本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及Shh(sonic hedgehog)信號(hào)通路抑制劑的新用途，特別涉及Shh信號(hào)通路抑制劑—Vismodegib在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Vismodegib是一種具有選擇性Hedgehog信號(hào)通路抑制作用的新型口服類藥物，已經(jīng)由FDA批準(zhǔn)用于治療基底細(xì)胞癌。

Vismodegib有效抑制hedgehog通路，是一種新型及特定合成的小分子抑制劑，IC50為3nM。Vismodegib作用于Hedgehog信號(hào)通路，阻斷Hedgehog配位體，即細(xì)胞表面受體PTCH及SMO的活性，從而阻斷Hedgehog信號(hào)通路。在組織生長(zhǎng)和修復(fù)方面，Hedgehog信號(hào)通路意義重大。Hedgehog通路信號(hào)的異常激活及不受控制的細(xì)胞增殖，可能與Hedgehog配位體，即細(xì)胞表面受體PTCH及SMO的突變有關(guān)。在體外，Vismodegib在不抑制胰臟細(xì)胞增殖的前提下阻止原代胰臟移植物的生長(zhǎng)，這項(xiàng)結(jié)果最近已經(jīng)應(yīng)用到臨床。Vismodegib也抑制ABCG2、P-糖蛋白，及和MDR有關(guān)聯(lián)的重要MRP1ABC載體。Vismodegib也阻斷其他多種ABC載體。ABC載體屬于一個(gè)膜蛋白家族，它的過(guò)量表達(dá)和耐藥性有關(guān)，這也是治療癌癥的一個(gè)重大障礙。Vismodegib強(qiáng)抑制兩種ABC載體，ABCG2/BCRP和ABCB1/P-糖蛋白，也溫和抑制ABCC1/MRP1。在ABCG2過(guò)量表達(dá)的HEK293細(xì)胞中，Vismodegib可以提高熒光ABCG2底物BODIPY-哌唑嗪的保持力，也可用米托蒽醌再次處理這些細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤的ABCG2底物。實(shí)驗(yàn)使Madin-Darby犬的腎臟細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)P糖蛋白或者M(jìn)RP1，Vismodegib提高了鈣黃綠素-AM的保持力，然后載用秋水仙素處理這些細(xì)胞。另外，用米托蒽醌、托泊替康、SN-38處理的過(guò)量表達(dá)ABCG2的人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460/par和NCI-H460/MX20，用Vismodegib再次處理。Vismodegib作用于ABCG2和Pgp的IC50值分別為1.4μM和3.0μM。Vismodegib改變細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺平衡，且作用于抗cisplatin的肺癌細(xì)胞，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

Vismodegib已經(jīng)用于治療動(dòng)物模型的成髓細(xì)胞瘤。Vismodegib抑制原代胰腺移植瘤生長(zhǎng)，但是不抑制細(xì)胞增殖。Vismodegib按25mg/kg以上劑量口服給藥髓母細(xì)胞瘤Ptch(+/-)異體移植物模型，引起細(xì)胞衰退，按92mg/kg劑量處理兩種配位體依賴的結(jié)腸直腸癌模型D5123和1040830，每天處理兩次，抑制腫瘤生長(zhǎng)。分析Hh通路活性和PK/PD模型顯示Vismodegib抑制Gli1，IC50值與Vismodegib作用于髓母細(xì)胞瘤和D5123模型的IC50值差不多(分別為0.165μM±11.5％和0.267μM±4.83％)。

常染色體顯性遺傳性多囊腎(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease，ADPKD)疾病是最常見(jiàn)的單基因遺傳性腎病之一。其主要臨床癥狀為雙側(cè)腎臟形成大量大小不等的球形液性囊腫，并進(jìn)行性增大，破壞腎臟的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。ADPKD通常在成人中發(fā)病，其發(fā)病率為1:400-1000，是目前世界上終末腎衰竭的第三大病因。除腎病表型外，ADPKD患者的非腎臟部位病變表型也十分明顯：83％的ADPKD患者出現(xiàn)肝囊腫，16％的患者出現(xiàn)腦動(dòng)脈瘤。其他病理表型包括主動(dòng)脈根，胸部動(dòng)脈異常，二尖瓣脫垂以及腹壁疝氣。約50％的患者年滿60歲后將出現(xiàn)終末腎衰竭。正常人的尿素氮(BUN)參考范圍為2.14-7.14mmol/L，血肌酐(CRE)參考范圍為44-133μmol/L，當(dāng)血肌酐超過(guò)133μmol/L為炎癥損傷期，超過(guò)186μmol/L為腎功能損傷期，超過(guò)451umol/L為腎功能衰竭期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供Shh信號(hào)通路抑制劑的新用途。

本發(fā)明所提供的Shh信號(hào)通路抑制劑的新用途，可為Shh信號(hào)通路抑制劑在制備治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，Shh信號(hào)通路抑制劑在制備如下任一產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

(1)減弱患病機(jī)體腎囊腫程度的產(chǎn)品；

(2)降低患病機(jī)體腎臟體重比的產(chǎn)品；

(3)降低患病機(jī)體血液中肌酐和/或尿素氮含量的產(chǎn)品

(4)降低患病機(jī)體腎臟纖維化程度的產(chǎn)品。

在本發(fā)明中，所述Shh信號(hào)通路抑制劑具體為Vismodegib。

所述患病機(jī)體為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機(jī)體，如常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)患者。在本發(fā)明中，以Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠作為ADPKD動(dòng)物模型，即為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機(jī)體，上述(1)則具體表現(xiàn)為減弱Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎囊腫程度；上述(2)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟體重比；上述(3)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量；上述(4)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟纖維化程度。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)品。

本發(fā)明所提供的產(chǎn)品的活性成分為Shh信號(hào)通路抑制劑，該產(chǎn)品具有如下用途中的至少一種：

(a)治療常染色體顯性遺傳性多囊腎；

(b)減弱患病機(jī)體腎囊腫程度；

(c)降低患病機(jī)體腎臟體重比；

(d)降低患病機(jī)體血液中肌酐和/或尿素氮含量；

(e)降低患病機(jī)體腎臟纖維化程度。

在本發(fā)明中，所述Shh信號(hào)通路抑制劑具體為Vismodegib。

所述患病機(jī)體為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機(jī)體，如常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)患者。在本發(fā)明中，以Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠作為ADPKD動(dòng)物模型，即為具有常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)臨床癥狀的機(jī)體，上述(b)則具體表現(xiàn)為減弱Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎囊腫程度；上述(c)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟體重比；上述(d)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量；上述(e)則具體表現(xiàn)為降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟纖維化程度。

在以上所述的各應(yīng)用或產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品具體可為藥物。

以上所有的所述Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠均按照包括如下步驟的方法構(gòu)建得到：

(I)將Pkd2^f3/f3小鼠(記載于“l(fā)ngyu Kim,Tianbing Ding,Yulong Fu,et al.Conditional Mutation of Pkd2Causes Cystogenesis and Upregulatesβ-Catenin.J Am Soc Nephrol,2009(20):2556-2569”一文)與帶有Vil-Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(購(gòu)自The Jackson Laboratory，Strain Name：B6.SJL-Tg(Vil-cre)997Gum/J，Stock Number：004586，詳見(jiàn)網(wǎng)址：http://jaxmice.jax.org/strain/004586.html)進(jìn)行雜交，得到F1代(其中理論上有1/2后代的基因型為Vil-Cre:Pkd2^+/f3；1/2后代的基因型為Pkd2^+/f3)；

(II)將步驟(I)得到的F1代(Vil-Cre:Pkd2^+/f3)與所述Pkd2^f3/f3小鼠進(jìn)行回交，得到回交后代；

(III)從步驟(II)得到的回交后代中篩選出Pkd2基因純合，同時(shí)表達(dá)Vil-Cre的小鼠，即為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠。

其中，步驟(III)中所述“從步驟(II)得到的回交后代中篩選出Pkd2基因純合，同時(shí)表達(dá)Vil-Cre的小鼠”，可按照如下方法實(shí)現(xiàn)：以所述回交后代的小鼠基因組為模板，采用針對(duì)Pkd2基因的引物(三條：5’-TCT GAC TTG CAG ACT GTG GG-3’，5’-AGG TAG GGG AAG GTC AGG GTT GG-3’，5'-TTTACGTCCAGCCAAGCT-3')和針對(duì)Cre基因的引物(兩條：5’-CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG-3’，5’-TGC CAC GAC CAA GTG ACA GC-3’)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；針對(duì)Pkd2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小為650bp的單一條帶(Pkd2基因純合)，同時(shí)針對(duì)Cre基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到大小為650bp的條帶(表達(dá)Vil-Cre)的小鼠即為所述Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠。

本發(fā)明以Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠作為ADPKD動(dòng)物模型，進(jìn)行了Shh信號(hào)通路抑制劑—Vismodegib對(duì)常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)治療的效果研究，結(jié)果表明， Shh信號(hào)通路抑制劑—Vismodegib對(duì)于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎具有一定的效果，具體體現(xiàn)在：(1)可減弱Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎囊腫程度；(2)可降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟體重比；(3)可降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的血液中肌酐和/或尿素氮的含量；(4)可降低Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟纖維化程度。本發(fā)明對(duì)于常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)發(fā)病機(jī)制的分析，對(duì)于治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)的藥物的研發(fā)均具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為回交后代小鼠基因型的PCR檢測(cè)結(jié)果。其中，A為針對(duì)Pkd2基因PCR檢測(cè)結(jié)果，Pkd2^f3/f3為Pkd2基因純合，Pkd2^+/f3為Pkd2基因雜合；B為針對(duì)Cre基因的PCR檢測(cè)結(jié)果，Vil-cre為表達(dá)Vil-Cre；WT為不表達(dá)Vil-Cre。

圖2為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠模擬人類ADPKD的疾病表型。其中，A為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠腎臟形態(tài)；B為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠肝臟形態(tài)；C為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠胰腺形態(tài)；D為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面；E為Pkd2^f3/f3小鼠的腎臟橫切面。

圖3為兩組小鼠的腎臟HE染色結(jié)果。其中，A表示對(duì)照組；B表示治療組。A和B中，1、2、3、4均表示兩組不同個(gè)體小鼠的腎臟HE染色結(jié)果。

圖4為兩組小鼠的腎臟體重比測(cè)定結(jié)果。

圖5為兩組小鼠的血液中尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的含量測(cè)定結(jié)果。其中，A表示肌酐含量；B表示尿素氮含量。

圖6為兩組小鼠的腎臟纖維化程度測(cè)定結(jié)果。其中，A表示治療組小鼠腎臟Masson纖維化染色結(jié)果；B表示對(duì)照組小鼠腎臟纖維化面積的比較；C表示對(duì)照組和治療組小鼠腎臟纖維化面積的比較。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

Pkd2^f3/f3小鼠：記載于“l(fā)ngyu Kim,Tianbing Ding,Yulong Fu,et al.Conditional Mutation of Pkd2Causes Cystogenesis and Upregulatesβ-Catenin.J Am Soc Nephrol,2009(20):2556-2569”一文中。其構(gòu)建及鑒定過(guò)程大體如下：首先，在Pkd2基因的3號(hào)外顯子兩側(cè)插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)，在陽(yáng)性選擇性Neo的兩側(cè)有FRT位點(diǎn)，由于該結(jié)構(gòu)沒(méi)有完全阻斷正常Pkd2基因的表達(dá)，所以用這種載體通過(guò)基因打靶技術(shù)產(chǎn)生的Pkd2^nf3小鼠可避免死于胚胎期。再將Pkd2^nf3小鼠與ACTB-Flep小鼠雜交，即產(chǎn)生沒(méi)有Neo元件的Pkd2^f3/f3小鼠。鑒于在Pkd2^f3/f3小鼠中沒(méi)有觀察到多囊表型，PC2的表達(dá)也沒(méi)有發(fā)生改變，認(rèn)為這種Pkd2^f3等位基因不會(huì)導(dǎo)致Pkd2的表達(dá)失活。

帶有Vil-Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠：購(gòu)自The Jackson Laboratory，Strain Name：B6.SJL-Tg(Vil-cre)997Gum/J，Stock Number：004586，詳見(jiàn)網(wǎng)址：http://jaxmice.jax.org/strain/004586.html。

Vismodegib(GDC-0449)：Chemie Tek公司，產(chǎn)品目錄號(hào)ctg0449。分子量：421.3；化學(xué)式：C₁₉H₁₄C_l2N₂O₃S；CAS號(hào)：879085-55-9；溶解性(25℃)：DMSO 84mg/mL，水<1mg/mL，乙醇4mg/mL；穩(wěn)定性：2年-20℃粉狀，2周4℃溶于DMSO，6月-80℃溶于DMSO。

實(shí)施例1、Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠模型的構(gòu)建及鑒定

Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠是利用Cre-loxP系統(tǒng)建立的可以條件性敲除Pkd2的小鼠模型，可產(chǎn)生與人類常染色體顯性遺傳性多囊腎(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease，ADPKD)類似臨床表型，并早期死于腎衰竭，可作為ADPKD動(dòng)物模型。其構(gòu)建及鑒定過(guò)程如下：

一、Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠模型的構(gòu)建

將Pkd2^f3/f3小鼠與帶有Vil-Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(B6.SJL-Tg(Vil-cre)997Gum/J)進(jìn)行雜交，得到F1代(理論上有1/2后代的基因型為Vil-Cre:Pkd2^+/f3；1/2后代的基因型為Pkd2^+/f3)；將F1代中Vil-Cre:Pkd2^+/f3小鼠(針對(duì)Cre基因進(jìn)行PCR鑒定，具體方法參見(jiàn)下文，經(jīng)鑒定得到大小為650bp目的條帶的F1代小鼠)與Pkd2^f3/f3小鼠進(jìn)行回交，得到回交后代。

從以上所得回交后代中，篩選得到Pkd2基因純合，同時(shí)可表達(dá)Vil-Cre的小鼠，具體操作如下：

提取回交后代鼠尾基因組，以其為模板，分別對(duì)Pkd2基因以及Cre基因進(jìn)行PCR鑒定，其中針對(duì)Pkd2基因的PCR所用引物序列為如下三條：5’-TCT GAC TTG CAG ACT GTG GG-3’，5’-AGG TAG GGG AAG GTC AGG GTT GG-3’，5'-TTTACGTCCAGCCAAGCT-3'；針對(duì)Cre基因的PCR所用引物序列為如下兩條：5’-CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG-3’，5’-TGC CAC GAC CAA GTG ACA GC-3’。當(dāng)采用針對(duì)Pkd2基因的三條引物在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，如果得到大小分別為650bp和350bp的兩個(gè)條帶，則對(duì)應(yīng)的回交后代小鼠為Pkd2基因雜合(Pkd2^+/f3)，如果得到大小為650bp的單一條帶，則對(duì)應(yīng)的回交后代小鼠為Pkd2基因純合(Pkd2^f3/f3)；當(dāng)采用針對(duì)Cre基因的兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，如果得到大小為650bp的目的條帶，則對(duì)應(yīng)的回交后代小鼠表達(dá)Vil-Cre，如果沒(méi)有得到大小為650bp的目的條帶，則對(duì)應(yīng)的回交后代小鼠不表達(dá)Vil-Cre。

結(jié)果如圖1所示，圖1中A中的Pkd2^f3/f3為Pkd2基因純合，圖1中B中的Vil-cre 為可表達(dá)Vil-Cre。經(jīng)過(guò)以上鑒定，從回交后代中得到的Pkd2基因純合，同時(shí)可表達(dá)Vil-Cre的小鼠，即為Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠。Vil-Cre為受控于Villin1啟動(dòng)子的Cre酶，其中villin1啟動(dòng)子表達(dá)于小鼠胚胎期第12.5天的腸上皮細(xì)胞，小鼠在Cre酶的作用下，可在細(xì)胞水平上產(chǎn)生Pkd2^d3/d3，由于Pkd2^d3/d3等位基因上的3號(hào)外顯子已被剪切掉，進(jìn)而產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致3號(hào)外顯子下游不遠(yuǎn)處產(chǎn)生終止子，進(jìn)而使Pkd2基因產(chǎn)物PC2成為截?cái)嗟鞍住?/p>

二、Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠模型的鑒定

常規(guī)飼養(yǎng)步驟一得到的Vil-Cre::Pkd2^f3/f3小鼠，觀察其存活狀態(tài)。待小鼠四月齡，取其腎臟、肝臟、胰腺，觀察病變情況；另外對(duì)腎臟進(jìn)行HE染色分析(具體操作參見(jiàn)實(shí)施例2相關(guān)步驟)。同時(shí)設(shè)置Pkd2^f3/f3小鼠作為對(duì)照。

結(jié)果顯示：步驟一得到的Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠在第4～5月左右死亡，其腎臟、肝臟、胰腺均出現(xiàn)嚴(yán)重的囊腫，而且腎臟的HE染色結(jié)果進(jìn)一步表明腎臟無(wú)腎實(shí)質(zhì)，腎功能嚴(yán)重受損，判定Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠死于腎囊腫導(dǎo)致的腎衰竭，而同窩同齡的Pkd2^f3/f3小鼠則表型正常。具體結(jié)果如圖2所示。

以上結(jié)果表明，步驟一得到的Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠表型與人類ADPKD患者相似，可作為ADPKD動(dòng)物模型。

實(shí)施例2、Vismodegib在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用

本實(shí)施例以Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠作為ADPKD動(dòng)物模型，研究分析Vismodegib在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎中的應(yīng)用。具體如下：

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、實(shí)驗(yàn)分組及處理

Vismodegib溶液：將Vismodegib用DMSO溶解，至其濃度為80mg/mL，后用生理鹽水稀釋至2mg/ml。

分組及處理：分為治療組和對(duì)照組，每組各10只Vil-Cre:Pkd2^f3/f3小鼠。從小鼠出生后第十天開(kāi)始，進(jìn)行連續(xù)一周的皮下注射，后改為腹腔注射，每天給藥直至小鼠兩月齡停藥，治療組每只小鼠按50mg/kg(每kg體重給50mg Vismodegib)的劑量給藥；對(duì)照組每只小鼠每天注射等體積的含有等量DMSO的生理鹽水。

2、各組小鼠治療情況分析

(1)HE染色分析兩組小鼠的腎囊腫表型

在小鼠兩月齡停藥后，每組隨機(jī)選取5只小鼠，處死后，摘除雙側(cè)腎臟。在電子天平上精確稱重，計(jì)算腎臟體重比(g/g)，即雙側(cè)腎臟重量(g)/體質(zhì)量(g)。后將雙側(cè)腎臟沿著矢狀面切開(kāi)，用10％中性福爾馬林溶液固定24小時(shí)，后梯度乙醇脫水， 然后用石蠟包埋機(jī)常規(guī)包埋，蠟塊待后行切片及HE染色。

A.脫水包埋

具體步驟：①脫水：70％乙醇1h→75％乙醇1h→80％乙醇1h→85％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇1h→100％乙醇1h→二甲苯15min×2；②包埋：石蠟包埋機(jī)進(jìn)行包埋。

B.切片

將腎臟蠟塊在輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)上做成3μm厚度的連續(xù)腎組織切片，用毛筆輕輕扶起，在溫水中將其充分展開(kāi)，再用多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片撈起腎組織切片，電熱干燥機(jī)烤干，然后放于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱里中，70℃恒溫烘烤1小時(shí)，以使組織切片與玻片緊密粘連，置于盒中備用。

C.HE病理染色

原理：蘇木精(hematoxylin)染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色；伊紅(eosin)為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

步驟：

①二甲苯脫蠟，后用100％乙醇洗去；

②不同濃度的乙醇依次水化；

③磷酸緩沖液搖床緩洗5分鐘；

④蘇木精浸提8次；

⑤流水沖洗5分鐘；

⑥鹽酸酒精浸提8次；

⑦流水沖洗2分鐘；

⑧伊紅染色10分鐘；

⑨不同濃度的乙醇依次脫水；

⑩二甲苯透明，后用中性樹(shù)膠封片；顯微鏡觀察。

⑾結(jié)果顯示：細(xì)胞漿紅色，細(xì)胞核藍(lán)紫色。

(2)兩組小鼠ADPKD相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

本發(fā)明的發(fā)明人為了準(zhǔn)確反應(yīng)出治療組小鼠腎肝功能的改善程度，進(jìn)一步對(duì)兩組小鼠血液中尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的含量進(jìn)行了測(cè)定，以此確切反應(yīng)腎功能的變化情況，反映出囊腫的嚴(yán)重程度。具體操作如下：

在小鼠兩月齡時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠乙醚麻醉，從下腔靜脈抽取小鼠血液，離心后獲取上清即為血清。對(duì)血清進(jìn)行化驗(yàn)即可測(cè)得肌酐及尿素氮含量。

(3)Masson染色分析兩組小鼠的腎纖維化表型

在小鼠兩月齡停藥后，每組隨機(jī)選取5只小鼠，處死后，摘除雙側(cè)腎臟。將雙側(cè)腎臟沿著矢狀面切開(kāi)，用Bouin氏液固定12小時(shí)，后流水沖洗一晚，梯度乙醇脫水，然后用石蠟包埋機(jī)常規(guī)包埋，蠟塊待后行切片及Masson染色。Masson染色的腎臟切片拍照后計(jì)算纖維化面積。

A.Masson染色

原理：Masson染色時(shí)膠原纖維被苯胺藍(lán)所染呈藍(lán)色，肌纖維被酸性品紅所染呈紅色。

步驟：

①組織固定于Bouin氏液，流水沖洗一晚，常規(guī)脫水包埋；

②切片脫蠟至水；

③Weiger氏鐵蘇木素染5-10分鐘；

④流水稍洗，1％鹽酸酒精分化；

⑤麗春紅酸性品紅液染5-10分鐘；

⑥蒸餾水稍沖洗，1％磷鉬酸水溶液處理約5分鐘；

⑦不用水洗，直接用苯胺藍(lán)液復(fù)染5分鐘；

⑧1％冰醋酸處理1分鐘；

⑨95％酒精脫水多次；

⑩無(wú)水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固

⑾結(jié)果顯示：膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。

B.纖維化面積計(jì)算

Masson染色的腎臟切片拍照后，圖片運(yùn)行于GNU Image Manipulation Program。調(diào)整圖片像素至800×598。將調(diào)整后的圖片運(yùn)行添加網(wǎng)格程序，設(shè)定每個(gè)網(wǎng)格為大小為22×22像素。計(jì)算纖維化區(qū)域網(wǎng)格數(shù)量和腎臟區(qū)域總網(wǎng)格數(shù)量比例即可得到纖維化面積比例。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、兩組小鼠的腎囊腫表型

HE染色結(jié)果如圖3所示，從圖中可以看出，治療組較對(duì)照組具有更多的腎實(shí)質(zhì)，且治療組小鼠的腎囊腫表型明顯少于對(duì)照組。另外，對(duì)治療組與對(duì)照組小鼠的腎臟體重比(g/g)測(cè)定結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示治療組的腎臟體重比(g/g)顯著小于對(duì)照組(p＝0.0099)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2、兩組小鼠ADPKD相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定

兩組小鼠的血液中尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的含量測(cè)定結(jié)果如圖5所示，結(jié)果顯示，治療組小鼠的血液中尿素氮(BUN)與肌酐(CRE)的含量較對(duì)照組相比， 均有下降趨勢(shì)，其中尿素氮含量有顯著差異，p＝0.048。

3、兩組小鼠的腎纖維化表型

兩組小鼠的腎臟纖維化程度測(cè)定結(jié)果如圖6中Masson染色結(jié)果所示。從圖6中A和圖6中B可以看出，治療組較對(duì)照組纖維化程度明顯降低。圖6中C為對(duì)照組和治療組小鼠腎臟纖維化面積的比較。從圖6中C可以看出，治療組小鼠的腎纖維化面積明顯少于對(duì)照組(p＝0.021)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜合本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可見(jiàn)Vismodegib在治療常染色體顯性遺傳性多囊腎(ADPKD)中具有一定作用。