本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及通佐溴胺在制備能夠阻斷p97與Npl4的相互作用的抑制劑中的用途。
背景技術(shù)：
：病毒感染能夠引起機(jī)體強(qiáng)烈的抗病毒免疫反應(yīng)，天然免疫是機(jī)體抵抗病毒感染的第一道屏障，通過機(jī)體內(nèi)的病原識(shí)別受體，包括toll樣受體(TLR)、RIG-I樣受體(RLRs)可以識(shí)別病毒核酸。被激活的受體可以啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子IRF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生一系列促炎癥細(xì)胞因子和I型干擾素(typeIinterferons,typeIIFN)。I型干擾素的釋放能夠促進(jìn)下游基因的轉(zhuǎn)錄從而有效的抑制病毒的進(jìn)一步復(fù)制。同時(shí)，I型干擾素的分泌還能夠激活包括樹突狀細(xì)胞，NK細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在內(nèi)的參與固有免疫應(yīng)答的細(xì)胞。此外，I型干擾素的分泌也能夠直接激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)。天然免疫的精確調(diào)控對(duì)于抗病毒感染以及防止自身免疫疾病的感染或機(jī)體產(chǎn)生免疫炎癥都至關(guān)重要。泛素化是RLR受體介導(dǎo)信號(hào)通路的主要調(diào)控方式，以其代表性受體RIG-I為例，結(jié)合病毒RNA激活RIG-I產(chǎn)生構(gòu)象變化，招募泛素連接酶，使RIG-I發(fā)生K63鏈泛素化，激活下游NF-κB以及IRF3的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)促炎因子及I型干擾素的表達(dá)，增強(qiáng)其抗病毒活性。另一方面，泛素連接酶c-Cbl及RNF125使RIG-I發(fā)生K48鏈泛素化，終止該通路的免疫反應(yīng)，抑制其抗病毒活性。p97屬于II型ATP酶家族，它參與包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體參與的蛋白降解，自噬，細(xì)胞膜重組，DNA修復(fù)，細(xì)胞周期以及性別決定等一系列的生理過程。p97與其輔助因子Npl4，Ufd1，p47，UBXD7以及FAF1結(jié)合，并利用其分離酶的活性將底物從其細(xì)胞環(huán)境中剝離，最終多數(shù)進(jìn)入蛋白酶體降解。已有的研究表明p97與其輔因子Npl4組成復(fù)合物參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體降解途徑等一系列生理過程，p97-Npl4復(fù)合物能夠通過介導(dǎo)IκBα的降解來(lái)促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。近來(lái)也有研究發(fā)現(xiàn)p97參與TRIM21介導(dǎo)的病毒中和作用。通佐溴銨(thonzoniumbromide),CAS編號(hào)553-08-2，分子式:C32H55N4O+.Br-，為單陽(yáng)離子去垢劑。目前已知其生物學(xué)功能包括用于包被非病毒載體，作為潛在的、用于人 類基因治療的、安全的基因投遞方式；酸化酵母細(xì)胞質(zhì)，抑制液胞膜上ATP依賴的質(zhì)子泵，破壞V-ATPase的功能，引起pH敏感導(dǎo)致的酵母細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷。但是現(xiàn)有技術(shù)中并未見p97在病毒感染免疫中的作用。與此同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中，也未曾報(bào)道通佐溴胺(ThonzoniumBromide，CAS編號(hào)為553-08-2)在在病毒感染免疫中的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于公開通佐溴胺在制備能夠阻斷p97與Npl4的相互作用的抑制劑中的用途。p97基因的核苷酸序列在Genebank中序列號(hào)為NM_007126.3的序列。本發(fā)明通過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，通佐溴胺能夠有效阻斷p97與輔助因子Npl4之間的相互作用，抑制RNF125介導(dǎo)的RIG-I的K48鏈泛素化，進(jìn)而抑制RIG-I降解，從而促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFNβ信號(hào)通路，最終起到提高抗病毒感染能力的作用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供了通佐溴胺在制備能夠阻斷p97與Npl4的相互作用的抑制劑中的用途。優(yōu)選的，所述抑制劑能夠抑制RNF-125介導(dǎo)的RIG-I的K48鏈泛素化。優(yōu)選的，所述抑制劑能夠抑制RIG-I的蛋白酶體降解。優(yōu)選的，所述抑制劑能夠促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFNβ信號(hào)通路。優(yōu)選的，所述抑制劑能夠起到提高抗病毒感染能力進(jìn)而起到治療病毒感染的作用。進(jìn)一步的，本發(fā)明的第二方面，提供了通佐溴胺在制備治療病毒感染的藥物組合物中的用途。優(yōu)選的，所述病毒感染為RNA病毒感染。更優(yōu)選的，所述病毒感染為VSV病毒感染或SeV病毒感染。優(yōu)選的，所述通佐溴胺為所述治療病毒感染的藥物組合物的藥效成分之一。更優(yōu)選的，所述通佐溴胺為所述治療病毒感染的藥物組合物的唯一藥效成分。優(yōu)選的，所述通佐溴胺是通過促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFNβ信號(hào)通路從而提高抗病毒感染能力進(jìn)而起到治療病毒感染的作用的。優(yōu)選的，所述通佐溴胺是通過抑制RIG-I的蛋白酶體降解從而起到促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFNβ信號(hào)通路的作用的。優(yōu)選的，所述通佐溴胺是通過抑制RNF-125介導(dǎo)RIG-I的K48鏈泛素化從而起到抑制RIG-I的蛋白酶體降解的作用的。優(yōu)選的，所述通佐溴胺是通過抑制RNF125與RIG-I之間的相互作用從而起到抑制RNF-125介導(dǎo)的RIG-I的K48鏈泛素化的作用的。優(yōu)選的，所述通佐溴胺是通過阻斷p97與Npl4的相互作用來(lái)抑制p97-Npl4復(fù)合物的形成，進(jìn)而抑制RNF125與RIG-I之間的相互作用的。進(jìn)一步的，治療病毒感染的藥物組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。術(shù)語(yǔ)“包含”指“含有”和“由﹍構(gòu)成”，例如“包含”X的組合物可以完全由X構(gòu)成，或者可以含有X之外的物質(zhì)，例如X-Y。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”指治療劑治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或狀況的量，或是表現(xiàn)出可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果的量。該效果例如可通過化學(xué)標(biāo)記或抗原水平來(lái)檢測(cè)。治療效果也包括生理性癥狀的減輕。對(duì)于某一對(duì)象的精確有效劑量取決于該對(duì)象的體型和健康狀況，病癥的性質(zhì)或程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預(yù)先指定準(zhǔn)確的有效量是沒用的。然而，對(duì)于某給定的癥狀而言，可以用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定該有效量，臨床醫(yī)師是能夠判斷出來(lái)的。所述藥學(xué)上可接受的賦形劑(或運(yùn)載體)指用于治療劑給藥的賦形劑，其本身及其用量不應(yīng)誘導(dǎo)接受該組合物的個(gè)體產(chǎn)生有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。藥學(xué)上可接受的賦形劑通常包括無(wú)毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包裹材料或任何常規(guī)類型的制劑輔助物。合適的賦形劑包括但不僅限于水、葡萄糖、甘油、鹽水、乙醇或其組合。所述賦形劑還包含有其他試劑如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑或增強(qiáng)制劑效力的佐劑。其他材料如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑和類似試劑可根據(jù)需要添加。脂質(zhì)體也包括在藥學(xué)上可接受的賦形劑的定義中。通常，可將藥物組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸浮液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，通佐溴胺能夠有效阻斷p97與Npl4的相互作用，促進(jìn)RIG-I介導(dǎo)的IFNβ信號(hào)通路從而提高抗病毒感染能力進(jìn)而起到治療病毒感染的作用，極具臨床和市場(chǎng)價(jià)值。附圖說明圖1.p97通過其ATP酶活性抑制IFNβ介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。(A)HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p97小干擾RNA或?qū)φ誖NA，SeV刺激12h后，IFNβ(左)，PRDIII-I(中)以及ISRE(右)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性。(B)在p97敲除的細(xì)胞中，SeV刺激后，IFNB(左)，RANTES(中)以及ISG56(右)的轉(zhuǎn)錄水平。(C-D)p97敲除的細(xì)胞中，poly(I:C)，poly(dA:dT)，SeV或VSV-GFP處理后報(bào)告基因(C)以及Q-PCR(D)的結(jié)果。(E-F)轉(zhuǎn)染了p97小干擾RNA的MEF細(xì)胞感染VSV-GFP病毒后，熒光相差顯微鏡檢測(cè)(E)以及細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果(F)。(G-H)p97敲除細(xì)胞感染SeV后，以p97或其突變體進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)IFNβ轉(zhuǎn)錄激活(G)以及IFNB的轉(zhuǎn)錄水平(H)。n.c.,表示對(duì)照siRNA；scr,表示對(duì)照shRNA；WT,野生型；PH,相差顯微檢測(cè)；FL,熒光顯微檢測(cè)(下同)。數(shù)據(jù)分析采用：標(biāo)準(zhǔn)誤(三次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差)，方差分析以及t-test。n.s.,無(wú)顯著變化；*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001。圖2.Npl4協(xié)同p97抑制IFNβ介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。(A-B)轉(zhuǎn)染了不同siRNA的細(xì)胞感染SeV后IFNβ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(A)IFNB的轉(zhuǎn)錄水平(B)。(C-D)轉(zhuǎn)染了不同劑量Npl4的細(xì)胞感染SeV后IFNβ(左)以及ISRE(右)啟動(dòng)子的報(bào)告基因的活性(C)以及IFNB(左)以及ISG56(右)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。(E-F)Npl4敲除的細(xì)胞中，SeV刺激后，報(bào)告基因(E)以及Q-PCR(F)的檢測(cè)。(G)Npl4敲除的MEF細(xì)胞，感染VSV-GFP后的rescue實(shí)驗(yàn)。(H)敲除p97的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后，IFNβ轉(zhuǎn)錄活性以及IFNB轉(zhuǎn)錄水平。圖3.p97-Npl4復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及突變分析。(A)Npl4及p97的結(jié)構(gòu)域示意圖。(B)果蠅Ter94-Npl4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。相互作用界面上的殘基以球-棒模型突出顯示，括號(hào)中表示與果蠅該位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的人源的氨基酸。(C)p97(左)-Npl4(右)相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。(D)帶有Strep標(biāo)簽的Npl4pulldown不同的p97突變體。(E)帶有His標(biāo)簽的p97pulldown不同的Npl4突變體。(F)Npl4與p97或p973A突變體的免疫共沉淀。(G)p97與Npl4或Npl44A突變體的免疫共沉淀。(H-I)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的細(xì)胞中IFNβ的轉(zhuǎn)錄活性(H)以及IFNB轉(zhuǎn)錄水平(I)。3A代表p97-F52A/D55A/Y110A突變體；4A代表Npl4-I6A/R8A/R17A/R50A突變體。圖4.p97-Npl4復(fù)合物促進(jìn)RIG-I通過蛋白酶體降解抑制RIG-I信號(hào)通路。(A)poly(I:C)刺激p97敲除細(xì)胞后不同時(shí)間，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析RIG-I、MAVS、IRF3以及IRF3磷酸化。(B)poly(I:C)刺激過表達(dá)Npl4的細(xì)胞不同時(shí)間，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析蛋白表達(dá)水平。(C)poly(I:C)刺激沉默Npl4表達(dá)的細(xì)胞不同時(shí)間，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析RIG-I，MAVS，p-TBK1，TBK1，IKKε，IRF3以及IRF3磷酸化水平。(D)MG132處理p97敲除 的細(xì)胞中過表達(dá)p97后，RIG-I的蛋白水平。(E)MG132處理細(xì)胞后過表達(dá)Npl4后RIG-I的蛋白水平。(F-G)敲除p97(F)敲除Npl4(G)的細(xì)胞SeV刺激后，RIG-I的泛素化水平。(H)敲除p97的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p97野生型以及3A突變體后，RIG-I的泛素化水平。(I)轉(zhuǎn)染了Npl4野生型以及4A突變體的細(xì)胞中，RIG-I的泛素化水平。圖5.RNF125對(duì)于p97-Npl4復(fù)合物抑制RIG-I信號(hào)通路是必須的。(A)HEK293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染對(duì)照組，敲除RNF125，敲除c-Cbl，或不同劑量的Npl4，在SeV刺激后，IFNβ熒光素酶報(bào)告基因的活性。(B)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同的RIG-ICARD結(jié)構(gòu)域以及對(duì)照，敲除RNF125或敲除c-Cbl以及不同劑量的Npl4后，IFNβ熒光素酶報(bào)告基因的活性。(C)敲除RNF125的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染Npl4的情況下，RIG-I的蛋白水平。(D)共轉(zhuǎn)染Npl4與RNF125的細(xì)胞，SeV刺激后，RIG-I的泛素化水平。(E)SeV感染的細(xì)胞轉(zhuǎn)染Npl4、RNF125后。(F)共轉(zhuǎn)染RNF125以及HA-K48Ub后RIG-I泛素化位點(diǎn)的質(zhì)譜分析。(G)共轉(zhuǎn)染或分別轉(zhuǎn)染Npl4、RNF125細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染野生型或突變體RIG-I后，RIG-I的免疫印跡分析。(H)共轉(zhuǎn)染Npl4與RNF125的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染野生型或突變體RIG-I后，RIG-I的泛素化水平。(I)共轉(zhuǎn)染Npl4與RNF125的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染野生型或突變體RIG-I后，IFNβ轉(zhuǎn)錄活性。(J)敲除Npl4以及RNF125的細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染RIG-I或其突變體后，VSV-GFP病毒感染細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察結(jié)果。圖6.p97-Npl4復(fù)合物與RIG-I及RNF125相互作用。(A)SeV刺激及未SeV刺激情況下，細(xì)胞內(nèi)Npl4與RIG-I免疫共沉淀。(B)SeV刺激及未SeV刺激情況下，Npl4與RIG-I的共定位。(C)體外pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證Npl4與RIG-I的相互作用。(D-E)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Npl4與RIG-I相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。(F)體外pulldown實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Npl4與RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域的相互作用。(G)SeV刺激及未SeV刺激情況下，細(xì)胞內(nèi)p97與RNF-125的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。(H)體外pulldown實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p97與RNF125的相互作用。(I)體外pulldown實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p97-Npl4復(fù)合物對(duì)RIG-I與RNF125相互作用的影響。圖7.pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小分子化合物破壞p97-Npl4相互作用。具體實(shí)施方式在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍?？蓮腉enebank獲得人p97基因的核苷酸序列(NM_007126.3)及其氨基酸序列 (NP_009057.1)。本文中同源基因指種間同源基因，不同物種中起源于一個(gè)共同的祖先基因的一些同源基因，這些基因通常保持相同的或相似的功能。根據(jù)NCBI網(wǎng)站BLAST的結(jié)果，人p97的同源基因包括小鼠VCP基因(NM_009503.4)和果蠅TEAR94基因(NM_001103780.2)?；蛘?，可以“同源性”來(lái)定義本申請(qǐng)的同源基因。“同源性”指兩條多核苷酸或兩條多肽部分之間的相似性百分?jǐn)?shù)。兩條DNA或兩條多肽序列在確定的分子長(zhǎng)度內(nèi)，當(dāng)序列顯示有至少約50％，優(yōu)選至少約為75％、更佳至少約為80-85％、尤其佳至少約為90％、最佳至少約為95-98％序列相似性時(shí)，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指與特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。基本實(shí)驗(yàn)方法：1.目的基因的克?。横槍?duì)所需的目的基因設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法將該目的基因從包含此目的基因的質(zhì)?；騂ela細(xì)胞的cDNA中克隆出來(lái)，目的基因片段兩邊帶有兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)。用瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小是否與所需的目的基因大小一致，并利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)該片段進(jìn)行回收。在膠回收產(chǎn)物中加入與PCR產(chǎn)物兩邊酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的酶以及合適的buffer進(jìn)行雙酶切，37℃孵育過夜。同時(shí)，用相同的酶雙酶切該片段所要連接的載體。利用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)酶切后的片段進(jìn)行回收，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)酶切后的載體進(jìn)行回收，然后用T4連接酶將片段與載體連接起來(lái)，并將該連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α。利用抗性篩選，驗(yàn)證及測(cè)序獲得目的基因的克隆。2.質(zhì)粒的定點(diǎn)突變：在突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)一對(duì)引物，這兩條引物的5’端有15-20bp的反向互補(bǔ)區(qū)域，突變位點(diǎn)應(yīng)位于此反向互補(bǔ)區(qū)域的中間。3’端的非互補(bǔ)區(qū)域的大小至少為10bp。利用這一對(duì)引物，通過PCR的方法將質(zhì)粒進(jìn)行反向PCR擴(kuò)增。利用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行回收，在回收產(chǎn)物中加入DpnI，37℃孵育2h，將甲基化的質(zhì)粒模板去除。然后，將DpnI處理之后的樣品直接轉(zhuǎn)化DH5α。利用抗性篩選及測(cè)序獲得目的基因的克隆。3.蛋白的表達(dá)與純化：取原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，37℃培養(yǎng)12h。先進(jìn)行接種，即挑克隆到7.5ml含有抗生素的LB培養(yǎng)基中，于37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)10-12h。然后再擴(kuò)大培養(yǎng)，即將上述7.5ml菌液全部加入750ml含抗生素的TB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8(約3-4h)。此時(shí)，將搖床溫度調(diào)節(jié)至16℃，待菌液完全降溫至16℃后，按照1:2000的比例加入IPTG(終濃度為0.4mM)，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)16-18h。最后用Beckman的高速冷凍離心機(jī)收集菌體，即4℃，6000rpm離心10min，棄盡上清，將菌體稱重后進(jìn)行 蛋白質(zhì)純化或保存于-80℃。(1)Ni柱親和層析：Lysisbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,20mMimidazole,1mMDTT；Washbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,40mMimidazole,1mMDTT；Elutionbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,500mMimidazole,1mMDTT；取適量的beads灌入層析柱中，用大量的ddH2O沖洗beads，一般為10CV×5(CV代表柱體積，下同)。用Lysisbuffer進(jìn)行平衡：10CV×5。將平衡好的beads移入菌體破碎后得到的上清中，在4℃冷庫(kù)Mix1-2h。500g，4℃離心2min，收集上清和流穿液。加入50mlWashbuffer，500g，4℃離心2min，收集上清和wash1。重復(fù)兩次，收集的上清分別為wash2和wash3。將beads灌入層析柱中，繼續(xù)用Washbuffer洗一次。用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×10，用EP管分別收集洗脫液。SDS-PAGE電泳鑒定。(2)MBP柱親和層析：Lysisbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,1mMDTT；Washbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,1mMDTT；Elutionbuffer:20mMHEPESpH7.0,500mMNaCl,10mMamylose,1mMDTT；取適量的beads灌入層析柱中，用大量的ddH2O沖洗beads，一般為10CV×5(CV代表柱體積，下同)。用Lysisbuffer進(jìn)行平衡：10CV×5。將平衡好的beads移入菌體破碎后得到的上清中，在4℃冷庫(kù)Mix1-2h。500g，4℃離心2min，收集上清和流穿液。加入50mlWashbuffer，500g，4℃離心2min，重復(fù)兩次，。將beads灌入層析柱中，繼續(xù)用Washbuffer洗一次。用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×10，用EP管分別收集洗脫液。SDS-PAGE電泳鑒定。(3)StrepTactin柱親和層析：Lysisbuffer/Washbuffer:100mMTrispH8.0,150mMNaCl,10mMβ-ME；Elutionbuffer:100mMTrispH8.0,150mMNaCl,2.5mMdesthiobiotin,10mMβ-ME；取適量的beads灌入層析中。用Lysisbuffer進(jìn)行平衡：10CV×5。將破碎后的上清灌入裝有beads的層析柱中，控制流速為1滴/2s，收集流穿液，再重復(fù)上樣一次。用Washbuffer沖洗：10CV×5，收集washes。用Elutionbuffer洗脫：0.5CV×6，用EP管分別收集洗脫液。SDS-PAGE電泳鑒定。(4)凝膠過濾層析(Superdex75/200)：Buffer:20mMHEPESpH7.0,100mMNaCl,1mMDTT；ddH2O沖洗2CV:流速:1ml/min,壓力上限:0.3MPa(下同)。Buffer平衡2CV。樣品離 心：12000rpm,4℃離心40min。沖洗上樣環(huán):ddH2O洗5個(gè)體積，Buffer洗5個(gè)體積。上樣：用注射器上樣，一定要排盡注射器里的氣泡。Buffer洗脫約40min后，開始注意觀察紫外吸收峰的出現(xiàn)，一旦出峰立即開始收集。樣品收集完畢后，繼續(xù)用Bindingbuffer沖洗直到紫外吸收基線水平。ddH2O沖洗2CV。20％乙醇沖洗2CV后暫停，關(guān)閉儀器。(5)親和標(biāo)簽的去除(TEV酶切)：將Ni柱親和層析之后的樣品脫鹽到Lysisbuffer中。測(cè)定洗脫液中蛋白的濃度，并根據(jù)體積估算出目的蛋白的總量。以TEV與目的蛋白的質(zhì)量比為1:15的比例在eluates中加入足量的TEV，室溫酶切2小時(shí)。將酶切后的樣品回掛Ni柱，收集流出的流穿液，除去被切下的His標(biāo)簽和加入的TEV酶。4.晶體結(jié)構(gòu)的解析：采用單波長(zhǎng)反常散射法(Singlewavelengthanomalousdispersion,SAD)對(duì)Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。利用在硒的反常散射波長(zhǎng)下收集得到的衍射數(shù)據(jù)，通過Phenix軟件包中AutoSol程序的解析得到衍射相位。然后，采用COOT軟件進(jìn)行模型的建立，利用Phenix中的Refinement和CCP4中的Refmac5進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修正。5.Pull-down實(shí)驗(yàn)：取所需量的親和層析beads，用適量pull-downbuffer洗3次。按照摩爾比為1:1的比例混合兩個(gè)用于pull-down的蛋白，并用pull-downbuffer將混合好的蛋白溶液的終體積定容到500μl。在此蛋白混合液中加入20μl預(yù)處理過的親和層析beads，在4℃冷庫(kù)的旋轉(zhuǎn)混合儀上緩慢旋轉(zhuǎn)孵育2h。在4℃以500g的速度離心2min，將親和層析beads離心至EP管底，棄盡上清。加入1mlpull-downbuffer清洗beads，在4℃以500g的速度離心2min，棄盡上清。重復(fù)清洗兩次。加入40μlelutionbuffer進(jìn)行洗脫，將結(jié)合在beads上的蛋白洗脫下來(lái)。在eluates中加入10μl的5×SDS上樣緩沖液，100℃變性10min。利用SDS-PAGE分析兩個(gè)蛋白的結(jié)合情況。Pull-downbuffer:Hispull-downbuffer：100mMTrispH8.0,150mMNaCl,40mMimidazole,10mMβ-ME；Hiselutionbuffer：100mMTrispH8.0,150mMNaCl,500mMimidazole,10mMβ-ME；Streppull-downbuffer：100mMTrispH8.0,150mMNaCl,0.1％TritionX-100；Strepelutionbuffer：100mMTrispH8.0,150mMNaCl,2.5mMdesthiobiotin,0.1％TritionX-100。6.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)是先以熒光素為底物來(lái)檢測(cè)螢火蟲熒光素酶的活性，后以腔腸熒光素為底物來(lái)檢測(cè)海腎熒光素酶的活性，并且在后續(xù)加 入海腎熒光素酶的底物同時(shí)加入了抑制螢火蟲熒光素酶催化蟲熒光素的物質(zhì)，使后續(xù)檢測(cè)僅僅測(cè)定到海腎熒光素酶的活性，實(shí)現(xiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)。螢火蟲熒光素酶可以催化蟲熒光素氧化成氧合蟲熒光素，在蟲熒光素氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光。海腎熒光素酶可以催化腔腸熒光素氧化成coelenteramide，在腔腸熒光素氧化的過程中也會(huì)發(fā)出生物熒光。然后可以通過熒光測(cè)定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀或液閃測(cè)定儀測(cè)定上述熒光素酶催化的氧化過程中釋放的生物熒光。螢火蟲熒光素酶催化蟲熒光素發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為560nm。海腎熒光素酶催化腔腸熒光素發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長(zhǎng)為465nm。通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效的檢測(cè)基因的表達(dá)。通常把感興趣的基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件克隆在螢火蟲熒光素酶的上游或其它適當(dāng)?shù)牡胤?，?gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，適當(dāng)刺激或處理后裂解細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對(duì)感興趣的調(diào)控元件的影響。海腎熒光素酶更多的被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。實(shí)驗(yàn)步驟：培養(yǎng)HEK293FT細(xì)胞(或其它目的細(xì)胞)，并接種于24孔板中，生長(zhǎng)12-24小時(shí)(80％匯合度)。用lipo2000轉(zhuǎn)染表達(dá)螢火蟲熒光素的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎熒光素酶內(nèi)參報(bào)告基因質(zhì)粒，以及所需的目的基因表達(dá)質(zhì)粒。24-48小時(shí)之后，加入細(xì)胞裂解液(5Xlysisbuffer用水稀釋到1X，購(gòu)自promega)：24孔板每孔加120μl，48孔板每孔加60μl。將該板放-80℃凍1h。將板從-80℃取出，室溫融化后，將細(xì)胞裂解液吸出，轉(zhuǎn)移到EP管中。每管裂解液取5μl加入到384孔板中。加入10μl螢火蟲熒光素酶的反應(yīng)底物，測(cè)報(bào)告基因的熒光值。加入10μl的反應(yīng)底物，測(cè)海腎熒光素酶的熒光值。報(bào)告基因與海腎熒光素?zé)晒庵档谋戎导礊槊總€(gè)樣品的相對(duì)熒光信號(hào)值。在檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，在HEK293FT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的RIG-I(residues1-238),以及IFNβ或ISRE的報(bào)告基因，熒光素酶報(bào)告基因。12小時(shí)后，消化細(xì)胞，以10000個(gè)細(xì)胞/每孔的密度接種至384孔板中，加入50μl的細(xì)胞培養(yǎng)基。7小時(shí)后，加入AlphaScreen實(shí)驗(yàn)篩選獲得的化合物，化合物的終濃度為10μM。37℃培養(yǎng)15h后，檢測(cè)熒光素酶活性。7.免疫印跡：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求制備蛋白樣品，100℃變性10分鐘，13200rpm離心2分鐘，取等量的上清加到SDS-PAGE膠的上樣孔中。蛋白樣品在濃縮膠中時(shí)電壓為80V，在分離膠中時(shí)電壓為120V。電泳結(jié)束后，取下凝膠，按以下順序安裝轉(zhuǎn)膜裝置：(負(fù)極)、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、濾紙、(正極)。將轉(zhuǎn)膜裝置放入4℃冷庫(kù)，100V恒壓轉(zhuǎn)印1h。轉(zhuǎn)膜完成后，取出硝酸纖維素膜，將膜浸泡在用TBST緩沖溶液配制的5％的脫脂牛奶中， 室溫下在搖床上孵育1h。用TBST緩沖溶液洗膜，5min×3次。加入按規(guī)定比例用5％BSA溶液稀釋的一抗，在4℃冷庫(kù)的搖床上孵育過夜。用TBST緩沖溶液洗膜，10min×3次。加入按規(guī)定比例用5％牛奶稀釋的二抗，室溫下在搖床上孵育40-60min。用TBST緩沖溶液洗膜，10min×3次。將顯色底物覆蓋在硝酸纖維素膜上，室溫顯色2分鐘。用LAS4000冷光/生物發(fā)光影像分析儀進(jìn)行拍攝。所需試劑的配制：5％BSA溶液：稱取5gBSA粉末溶于100ml1×PBS溶液中，再加入0.02％的疊氮鈉，貯存于4℃。10×Westernblot轉(zhuǎn)膜緩沖液：稱取30.3gTris堿和144g甘氨酸，加入300ml甲醇，再用去離子水定容到1L。8.RNA的抽提：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞清洗一遍。六孔板的每個(gè)孔加入500μlTrizolReagent，室溫處理5分鐘。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5mlEppendorf管中。每份樣品加入100μl的氯仿，vortex低速混勻后靜置5分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，轉(zhuǎn)移240μl的上層水相至新的Eppendorf管中。每份樣品加入240μl的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10分鐘。4℃，12000g離心15分鐘，棄去上清，留下白色的RNA沉淀。每份樣品加入500μl的75％乙醇，顛倒混勻。4℃，12000g離心5分鐘，棄盡上清。室溫晾干。加入適量DEPC處理過的去離子水，充分溶解。用NanoDropND1000測(cè)定所提取的RNA的濃度，260nm的吸光值與280nm的吸光值的比值應(yīng)維持在1.9-2.0之間。將所提取的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄或直接凍到-80℃保存。所需試劑的配制：磷酸緩沖鹽溶液(PBS)：800ml蒸餾水溶解0.2gKCl，8gNaCl，0.24gKH2PO4和1.44gNa2HPO4。用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，定容至1L。高壓蒸汽滅菌或過濾除菌。9.免疫共沉淀：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，并用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞清洗一遍。加入適量的細(xì)胞裂解緩沖液RIPA(含蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30min，將細(xì)胞裂解液于4℃，最大轉(zhuǎn)速離心30min后取上清。取所需量的proteinA/G瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次。取少量裂解液以備Westernblot分析，剩余裂解液中加入20μl預(yù)處理過的proteinA/G瓊脂糖珠和1μg相應(yīng)的抗體，在4℃冷庫(kù)的rotator上緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜。免疫沉淀反應(yīng)完成后，在4℃以7000rpm的速度離心1min，將瓊脂糖珠離心至EP管底。將上清小心吸去，瓊脂糖珠用300μl裂解緩沖液洗2次，再用300μlPBS洗2次。最后加入20μl的2×SDS上樣緩沖液，100℃煮10分鐘。利用SDS-PAGE和Westernblot分析與抗體結(jié)合的蛋白所需試劑的配制：RIPAbuffer:150mMNaCl,100mMTrispH8.0,1％TritonX-100,5mMEDTA,10mMNaF.10.細(xì)胞培養(yǎng)：HEK293、HEK293T、MEF細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM(Hyclone)培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中添加10％血清，100ug/ml盤尼西林，100μg/ml鏈霉素。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)，二氧化碳濃度為5％。11.實(shí)時(shí)定量熒光PCR：實(shí)時(shí)定量熒光PCR采用AppliedBiosystems公司兩步法實(shí)時(shí)PCR(Realtime-PCR)系統(tǒng)，檢測(cè)相對(duì)CT值。使用定量熒光PCR預(yù)混液(Toyobo公司提供GreenRealtimePCRreagent)配置反應(yīng)體系檢測(cè)并定量目標(biāo)基因的表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參。12.數(shù)據(jù)分析：采用SAS數(shù)據(jù)軟件分析包(9.1.3)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。單因子變異數(shù)分析(ANOVA)以及Student’st-test用于分析連續(xù)變量。置信區(qū)間為P<0.05。實(shí)施例1p97負(fù)調(diào)控I型干擾素信號(hào)通路依賴于其ATP酶活1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定p97是否參與I型干擾素應(yīng)答以及抗病毒免疫的信號(hào)通路。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)：人HEK293，HEK293T，小鼠MEF細(xì)胞細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞培養(yǎng)方法如基本實(shí)驗(yàn)方法10所述。Sendaivirus仙臺(tái)病毒(SeV)以及GFP-Vesicularstomatitisvirus帶有綠色熒光的水皰性口炎病毒(GFP-VSV)由武漢大學(xué)舒紅兵教授贈(zèng)予，SeV與VSV-GFP同市售，VSV-GFP改造方法同ConstructionandexpressionofhightiterpseudotypedGFP-retrovirusesbycotransfectionofVSV-GgeneJournalofShanghaiJiaotongUniversity(MedicalScience)》2007-07。poly(I:C)，poly(dA:dT)購(gòu)自Sigma(St.Louis,MO)，poly(I:C)采用轉(zhuǎn)染方式處理細(xì)胞，poly(dA:dT)直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中處理細(xì)胞。(2)IFNβ，IFNβ調(diào)控結(jié)構(gòu)域PRDIII以及PRDI(PRDIII-I)，ISRE的報(bào)告基因由中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所王琛教授贈(zèng)予，上述報(bào)告基因載體由市售載體插入相應(yīng)報(bào)告基因元件改造而得，載體相關(guān)信息詳見TRIM21IsEssentialtoSustainIFNRegulatoryFactor3ActivationduringAntiviralResponse2009vol.182no.63782-3792。(3)IFNB，RANTES以及ISG56在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：細(xì)胞抽提總RNA方法如基本實(shí)驗(yàn)方法8所述，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，并以其為模板，在DNAtaq酶的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；逆轉(zhuǎn)錄體系見表1，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序見表2，細(xì)胞樣品擴(kuò)增PCR引物見表3，Realtime-PCR反應(yīng)體系見表4，Realtime-PCR擴(kuò)增程序見表5。表1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系表2逆轉(zhuǎn)錄程序37℃15min50℃5min95℃5min4℃20min表3引物序列表4Realtime-PCR反應(yīng)體系表5PCR反應(yīng)體系程序設(shè)定(4)siRNA敲除細(xì)胞內(nèi)p97：針對(duì)p97編碼區(qū)及非編碼區(qū)的siRNA以及對(duì)照siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，siRNA序列如表6所示。表6siRNA序列(5)Rescue實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證p97功能：p97野生型及p97QQ突變體由中科院上海生化與細(xì)胞所趙允教授贈(zèng)予，上述載體由市售載體插入p97野生型或p97QQ突變體片段而得，具體載體信息詳見Ter94ATPasecomplextargetsk11-linkedubiquitinatedcitoproteasomesforpartialdegradation.DevCell.2013Jun24；25(6):636-44。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染IFNβ，IFNβ的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域PRDIII，IFNβ的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域PRDI，ISRE的報(bào)告基因，以及針對(duì)p97編碼區(qū)的siRNA。之后用SeV感染細(xì)胞，誘導(dǎo)I型干擾素信號(hào)通路。siRNA敲除p97后，IFNβ，PRDIII-I以及ISRE報(bào)告基因的活性明顯上調(diào)(圖1A)。同樣，IFNB，RANTES以及ISG56的mRNA水平隨著SeV感染時(shí)間的增加，不斷上調(diào)(圖1B)。在人293T細(xì)胞以及小鼠MEF細(xì)胞中，以poly(I:C)、poly(dA:dT)、VSV-GFP誘導(dǎo)I型干擾素信號(hào)通路，獲得了類似的結(jié)果(圖1C-1D)。以上結(jié)果說明，敲除p97可以增強(qiáng)I型干擾素的信號(hào)通路。以感染復(fù)數(shù)為2的VSV-GFP感染MEF細(xì)胞，敲除p97的細(xì)胞抗病毒感染的能力更強(qiáng)，GFP陽(yáng)性，即病毒感染的細(xì)胞比對(duì)照組少(圖1E)。通過細(xì)胞流式檢測(cè)，在p97敲除的細(xì)胞中，GFP陽(yáng)性，即病毒感染的細(xì)胞比例僅占9％，而對(duì)照組的細(xì)胞中，病毒感染的細(xì)胞比例高達(dá)93％(圖1F)。在轉(zhuǎn)染了針對(duì)p97非編碼區(qū)siRNA的細(xì)胞中，進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證p97的功能。過表達(dá)野生型的p97抑制Sev誘導(dǎo)的IFNβ報(bào)告基因的活性以及IFNB的轉(zhuǎn)錄，而使其缺失ATP酶活性的p97QQ突變體沒有上述功能(圖1G-1H)。這表明，p97負(fù)調(diào)控抗病毒免疫，該功能依賴于其ATP酶活性。實(shí)施例2Npl4協(xié)同p97調(diào)控抗病毒免疫應(yīng)答1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簆97與不同的輔助因子結(jié)合以參與不同的信號(hào)通路的調(diào)控，本實(shí)施例目的在于確定在抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控中，p97結(jié)合的輔助因子。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)siRNA敲除細(xì)胞內(nèi)p97，Npl4，Ufd1，p47，F(xiàn)AF1：上述siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，p97siRNA序列如表6所示，Npl4，Ufd1，p47，F(xiàn)AF1如表7所示。表7siRNA序列(2)報(bào)告基因的活性以及基因的轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)同實(shí)施例1。(3)在細(xì)胞中過表達(dá)的Npl4載體構(gòu)建以實(shí)施例1中的方法及體系抽提細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表8，PCR反應(yīng)體系見表9，PCR擴(kuò)增程序見表10。表8引物序列表9PCR反應(yīng)體系表10PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增獲得的片段，通過1％瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)大小與目的條帶相同，切下膠，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收(天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)DP209)。Npl4片段使用限制性內(nèi)切酶NcoI和SalI(thermoscientific)進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系如表11所示，反應(yīng)在37度進(jìn)行2小時(shí)。表11片段酶切反應(yīng)體系酶切后，通過普通產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)DP204)，純化獲得酶切后的片段。片段(HindIII/NheI雙酶切)與載體pCDNA3(HindIII/NheI雙酶切)，進(jìn)行連接，連接體系表12所示，連接反應(yīng)在室溫(25℃)進(jìn)行2小時(shí)。載體雙酶切反應(yīng)體系如表13所示，反應(yīng)在37℃進(jìn)行4小時(shí)。反應(yīng)完成后使用天根普通產(chǎn)物純化試劑盒純化獲得酶切后的載體。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。表12連接反應(yīng)體系表13載體酶切反應(yīng)體系3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：在HEK293T細(xì)胞中敲除不同的p97輔助因子，包括Npl4，Ufd1，p47以及FAF1后，檢測(cè)SeV感染后IFNβ報(bào)告基因的活性以及IFNB的轉(zhuǎn)錄水平。敲除Npl4后，IFNβ的轉(zhuǎn)錄活性以及IFNB的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，與Npl4形成復(fù)合物的Ufd1也能上調(diào)SeV感染介導(dǎo)的I型干擾素的信號(hào)通路。因而，在抗病毒免疫信號(hào)通路中，Npl4-Ufd1是p97的輔助因子(圖2A-2B)。我們?cè)诟腥玖薙eV的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的Npl4，結(jié)果表明Npl4可以抑制SeV誘導(dǎo)的IFNβ的激活以及ISRE報(bào)告基因的活性，并且其抑制作用呈現(xiàn)計(jì)量依賴效應(yīng)(圖2C)。同樣，過表達(dá)Npl4后，SeV刺激細(xì)胞后IFNB以及ISG56的mRNA水平明顯下調(diào)(圖2D)。以siRNA敲除內(nèi)源的Npl4，可以大大激活I(lǐng)FNβ，PRDIII-I以及ISRE的報(bào)告基因(圖2E)。同樣，在Npl4敲除的細(xì)胞中，IFNB，RANTES以及ISG56的轉(zhuǎn)錄水平隨著SeV刺激時(shí)間不斷上調(diào)(圖2F)。Rescue實(shí)驗(yàn)表明，以針對(duì)Npl4非編碼區(qū)的siRNA敲除內(nèi)源Npl4可以降低細(xì)胞感染VSV的比例，而后過表達(dá)Npl4，可使細(xì)胞更易感染VSV(圖2G)。將細(xì)胞中的p97敲除后，共轉(zhuǎn)染Npl4與野生型的p97或Npl4與突變型p97QQ，只有共轉(zhuǎn)染Npl4與p97野生型的細(xì)胞，SeV誘導(dǎo)的IFNβ報(bào)告基因斤的活性以及IFNB的轉(zhuǎn)錄受到抑制，單獨(dú)的Npl4或Npl4與p97QQ突變體的共轉(zhuǎn)均不能抑制IFNβ報(bào)告基因的活性以及IFNB的轉(zhuǎn)錄(圖2H)。以上結(jié)果表明Npl4作為p97的輔助因子參與I型干擾素信號(hào)通路和抗病毒 免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控。實(shí)施例3p97-Npl4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法，以體外純化獲得的p97、Npl4蛋白組裝復(fù)合物，解析其結(jié)構(gòu)，研究蛋白相互作用方式。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析的表達(dá)載體構(gòu)建：HT-代表pET28a-HisTEV載體，為實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建的載體，以商品化載體pET28a(Merck)改造而得。質(zhì)粒信息參見(Shi，Z.，etal.StructureoftheMST4incomplexwithMO25providesinsightsintoitsactivationmechanism.Structure21，449-461，2013)果蠅HT-Ter94-N(20-186)，果蠅HT-Npl4-UBD(1-77)分別以果蠅Ter94全長(zhǎng)，細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表14，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。連接的載體為上述的pET28a-HisTEV，酶切位點(diǎn)為NcoI/XholI。果蠅Ter94全長(zhǎng)由中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞所趙允教授贈(zèng)予，上述載體由市售載體插入Ter94片段而得，具體載體信息詳見Ter94ATPasecomplextargetsk11-linkedubiquitinatedcitoproteasomesforpartialdegradation.DevCell.201324；25(6)：636-44。細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄的cDNA的制備方法及體系同實(shí)施例1。表14引物序列(2)Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物蛋白的純化：按基本實(shí)驗(yàn)方法3進(jìn)行純化，得到了純度高于95％的目的蛋白，再通過一步凝膠過濾層析均一蛋白。將純化的HT-Ter94-N和HT-Npl4-UBD以摩爾比為1∶1的比例混合，4℃孵育2h，再用凝膠過濾層析的方法進(jìn)行純化，出現(xiàn)了單一的紫外吸收峰，該峰的位置與單獨(dú)純化蛋白的紫外吸收峰位置相比，向左發(fā)生了明顯的偏移，說明Ter94和Npl4能夠以化學(xué)計(jì)量比為 1:1的方式結(jié)合，形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物。(3)HT-Ter94-N/HT-Npl4-UBD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析：將HT-Ter94-N/HT-Npl4-UBD復(fù)合物蛋白濃縮到25mg/ml，采用坐滴法進(jìn)行晶體生長(zhǎng)條件的初步篩選。三天后，在Indexkit(HamptonResearch)第69號(hào)條件中有不規(guī)則的片狀晶體產(chǎn)生，組成成分為0.1MTrispH8.5，25％PEG3350，0.2Mammoniumsulfate，將晶體帶到上海同步輻射光源生物大分子晶體學(xué)光束線站BL17U-MX進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集。(4)復(fù)合物結(jié)構(gòu)解析：為了解析Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物的相位，我們?cè)诤形琢虬彼岬腗9培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)HT-Ter94-N和HT-Npl4-UBD硒代蛋白，然后按照與母體蛋白相同的純化方法進(jìn)行硒代蛋白的純化。利用硒代甲硫氨酸標(biāo)記的Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物蛋白重復(fù)該復(fù)合物母體晶體的生長(zhǎng)條件為Index-69和Index-75(HamptonResearch)，。通過改變沉淀劑PEG的種類和濃度分別對(duì)這兩個(gè)條件中長(zhǎng)出的硒代晶體進(jìn)行優(yōu)化。將這些硒代晶體帶到北京同步輻射光源(BSRF)進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集，在三個(gè)不同的波長(zhǎng)下(peakinflection和remote)分別收集到了分辨率為和的衍射數(shù)據(jù)，空間群均為P212121。利用peak的衍射數(shù)據(jù)，通過單波長(zhǎng)反常散射(SAD)的方法對(duì)Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物進(jìn)行了相位的解析和模型的建立，最終得到了該復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。復(fù)合物的結(jié)構(gòu)顯示：Npl4的UBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合在了Ter94N端的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成的疏水溝槽中，在不對(duì)稱單元中的結(jié)合比例為1:1。(5)IFNβ激活以及IFNB轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)同實(shí)施例1。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Npl4有四個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的UBD結(jié)構(gòu)域(1-80)與p97結(jié)合，zf-Npl4結(jié)構(gòu)域(104-246)，Npl4結(jié)構(gòu)域(248-557),以及C端的NZF結(jié)構(gòu)域(580-608)與泛素結(jié)合(圖3A)。缺失UBD結(jié)構(gòu)域的Npl4不能抑制SeV誘導(dǎo)的IFNβ激活以及IFNB轉(zhuǎn)錄，這進(jìn)一步證明Npl4協(xié)同p97抑制抗病毒免疫反應(yīng)。我們將解析的果蠅Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分別與人源p97N端結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)3QQ7)和鼠源Npl4UBD結(jié)構(gòu)域的核磁結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)2PJH)進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)人源p97-N單獨(dú)的晶體結(jié)構(gòu)能夠很好的與果蠅復(fù)合物中的Ter94-N疊加在一起，疊加之后Cα原子的均方根偏差(rmsd)為這與它們高度的序列同源性(78％)相一致。另一方面果蠅Npl4-UBD與鼠源Npl4-UBD這兩個(gè)結(jié)構(gòu)之間還是存在明顯差異的。通過對(duì)不同物種的Cdc48/Ter94/p97-N和Npl4-UBD進(jìn)行以結(jié)構(gòu)為導(dǎo)向的序列比對(duì)，我們發(fā) 現(xiàn)Ter94-N上與果蠅Npl4-UBD相互作用的關(guān)鍵殘基Q47，F(xiàn)49，R50，D52，K106，Y107和Y140在不同物種間都是十分保守的。我們所解析的果蠅Ter94-N/Npl4-UBD復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)可能更精確的描述了p97與Npl4相互作用的普遍方式和特點(diǎn)。我們解析的Ter94/Npl4復(fù)合物結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的Ter94，Npl4相似，Npl4的UBD結(jié)構(gòu)域結(jié)合在了Ter94N端的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域形成的疏水溝槽中，在不對(duì)稱單元中的結(jié)合比例為1∶1(圖3B)。Ter94/Npl4復(fù)合物形成的異源二聚體有兩個(gè)相互作用的位點(diǎn)。第一個(gè)相互作用的位點(diǎn)Npl4的第一以及第二個(gè)β片層上的L7，R9以及R18與Ter94N端的F49形成疏水相互作用，同時(shí)Npl4的R9，R18以及H69與Ter94的R50，D52andQ47形成氫鍵及離子鍵。第二個(gè)相互作用位點(diǎn)Npl4的A13以及R49與Ter94N端的Y107以及Y140通過疏水相互作用聯(lián)結(jié)，Npl4的A13，Q11以及R49與Ter94的Y107通過氫鍵及離子鍵相互作用。此外，Npl4的R49與Ter94的Y140形成cation-π相互作用。上述這些相互作用的殘基在果蠅和人中都是保守的，因而以果蠅的Ter94-Npl4解析的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，同樣適用與人p97-Npl4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析(圖3C)。實(shí)施例4p97-Npl4復(fù)合物的突變研究1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^突變分析研究p97-Npl4復(fù)合物的相互作用對(duì)于其在抗病毒信號(hào)通路中作用的影響。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)相互作用檢測(cè)載體Strep-Npl4、His-Npl4、Strep-p97、p97-His的載體構(gòu)建：Strep-Npl4、His-Npl4以HA-Npl4載體為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表15，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。Strep-Npl4采用表15中SEQIDNO：31，32擴(kuò)增，連接的載體為市售載體pET51b-Strep，His-Npl4采用表15中SEQIDNO：31，33擴(kuò)增，連接的載體為自行構(gòu)建的pET28a-HisTev，酶切位點(diǎn)均為NcoI/SalI。表15引物序列p97-His、Strep-p97以V5-p97載體為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表16，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。p97-His采用表16中SEQIDNO：34，35擴(kuò)增，連接的載體為市售載體pET21a，酶切位點(diǎn)均為NdeI/SalI。Strep-p97采用表16中SEQIDNO：36，37擴(kuò)增，連接的載體為市售載體pET51b-Strep，酶切位點(diǎn)均為BamHI/SalI。表16引物序列(2)p97及Npl4的突變載體的構(gòu)建：p97突變體F52A/D55A、Y110A，以p97-His為模板，采用表17中SEQIDNO：38-41所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的野生型p97模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有p97基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。p97突變體3A，以p97-HisF52A/D55A為模板，采用表17中SEQIDNO：40，41所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的p97-HisF52A/D55A模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有p97基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。表17引物序列Npl4突變體I6A/R8A、R50A，以Npl4-His為模板，采用表18中SEQIDNO：42，43，46，47所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的野生型Npl4模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有Npl4基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。Npl4突變體I6A/R8A/R17A以Npl4-HisI6A/R8A為模板，采用表18中SEQIDNO：44，45所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的Npl4-HisI6A/R8A模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有Npl4基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。Npl4突變體4A以Npl4-HisI6A/R8A/R17A為模板，采用表18中SEQIDNO：46，47所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的Npl4-HisI6A/R8A/R17A模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有Npl4基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。表18引物序列3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：我們根據(jù)結(jié)構(gòu)信息構(gòu)建了一系列人p97以及Npl4的突變體，通過pulldown實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)p97的(F52，Y110)(D55，Y110)對(duì)于Npl4的結(jié)合具有決定性的作用。Npl4的R50以及I6，R8，R17，R50的多點(diǎn)突變，可以打破Npl4與p97的相互作用(圖3C-3E)， 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖3F-3G)。因而，F(xiàn)52A/D55A/Y110p97(3A)突變以及I6A/R8A/R17A/R50A的Npl4(4A)突變是影響p97與Npl4相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。在敲除內(nèi)源p97的HEK293T細(xì)胞中，SeV的刺激下，轉(zhuǎn)染野生型的p97可以抑制IFNβ的轉(zhuǎn)錄激活以及IFNB的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)染p973A突變體不能(圖3H)。同樣，轉(zhuǎn)染野生型的Npl4可以抑制IFNβ啟動(dòng)子的激活以及IFNB的轉(zhuǎn)錄，而Npl44A突變體不能(圖3I)。以上結(jié)果表明，p97-Npl4形成復(fù)合物，在抗病毒信號(hào)通路中發(fā)揮作用。實(shí)施例5p97-Npl4復(fù)合物負(fù)調(diào)控RIG-I的蛋白水平1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簆97具有AAAATP酶活，可以調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性。為研究p97-Npl4復(fù)合物是否通過調(diào)控RLR介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路中的分子的穩(wěn)定性，我們研究了p97-Npl4復(fù)合物對(duì)RIG-I蛋白水平的調(diào)控。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)慢病毒重組shRNA敲除細(xì)胞內(nèi)p97，Npl4，Ufd1，p47設(shè)計(jì)一段21個(gè)堿基的靶序列(shRNA)，該序列可以形成反向互補(bǔ)的發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)，沉默相關(guān)基因表達(dá)。對(duì)應(yīng)基因的shRNA以及對(duì)照shRNA(scramble)連接至慢病毒載體pLKO.1-puro。shRNA(scramble)為對(duì)照。shRNA序列如表19所示。表19shRNA序列0.01M的正向和反向DNA鏈混合，稀釋至50ul，經(jīng)過如下反應(yīng)：95℃5min70℃10min55℃30min37℃30min退火連接為雙鏈。雙鏈DNA與pLKO.1-puro(EcoRI/AgeI雙酶切)載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定得到的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，用2μg/mlpuromycin篩選基因組穩(wěn)定整合shRNA序列的細(xì)胞，48-72小時(shí)后，使用Vivaspin20ml(SartoriusStedimBiotech,Aubagne,France)以3000g的離心力，離心50min，濃縮病毒液。感染病毒后，可獲得敲除相應(yīng)基因的細(xì)胞。pLKO.1-puro質(zhì)粒從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物 化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所季紅斌研究員處獲得，為市售的構(gòu)建RNAi的常用載體，可從Addgene公司購(gòu)得。(3)Flag標(biāo)簽RIG-I，F(xiàn)lag標(biāo)簽RNF125的載體構(gòu)建：以實(shí)施例1中的方法及體系抽提細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表20，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。Flag-RIG-I采用表20中SEQIDNO：60，61擴(kuò)增，F(xiàn)lag-RNF125采用表20中SEQIDNO：62，63擴(kuò)增，連接的載體為市售載體pCDNA3.1-Flag，酶切位點(diǎn)均為HindIII/XholI。表20引物序列(4)RIG-IK181突變體構(gòu)建：以Flag-RIG-I為模板，采用表21中所示引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，使用DpnI去甲基化酶去除未突變的模板，擴(kuò)增獲得帶有特定位點(diǎn)突變的帶有Npl4基因的載體片段，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選，獲得的陽(yáng)性克隆，并測(cè)序驗(yàn)證。表21引物序列(5)抗體檢測(cè)蛋白表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)方法同基本實(shí)驗(yàn)方法7。檢測(cè)Flag，Myc以及β-actin的抗體購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO)。檢測(cè)p97，RIG-I，MAVS，p-TBK，TBK，IKKε，p-IRF3，IRF3以及K48Ub的抗體購(gòu)自CellSignaling(Danvers，MA)。檢測(cè)HA，Ubiquitin，RNF125的抗體購(gòu)自SantaCruz(SantaCruz，CA)。檢測(cè)Npl4(IF)的抗體購(gòu)自NovusBiologicals(Littleton，CO)。檢測(cè)Npl4(IP以及WB)購(gòu)自Abcam(Cambridge，UK)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染了shp97的細(xì)胞中RIG-I，MAVS以及IRF3的蛋白水平(圖4A)。敲除p97可以顯著增加poly(I:C)誘導(dǎo)的RIG-I表達(dá)，同樣MAVS的蛋白水平也增加，IRF3的總蛋白水平?jīng)]有變化，但其磷酸化水平明顯增加。反過來(lái)，過表達(dá)Npl4顯著降低了poly(I:C)誘導(dǎo)的RIG-I以及MAVS的表達(dá)，IRF3的磷酸化水平也顯著降低(圖4B)。此外，敲除Npl4可以顯著增加poly(I:C)誘導(dǎo)的的RIG-I，MAVS的表達(dá)，增強(qiáng)IRF3的磷酸化水平，而TBK1，IKKε以及IRF3的蛋白水平?jīng)]有變化(圖4C)。同樣，敲除p47，p97的另一個(gè)輔助因子，對(duì)RIG-I抗病毒通路并沒有調(diào)控作用。因而p97對(duì)于RIG-I抗病毒信號(hào)通路的調(diào)控作用依賴于Npl4。過表達(dá)Npl4，并不會(huì)引起poly(I:C)誘導(dǎo)的RIG-I的mRNA水平變化，而以蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞后p97以及Npl4介導(dǎo)的RIG-I蛋白水平下降也被抑制(圖4D-4E)。這說明p97-Npl4復(fù)合物通過蛋白酶體降解調(diào)控RIG-I的蛋白水平。在HEK293細(xì)胞內(nèi)敲除p97或Npl4，再轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽RIG-I，RIG-I的K48鏈泛素化水平明顯下降(圖4F-4G)。相反，在敲除p97的HEK293細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽RIG-I以及野生型p97，RIG-I的K48鏈泛素化水平明顯增加，而同時(shí)轉(zhuǎn)染Flag-RIG-I以及不能與Npl4結(jié)合的p973A突變體，對(duì)RIG-I的泛素化水平?jīng)]有影響(圖4H)。同樣，過表達(dá)野生型的Npl4可以增加RIG-I的K48泛素化水平，而過表達(dá)不能與p97結(jié)合的Npl44A突變體對(duì)RIG-I的泛素化水平?jīng)]有影響(圖4I)。以上結(jié)果說明，p97-Npl4復(fù)合物通過促進(jìn)RIG-I的K48鏈泛素化，使其通過蛋白酶體降解，抑制抗病毒免疫信號(hào)通路。p97-Npl4復(fù)合物通過介導(dǎo)RIG-I的降解調(diào)控抗病毒信號(hào)通路，而之前的研究表明E3泛素連接酶c-Cbl以及RNF125參與RIG-I的K48鏈泛素化，我們研究了參與p97-Npl4復(fù)合物調(diào)控的RIG-I降解的泛素連接酶。我們分別設(shè)計(jì)了RNF-125以及c-Cbl的shRNA，通過Q-PCR驗(yàn)證了其敲除效率。雙熒光酶素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，敲除內(nèi)源的RNF125，Npl4無(wú)法下調(diào)SeV誘導(dǎo)的IFNβ啟動(dòng)子的激活，而敲除c-Cbl沒有作用(圖5A)。同樣，在敲除RNF-125的細(xì)胞中，Npl4不能抑制過表達(dá)RIG-I的card結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的IFNβ的轉(zhuǎn)錄激活，在敲除c-Cbl的細(xì)胞中，Npl4的抑制作用不受影響(圖5B)。在敲除內(nèi)源RNF125的細(xì)胞中，Npl4也不能降低RIG-I的蛋白水平(圖5C)。以上結(jié)果說明，RNF125是p97-Npl4復(fù)合物抑制RIG-I抗病毒信號(hào)通路中特異的E3泛素連接酶。我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染Npl4或RNF125的細(xì)胞中總RIG-I的泛素化水平，過表達(dá)Npl4顯著增加了RIG-I的K48鏈泛素化水平，而同時(shí)過表達(dá)Npl4以及RNF125可以進(jìn)一步增加其泛素化水平(圖5D)，這表明Nlp4與RNF125協(xié)同作用，促進(jìn)RIG-I的K48鏈泛素化。QPCR實(shí)驗(yàn)也表明共轉(zhuǎn)染Npl4與RNF125對(duì)于IFNβ的轉(zhuǎn)錄抑制作用遠(yuǎn) 高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染Npl4或RNF125(圖5E)。我們?cè)诩?xì)胞中過表達(dá)RNF125，并以為未過表達(dá)RNF125的細(xì)胞為對(duì)照，通過質(zhì)譜分析RNF125催化的RIG-I的泛素化位點(diǎn)，結(jié)果表明其泛素化發(fā)生與181位賴氨酸(圖5F)。通過點(diǎn)突變手段構(gòu)建181位不被泛素化的RIG-I突變體K181，在細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染野生型或突變體的RIG-I與Npl4或RNF125，SeV刺激后，通過免疫印跡檢測(cè)RIG-I的蛋白水平，結(jié)果表明Npl4或RNF125都能顯著降低野生型的RIG-I的蛋白水平，但對(duì)突變體K181R的蛋白水平?jīng)]有影響(圖5G)，這表明181位賴氨酸是p97-Npl4復(fù)合物通過RNF125調(diào)控RIG-I相關(guān)的抗病毒通路的主要位點(diǎn)。此外，Npl4可以增加RIG-I的K48鏈泛素化水平，但對(duì)K181R突變體的K48鏈泛素化水平?jīng)]有影響(圖5H)。同樣，RNF125以及Npl4都可以明顯抑制野生型RIG-I介導(dǎo)的IFNβ啟動(dòng)子的活性，但對(duì)K181R突變體沒有影響(圖5I)。在細(xì)胞中敲除Npl4或RNF125后，轉(zhuǎn)染野生型的RIG-I可以抑制VSV感染(感染復(fù)數(shù)MOI＝20)，轉(zhuǎn)染K181R突變體不能產(chǎn)生抗病毒作用(圖5J)。我們進(jìn)一步分析了RIG-I第181位賴氨酸的結(jié)構(gòu)特征，該位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上接近172位賴氨酸，即RIG-I激活相關(guān)的關(guān)鍵K63鏈泛素化位點(diǎn)，以及負(fù)調(diào)控RIG-I信號(hào)通路的磷酸化位點(diǎn)第170位蘇氨酸，因而，RIG-I的第181位賴氨酸是RNF125/p97-Npl4介導(dǎo)的RIG-I泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)。實(shí)施例6p97-Npl4復(fù)合物與RIG-I以及RNF125結(jié)合1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)p97-Npl4復(fù)合物是否直接結(jié)合RIG-I以及RNF125。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)Flag標(biāo)簽RIG-I1-238，200-803，804-925的載體構(gòu)建：以Flag-RIG-I為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表20，22，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。連接的載體為市售載體pCDNA3.1-Flag，酶切位點(diǎn)均為HindIII/XholI。(“Flag標(biāo)簽RIG-I1-238擴(kuò)增引物為表20引物60，表22引物66；Flag標(biāo)簽RIG-I200-803擴(kuò)增引物為表22引物67，68；Flag標(biāo)簽RIG-I804-925擴(kuò)增引物為表22引物69，表20引物61”)表22引物序列(2)HA-Npl4全長(zhǎng)，ΔNZF1-579，ΔUBD(81-608)，以及單獨(dú)的UBD載體構(gòu)建：以HA-Npl4為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表8，23，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。連接的載體為市售載體pCDNA3，酶切位點(diǎn)均為HindIII/NheI。(“HA-Npl4ΔNZF1-579擴(kuò)增引物為表8引物25，表23引物70；HA-Npl4ΔUBD(81-608)擴(kuò)增引物為表23引物71，表8引物26；HA-Npl4UBD擴(kuò)增引物為表8引物25，表23引物72”)表23引物序列(3)MBP-RIG-ICARD，MBP-RNF125的載體構(gòu)建：MBP-RIG-I以Flag-RIG-I為模板，MBP-RNF125以Flag-RNF125為模板，在Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR的作用下用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR引物見表24，載體構(gòu)建方法及體系同實(shí)施例2。連接的載體為自行構(gòu)建的載體pET28aMBPTev(載體構(gòu)建信息參見Shi，Z.，etal.StructureoftheMST4incomplexwithMO25providesinsightsintoitsactivationmechanism.Structure21，449-461，2013))，酶切位點(diǎn)均為NcoI/XholI。表24引物序列3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析：我們?cè)赟eV刺激的HEK293T細(xì)胞中，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源的RIG-I可以與內(nèi)源的Npl4結(jié)合，也可以與RNF125結(jié)合(圖6A)。同時(shí)，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)也證明 了，在SeV刺激下，Npl4與RIG-I存在共定位(圖6B)。體外純化的Npl4與RIG-I重組蛋白在pulldown實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證明，這兩個(gè)蛋白可以直接相互作用(圖6C)。我們截取了不同的RIG-I以及Npl4的結(jié)構(gòu)域，研究其相互作用的具體區(qū)域，不同RIG-I片段與全長(zhǎng)的Npl4共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，RIG-I的CRAD結(jié)構(gòu)域(氨基酸1-238)與Npl4相互作用，helicase結(jié)構(gòu)域與CTD結(jié)構(gòu)域不參與其與Npl4的相互作用(圖6D)。同樣，Npl4的缺失突變體與全長(zhǎng)的RIG-I共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，缺失Npl4的NZF結(jié)構(gòu)域的突變體完全喪失與RIG-I結(jié)合的能力，而缺失UBD結(jié)構(gòu)域的Npl4依舊能與RIG-I結(jié)合(圖6E)，即Npl4通過NZF結(jié)構(gòu)域與RIG-I結(jié)合。體外pulldown實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明Npl4可以直接與RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域結(jié)合(圖6F)。內(nèi)源免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明RNF125不僅能與RIG-I結(jié)合，也能與p97結(jié)合(圖6G)。利用體外純化的蛋白，我們發(fā)現(xiàn)p97可以與RNF125結(jié)合，兩者之間存在直接的相互作用(圖6H)。此外，RNF125可以直接結(jié)合RIG-I以及p97-Npl4復(fù)合物，p97-Npl4復(fù)合物可以進(jìn)一步促進(jìn)RNF125與RIG-I之間的相互作用(圖6I)。以上結(jié)果表明，在SeV的刺激下，p97-Npl4復(fù)合物可以與RIG-I以及RNF125結(jié)合，RNF-125介導(dǎo)RIG-I的K48鏈泛素化，進(jìn)而促進(jìn)RIG-I的蛋白酶體降解，抑制RIG-I的抗病毒信號(hào)通路。實(shí)施例7p97-Npl4復(fù)合物抑制劑的篩選及其在抗病毒信號(hào)通路中的作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定可以特異性阻斷p97-Npl4相互作用的小分子化合物并檢測(cè)化合物對(duì)p97-Npl4介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路的影響。2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)AlphaScreen實(shí)驗(yàn)：在384淺孔板(PerkinElmer)中，加入2.5μl帶His標(biāo)簽的Npl4，2.5μl生物素標(biāo)記的p97，再加入反應(yīng)緩沖液(20mMHepespH7.5，100mMNaCl，0.1％BSA)，每孔終體積為11μl，帶His標(biāo)簽的Npl4的終濃度為125nM，生物素標(biāo)記的p97終濃度為31.25nM，將反應(yīng)體系于室溫孵育60分鐘。用稀釋緩沖液(20mMHepes，100mMNaCl，pH7.5)將溶解于DMSO中的化合物(10mM)稀釋至100μM，將稀釋后的化合物加1μl至反應(yīng)體系中，室溫避光孵育60分鐘。將2.5μl鎳螯合acceptorbeads(PerkinElmer)加入反應(yīng)體系中，終濃度為10μg/ml，室溫避光孵育60分鐘后，再加入等量的streptavidin交聯(lián)的donorbeads(PerkinElmer)，室溫避光孵育60分鐘。在儀器EnVisionMultilabelPlateReader(PerkinElmer)讀取數(shù)值，每塊384孔板上均有陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。(2)細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：在HEK293FT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的RIG-ICARD結(jié)構(gòu)域(1-238),以及IFNβ或ISRE的報(bào)告基因，熒光素酶報(bào)告基因。12小時(shí)后，消化細(xì)胞，以 10000個(gè)細(xì)胞/每孔的密度接種至384孔板中，加入50μl的細(xì)胞培養(yǎng)基。7小時(shí)后，加入AlphaScreen實(shí)驗(yàn)篩選獲得的化合物，化合物的終濃度為10μM。37℃培養(yǎng)15h后，檢測(cè)熒光素酶活性。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：p97與Npl4的相互作用對(duì)于IFNβ介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路是必須的，我們通過AlphaScreen這一篩選手段，以8120個(gè)具有生物活性的化合物組成化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，尋找可以打破p97-Npl4相互作用的抑制劑。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過一系列的實(shí)驗(yàn)流程優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)的Z因子達(dá)到0.7，表明實(shí)驗(yàn)條件或測(cè)量方法可以應(yīng)用到接下來(lái)的高通量實(shí)驗(yàn)中。在對(duì)8120個(gè)化合物進(jìn)行篩選后，獲得抑制率>50％的化合物132個(gè)。通過生物素標(biāo)記Npl4，篩選假陽(yáng)性的條件，我們確定了40個(gè)抑制率>30％，可以抑制p97-Npl4復(fù)合物形成的化合物。通過細(xì)胞內(nèi)報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，我們檢測(cè)了這40個(gè)化合物在抗病毒信號(hào)通路中的作用，其中三個(gè)化合物對(duì)于報(bào)告基因IFNβ以及ISRE的激活效果>30％，即ThonzoniumBromide(TB)，EpirubicinHydrochloride(EH)以及Purpurin。TB對(duì)于IFNβ的激活倍率為102.6％，對(duì)ISER的激活倍率為107.6％；EH對(duì)于IFNβ的激活倍率為89.5％，對(duì)ISER的激活倍率為207％，因而這兩個(gè)化合物對(duì)抗病毒信號(hào)通路具有明顯的激活作用。進(jìn)一步通過pulldown是實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TB、EH對(duì)于p97-Npl4復(fù)合物的影響，采用實(shí)施例4中p97、Npl4相互作用檢測(cè)的pulldown體系，在體系中分別加入對(duì)照溶液和化合物，檢測(cè)兩者間的相互作用，對(duì)電泳結(jié)果采用灰度分析，表明這兩種小分子化合物大大消弱了兩者的相互作用(圖7)。結(jié)果表明，上述篩選獲得的小分子化合物可以通過破壞p97-Npl4復(fù)合物的形成，促進(jìn)RIG-I相關(guān)的抗病毒信號(hào)通路。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3