30％含水量。2蚓種投放先將養(yǎng)殖床灑水潤濕，使泥土潤滑，便于蚓種鉆入泥土中。在養(yǎng)殖床上放上成年種蚓，每平方300--400條，讓其自動鉆入泥土，15分鐘后，未鉆入泥土中的蚓種，不是受傷就是嚴(yán)重脫水，應(yīng)除去。注明：第一批蚓種是野外挖取的原生湖北環(huán)毛蚓成蚓?？梢栽陴B(yǎng)殖床上面種些新鮮蔬菜等農(nóng)作物，一方面有青飼料來源，另外也可為鮮青蚓生長、活動遮陰避雨。3養(yǎng)殖管理投料每隔3天定點(diǎn)投料1次。晚上約7-9點(diǎn)鐘，把飼料均勻地投放在養(yǎng)殖床的表面，每平方米投6個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)投料30—40g，雨天不投料。濕度保持土壤含水量在20-30％，若遇干燥季節(jié)，灑水調(diào)節(jié)。土壤濕度簡易測定法：取土少許，用手捏緊能成團(tuán)塊狀，而將其丟擲在地面上時(shí)，又能自行碎裂。溫度日最高氣溫超過35℃時(shí)，灑水降溫，每天灑水3-5次(之前為3次以上，請?zhí)峁┮粋€(gè)合適的范圍)，每次0.1-0.2kg/平方米。冬天時(shí)，鮮青蚓鉆入地下冬眠，養(yǎng)殖地鋪10—20cm厚稻草墊，既可保溫，又可緩解或防止冷風(fēng)直接吹到養(yǎng)殖床上。(4)養(yǎng)殖場地種植蔬菜等農(nóng)作物時(shí)，不得使用農(nóng)藥，化肥等。(5)要防止老鼠等侵襲。(四)養(yǎng)殖周期經(jīng)過4-6月的飼養(yǎng)，就可以收取成蚓，同時(shí)還有一定數(shù)量的幼蚓和蚓繭。(五)成蚓采收方法誘取法：把飼料堆放在鮮青蚓養(yǎng)殖床上，3-5天后就有蚯蚓誘集，用耙子收取成蚓，即可。收獲的成蚓即為鮮青蚓，其形態(tài)特征：體長77—220mm，體寬3—6mm，體節(jié)數(shù)110-138。雄孔1對,在18節(jié)腹面兩側(cè)的1個(gè)平頂乳頭突上，稍偏內(nèi) 側(cè)在17/18和18/19節(jié)間溝兩側(cè),各有1對大而呈橢圓形的乳頭突。受精囊孔3對，6/7～8/9節(jié)間溝后孔周圍及腹面均無乳頭突，體背面呈草綠至青灰色，背中線深綠。腹面帶青灰色，環(huán)帶土黃色。實(shí)施例2本發(fā)明提取方法的篩選試驗(yàn)1、提取方法①步驟(1)中攪拌的溫度和時(shí)間取速凍的鮮青蚓，用切藥機(jī)切碎，等量分別裝入6個(gè)帶攪拌的保溫容器，加水2倍(w/w)，加苯甲酸鈉1.5‰(w/w)，分別于室溫，36,37,38,39,40℃溫度保溫，攪拌，轉(zhuǎn)速離心10min，轉(zhuǎn)速2500rpm。從第1小時(shí)開始測定，同時(shí)分別從6個(gè)保溫容器中吸取液體20微升，測定其溶栓活性。然后每隔1小時(shí)，取樣測定，直至第11小時(shí)。②步驟(2)中乙醇的濃度取實(shí)施例1步驟(1)制得的上清液，平均分成5份，分別于常溫下加入乙醇至濃度為65,70,73,75,80％，攪拌120-180rmp×10min，離心10min，轉(zhuǎn)速2500rmp，取沉淀稱定其重量，并分別測定其溶栓活性。③步驟(3)中干燥的溫度和時(shí)間取實(shí)施例1步驟(2)制得的沉淀物，分成6份，分別置于37,38,39,40，41，42℃時(shí)的電烘箱中，全部干燥至恒重，分別測定其溶栓活性。2、溶栓活性的檢測檢測不同條件下制得的提取物的溶栓活性，檢測方法如下：標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備取蚓激酶對照品，用生理鹽水制成濃度分別為每1mL中含20000與10000蚓激酶單位的溶液(S1、S2)。供試品溶液的制備取本品適量，用生理鹽水制成活性比為2：1的供試品溶液(T2、T1)，超聲提取25min，離心，取上清液作為供試品溶液。0.5％瓊脂糖溶液的制備取瓊脂糖0.5g，置三角瓶中，加入硼砂緩沖液(取四硼酸鈉32.42g和氯化鈉5.84g，加水500ml，加熱溶解，用5mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.6)100ml，加熱煮沸，置40℃水浴中平衡，備用。纖維蛋白原溶液的制備取牛纖維蛋白原(上海生物制品所生產(chǎn))適量，用上述硼砂緩沖液制成每1ml中含2mg可凝結(jié)蛋白的溶液。凝血酶溶液的制備取牛凝血酶(上海生物制品所生產(chǎn))用上述硼砂緩沖液制成每1ml中含40單位的溶液，即得。纖維蛋白標(biāo)準(zhǔn)板的制備取已滅菌消毒的培養(yǎng)皿(直徑90mm)，吸取纖維蛋白原溶液8mL于皿中，分別快速吸取0.5％瓊脂糖溶液2mL和凝血酶 溶液0.5mL加入培養(yǎng)皿中，加蓋，充分混勻，水平放置25分鐘，即可。測定法取纖維蛋白標(biāo)準(zhǔn)板2只，用微量進(jìn)樣器吸取不同對照品溶液及供試品溶液各10uL，分別點(diǎn)于同一培養(yǎng)皿中，加蓋，置38℃培養(yǎng)箱保溫18小時(shí)，取出，用游標(biāo)卡尺測定兩垂直直徑：長徑和短徑，長徑×短徑計(jì)算面積，將溶圈面積換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計(jì)法(中國藥典二部附錄XIV)中量反應(yīng)平行線測定(2.2)法計(jì)算溶栓成分的活性。3、檢測結(jié)果①步驟(1)中攪拌的溫度和時(shí)間的檢測結(jié)果如下表1：表1樣品在不同溫度和保溫時(shí)間條件下的溶栓活性(u/20微升)測定結(jié)果表明：在36～40℃下保溫7-10h可以有效提取鮮青蚓的溶栓活性成分，其中，提取最佳溫度為38℃，最佳保溫時(shí)間為9小時(shí)。②步驟(2)中乙醇的濃度檢測結(jié)果如下表2：表2鮮青蚓醇沉過程中乙醇濃度對溶栓活性成分收率及溶栓活性影響乙醇濃度％6570737580溶栓物濕重g1442525554溶栓活性u/mg974513742139381455414359測定結(jié)果表明：乙醇濃度大于73-80％時(shí)，溶栓活性和溶栓活性成分收率都比較高。其中，乙醇濃度為75％時(shí)，溶栓成分和活性收率都最高。③步驟(3)中干燥的溫度和時(shí)間的檢測結(jié)果如下表3：表3干燥溫度和時(shí)間對溶栓活性成分的影響測定結(jié)果表明：37～42℃下干燥25～34h干燥條件下，溶栓活性較高，其中，干燥溫度于38℃時(shí)，干燥時(shí)間為30小時(shí)，溶栓物活性最高，穩(wěn)定也最好。實(shí)施例3本發(fā)明提取方法1、提取方法：(1)取威廉環(huán)毛蚓(購自藥材市場)，用切藥機(jī)切碎，加水1-2倍(w/w)，同時(shí)加苯甲酸鈉1-1.5‰(w/w)，38℃下攪拌9小時(shí)，轉(zhuǎn)速120-180rmp，離心10min，轉(zhuǎn)速2500rpm，沉淀?xiàng)壢?，收集上清液備用?2)除重金屬和脫色：取上清液，加聚氯化鋁或石英砂0.1-0.3％，攪拌120-180rmp，離心10min，轉(zhuǎn)速2500rpm，沉淀?xiàng)壢?，收集離心液；(3)醇沉：將乙醇加入離心液中，使混合液乙醇濃度為75％，攪拌10min使溶液充分混勻，轉(zhuǎn)速120-180rmp，離心10min，轉(zhuǎn)速2500rpm，收取沉淀物；(4)干燥：沉淀物于38℃下干燥至恒重，粉碎過篩，加賦型物適量，混勻，得干燥粉末；(5)滅菌：密封包裝，輻射滅菌，即得。(6)性狀：氣微腥，有引濕性，含有零星深色微粒的灰白色或微黃色粉末。實(shí)施例4本發(fā)明提取方法的篩選試驗(yàn)1、提取方法①步驟(1)中攪拌的溫度和時(shí)間取威廉環(huán)毛蚓，用切藥機(jī)切碎，等量分別裝入6個(gè)帶攪拌的保溫容器，加苯甲酸鈉1-1.5‰，分別于室溫，36,37,38,39,40℃溫度保溫，同時(shí)攪拌，轉(zhuǎn)速120-180rmp。從第1小時(shí)開始測定，同時(shí)從6個(gè)保溫容器中吸取液體20微升，測定其溶栓活性。然后每隔1小時(shí)，取樣測定，直至第11小時(shí)。②步驟(2)中乙醇的濃度取實(shí)施例3步驟(1)制得的上清液，5升，平均分成5份，分別于常溫下加入乙醇(95％)至60,65,70,75,80％，攪拌120-180rmp×10min，離心10min，轉(zhuǎn)速2500rpm以上，取沉淀稱定其重量，并測定其溶栓活性。2、溶栓活性的檢測同實(shí)施例2。3、檢測結(jié)果①步驟(1)中攪拌的溫度和時(shí)間的檢測結(jié)果如下表4：表4樣品在不同溫度和保溫時(shí)間條件下的溶栓活性(u/20微升)測定結(jié)果表明：在36～40℃下保溫7-10h可以有效提取威廉環(huán)毛蚓的溶栓活性成分，其中，保溫最佳溫度為38℃，最佳保溫時(shí)間為9小時(shí)。②步驟(2)中乙醇的濃度檢測結(jié)果如下表5：表5威廉環(huán)毛蚓醇沉濃度對溶栓活性成分收率及活性影響乙醇濃度％6570737580溶栓物濕重g1238485252溶栓活性u/mg904514024148261574214753測定結(jié)果表明：乙醇濃度大于70％時(shí)，溶栓活性和溶栓活性成分收率都比較高。其中，乙醇濃度75％時(shí)，溶栓活性和溶栓活性成分收率都比最高。以下用試驗(yàn)例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明的有益效果：試驗(yàn)例1“鮮青蚓溶栓物”藥效學(xué)試驗(yàn)鮮青蚓溶栓物：實(shí)施例1制備的提取物。1、溶解試驗(yàn)家兔肺血栓試驗(yàn)參照Nowak法稍加改良，將家兔隨機(jī)分成“溶栓物”(提取物)高，低劑量組，陽性藥物“龍心素膠囊”組(云南永安制藥提供，國藥準(zhǔn)字z20049005)，生理鹽水對照組。用戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉。從頸總動脈采血1ml，按稍加機(jī)良的Chandle法制備血栓，自血栓頭部向下截取30mg左右的栓子，依文氏藍(lán)染色后備用。各組于灌胃給藥后1小時(shí)后，以10ml生理鹽水在1分鐘內(nèi)經(jīng)頸外靜脈將栓子推入肺動脈內(nèi)，24小時(shí)后殺死動物，取出栓子稱重，與原栓重進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。表6溶解試驗(yàn)家兔肺血栓試驗(yàn)結(jié)果(X±SD)由表6可以看出，本發(fā)明方法制得的提取物高劑量組(正常人用藥量4倍/日),低劑量組(正常人用藥量2倍/日)，“龍心素”組(正常人用藥量4倍/日)血栓減重均比生理鹽水對照組明顯(p<0.05)；而且與龍心素組相比，本發(fā)明提取物在相同劑量下的溶栓率明顯更高，提高率為18.9％。結(jié)論：本發(fā)明方法制得的提取物“鮮青蚓溶栓物”有顯著的體內(nèi)溶栓功效，其溶栓功明顯優(yōu)于“龍心素膠囊”(國藥準(zhǔn)字z40049005)。2溶解血纖維蛋白原試驗(yàn)試驗(yàn)家兔灌胃給藥60mg/kg，5小時(shí)后測定血漿纖維蛋白原含量，再用“3P試驗(yàn)”測定裂解產(chǎn)物，結(jié)果如下表7：表7“鮮青蚓溶栓物”溶解血纖維蛋白原試驗(yàn)結(jié)果(X+SD)結(jié)論：本發(fā)明方法制得的提取物“鮮青蚓溶栓物”具有顯著的溶解纖維蛋白原的作用。3體外溶解血栓試驗(yàn)參照Chandler法稍加改良，先取1只家兔用戊巴比妥納30mg/kg靜脈麻醉后，分離出頸總動脈，用干燥注射器自動脈取血2ml,均分于兩個(gè)管環(huán)內(nèi)，血液在37℃環(huán)境中，17r/min旋轉(zhuǎn)30min，按拉丁方法設(shè)計(jì)的給藥順序分別向每根環(huán)的兩端各加藥2ml，再轉(zhuǎn)動60min，自環(huán)內(nèi)傾出血栓，立即稱重。按上述步驟再取血作其余兩組。然后取兔五只重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表8。表8“鮮青蚓溶栓物”體外溶解血栓試驗(yàn)結(jié)果(X+SD)由表8可以看出，“溶栓物”高、低劑量組，“龍心素膠囊”組(云南永安制藥提供(國藥準(zhǔn)字z20049005)的血栓濕重均較生理鹽水組輕(p<0.05)；而且與龍心素組相比，本發(fā)明提取物在相同劑量下的溶栓率明顯更高，提高率為13.2％。結(jié)論：本發(fā)明方法制得的提取物“鮮青蚓溶栓物”具有顯著的體外溶栓活性，且藥效明顯優(yōu)于“龍心素膠囊”(國藥準(zhǔn)字z20049005)。試驗(yàn)例2“威廉蚯溶栓物”藥效學(xué)試驗(yàn)威廉蚯溶栓物：實(shí)施例3制備的提取物。1溶解試驗(yàn)家兔肺血栓試驗(yàn)參照Nowak法稍加改良，將家兔隨機(jī)分成“溶栓物”高，低劑量組，陽性藥物“龍心素膠囊”組(云南永安制藥提供，國藥準(zhǔn)字z20049005)，生理鹽水對照組。用戊巴比妥鈉30mg/kg靜脈麻醉。從頸總動脈采血1ml，按稍加機(jī)良的Chandle法制備血栓，自血栓頭部向下截取30mg左右的栓子，依文氏藍(lán)染色后備用。各組于灌胃給藥后1小時(shí)后，以10ml生理鹽水在1分鐘內(nèi)經(jīng)頸外靜脈將栓子推入肺動脈內(nèi)，24小時(shí)后殺死動物，取出栓子稱重，與原栓重進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。表9“威廉蚯溶栓物”溶解試驗(yàn)家兔肺血栓試驗(yàn)結(jié)果(X±SD)由表9可以看出，本發(fā)明方法制得的提取物高劑量組(正常人用藥量4倍/日),低劑量組(正常人用藥量2倍/日)，“龍心素”組(正常人用藥量4倍/日)血栓減重均比生理鹽水對照組明顯(p<0.05)；而且與龍心素組相比，本發(fā)明提取物在相同劑量下的溶栓率明顯更高，提高率為12.5％。結(jié)論：本發(fā)明方法制得的提取物“威廉蚯溶栓物”有顯著的體內(nèi)溶栓功效，其溶栓功明顯優(yōu)于“龍心素膠囊”(國藥準(zhǔn)字z40049005)。2溶解血纖維蛋白原試驗(yàn)試驗(yàn)家兔灌胃給藥60mg/kg，5小時(shí)后測定血漿纖維蛋白原含量，再用“3P試驗(yàn)”測定裂解產(chǎn)物，結(jié)果如下：表10“威廉蚯溶栓物”溶解血纖維蛋白原試驗(yàn)結(jié)果(X+SD)結(jié)論：“威廉蚯溶栓物”具有顯著的溶解纖維蛋白原的作用。3體外溶解血栓試驗(yàn)參照Chandler法稍加改良，先取1只家兔用戊巴比妥納30mg/kg靜脈麻醉后，分離出頸總動脈，用干燥注射器自動脈取血2ml,均分于兩個(gè)管環(huán)內(nèi)，血液在37℃環(huán)境中，17r/min旋轉(zhuǎn)30min，按拉丁方法設(shè)計(jì)的給藥順序分別向每根環(huán)的兩端各加藥2ml，再轉(zhuǎn)動60min，自環(huán)內(nèi)傾出血栓，立即稱重。按上述步驟再取血作其余兩組。然后取兔五只重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表。表11“威廉蚯溶栓物”體外溶解血栓試驗(yàn)結(jié)果(X+SD)由表8可以看出，“威廉蚯溶栓物”高、低劑量組，“龍心素膠囊”組(云南永安制藥提供(國藥準(zhǔn)字z20049005)的血栓濕重均較生理鹽水組輕(p<0.05)；而且與龍心素組相比，本發(fā)明提取物在相同劑量下的溶栓率明顯更高，提高率為7.4％。結(jié)論：本發(fā)明方法制得的提取物“威廉蚯溶栓物”具有顯著的體外溶栓活性，且藥效明顯優(yōu)于“龍心素膠囊”(國藥準(zhǔn)字z20049005)。綜上，本發(fā)明提取方法可以有效提取環(huán)毛蚓的溶栓成分，得到的提取物溶栓活性高于市售產(chǎn)品“龍心素膠囊”，臨床應(yīng)用前景良好。當(dāng)前第1頁1 2 3