一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高純度秋茄葉總黃酮的制備方法，包括如下步驟：（1）取秋茄葉粉碎成粗粉，用15倍的體積分數(shù)60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取時間為0.5~1.5h，提取溫度為60~80℃，合并提取液；（2）濃縮步驟（1）所得的提取液使其濃度為5mg/ml，離心，取上清液，用非極性大孔吸附樹脂純化，吸附30min，水洗除雜，再用35~80%的乙醇洗脫；非極性大孔吸附樹脂為HPD722型、HPD100型、HPD826型吸附樹脂中的一種或幾種；（3）收集步驟（2）所得的洗脫液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，即得本品，本品中秋茄葉總黃酮的含量至少為60%。本發(fā)明的方法簡便、高效、環(huán)保，且針對性強，能獲得高純度的、美白祛斑活性強秋茄葉總黃酮。
【專利說明】一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高純度秋茄葉總黃酮的制備方法，屬于生物分離【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]秋前(Kandelia candel)為紅樹科秋前屬植物，秋前為我國紅樹植物中最耐寒的樹種，在我國紅樹植物分布區(qū)自南向北，紅樹植物種類逐漸減少，只有秋茄還有分布，達到最北端28°25’N(浙江樂清)。秋茄中的化學成分主要有黃酮類、鞣質(zhì)類、留醇類、脂肪酸和多糖等。近年來諸多學者對秋茄中的各種化學成分研宄，發(fā)現(xiàn)了一些具備藥物開發(fā)價值的功用，例如學者李寶才在《紅樹林秋茄葉類脂化學及活性物質(zhì)的研宄》一文中報道:秋茄葉總黃酮(含量為29.3%)有抗氧化作用，能明顯降低四氧嘧啶所致高過氧化脂質(zhì)小鼠血清MDA值(中國科學院研宄生院廣州地球化學研宄所，博士畢業(yè)論文，2002.)。此外，本申請的發(fā)明人經(jīng)過前期研宄也發(fā)現(xiàn)了:秋茄葉總黃酮具有較好的抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、抗氧化和抗紫外作用，且作用的強弱與秋茄葉總黃酮的純度有一定的關(guān)聯(lián)。
[0003]現(xiàn)有的秋茄葉總黃酮的制備方法，經(jīng)檢索只有兩篇文獻提及，其一是紀麗麗、宋文東、陳煜藩在《紅樹植物秋茄葉黃酮的提取及抑菌活性實驗》一文中公開的方法:秋茄葉粉末Ikg用5L 60%乙醇浸漬4次，濃縮除去乙醇后離心取上清液，再通過AB-8大孔離子交換樹脂，用去離子水沖洗柱子至清亮，再用75%乙醇沖洗，收集乙醇液，回收乙醇，干燥，得到總黃酮45.3g，總黃酮的含量為17.8%(《天然產(chǎn)物研宄與開發(fā)》，2009年21卷:179-181頁)。其二是李寶才、聞克威等人在《秋茄葉中蘆丁的分離與鑒定》一文中公開的方法:1kg秋茄葉粉末用5L 60%乙醇浸漬4次，濃縮除去乙醇后離心取上清液，再通過DA201大孔離子交換樹脂，用去離子水沖洗柱子至清亮，再用80%乙醇沖洗，收集乙醇液，回收乙醇，干燥，得粗黃酮50.2g，總黃酮的含量為18.9%。將上述粗黃酮45g，研磨成粉，用500ml乙醇/三氯甲烷(3:17)混合溶劑，萃取2次，離心取上清液。殘余物用500ml乙醇/三氯甲烷(1:1)萃取2次，離心，取上清液。合并所有離心液，回收溶劑，干燥，得“精制黃酮”9.6g，黃酮含量為29.3% (《熱帶海洋學報》，2002年21卷第3期)。上述兩種方法的主要缺點在于:所得到的總黃酮純度低，過完大孔樹脂后，純度都小于20%，即使用大量的有毒有機溶劑萃取后，總黃酮含量也沒超過30%，影響藥物開發(fā)功效，且采用有毒有機溶劑萃取也易引發(fā)環(huán)境污染的隱患。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，解決了【背景技術(shù)】中所述的技術(shù)缺陷。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，包括如下步驟:
(I)取秋茄葉粉碎成粗粉，用15倍的體積分數(shù)60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取時間為0.5-1.5h，提取溫度為60~80°C，合并提取液； (2)濃縮步驟(I)所得的提取液使其濃度為5mg/ml，離心，取上清液，用非極性大孔吸附樹脂純化，吸附30min，水洗除雜，再用35~80%的乙醇洗脫；非極性大孔吸附樹脂為HPD722型、HPDlOO型、HPD826型吸附樹脂中的一種或幾種；
(3)收集步驟(2)所得的洗脫液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，即得本品，本品中秋茄葉總黃酮的含量至少為60%。
[0006]本發(fā)明選用的HPD100型、HPD722型和HPD826型非極性大孔吸附樹脂對秋茄葉總黃酮的吸附量和解吸率明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中其他幾種實驗樹脂，如采用靜態(tài)吸附-解吸附實驗(具體實驗方法見具體實施實施方式中記載)進行考察，考察結(jié)果表明，HPD100的吸附量可達到71.99 mg/mL，解吸率87.15%，HPD722的吸附量可達到70.41 mg/mL，解吸率87.40%，HPD826的吸附量可達到66.55 mg/mL，解吸率88.14%，吸附量遠大于現(xiàn)有技術(shù)中的HPD417 的 35.40 mg/mL, DM130 的 49.45 mg/mL, AB-8 的 48.85 mg/mL, DlOl 的 49.84 mg/
mLo
[0007]優(yōu)選的，步驟(I)的提取時間0.5h，提取溫度為80°C。
[0008]優(yōu)選的，步驟(2)優(yōu)選采用HPD722型吸附樹脂純化。在動態(tài)吸附和解吸方面(具體實驗方法見具體實施實施方式中記載)，HPD722型樹脂的吸附量為19.57mg/mL，解吸率97.84%，相比于HPD100、HPD826型的樹脂，吸附量多2.5~3mg/mL，解吸率高8~10%，故本發(fā)明將HPD722型大孔樹脂作為最優(yōu)選擇。
[0009]優(yōu)選的，步驟(2)上清液純化時的上樣濃度優(yōu)選為5mg/ml，上樣流速為2~3BV/h，上樣量為4.5-6.5BVo
[0010]將秋茄葉提取液濃縮到不同的秋茄葉總黃酮含量，比較吸附量，結(jié)果表明，上樣濃度較高為好，但本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當濃度超過5mg/mL時容易堵塞樹脂柱，影響純化效果，故上樣濃度優(yōu)選5mg/mL，既能保證純化效果，又能提高純化效率。
[0011]另外，本申請的發(fā)明人以不同流速進行動態(tài)吸附，考察最優(yōu)上樣流速，取上清液過大孔吸附樹脂柱，分段收集流出液，測定每份收集液的秋茄葉總黃酮濃度，繪制泄漏曲線確定最佳上樣量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上樣流速越慢，吸附量越大，吸附效果越好。上樣流速為3BV/h，吸附量達28.54mg/mL，比6BV/h流速吸附量高出20%，因此確定上樣流速為2~3BV/h。另外，本申請的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)當上樣量大于6.5BV時，秋茄葉總黃酮開始明顯泄露，故樣品液的最大上柱體積優(yōu)選為6.5BV，確保秋茄葉總黃酮泄露少。
[0012]優(yōu)選的，步驟(2)采用50%的乙醇洗脫。不同體積分數(shù)的乙醇溶液洗脫效果不同，50%的乙醇洗脫黃酮的解吸率和總黃酮含量都較高，分別高達95.13%和76.19mg/mL，比其他濃度的乙醇解吸率高5~20%，吸附量高4~14mg/mL ;繼續(xù)增加乙醇濃度，總黃酮的洗脫率稍有降低但是變化不大。因此優(yōu)選50%乙醇為洗脫劑，可以降低溶劑成本。
[0013]優(yōu)選的，步驟(2)乙醇洗脫時的洗脫流速為3?6BV/h，更優(yōu)選3BV/h，洗脫液用量為3~5BV，更優(yōu)選4BV。
[0014]洗脫流速越低，解吸率越高，解吸效果越好，洗脫流速為3BV/h時，解吸效果最好，高達95.02%，因此更優(yōu)選洗脫劑的流速為3BV/h。
[0015]本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當洗脫液收集到2 BV的時候，大部分的黃酮已經(jīng)由大孔樹脂中解吸出來；當收集到4BV的時候，積累解吸率已達到98.61%。說明此時黃酮類化合物已基本洗脫完全，故更優(yōu)選4倍柱體積，可以節(jié)約資源和獲得較高純度的秋茄葉總黃酮。
[0016]優(yōu)選的，一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，包括如下步驟:
(1)取秋茄葉粉碎成粗粉，用60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取時間為0.5h，提取溫度為80°C，合并提取液；
(2)濃縮步驟(I)所得的提取液使其濃度為5mg/ml，離心，取上清液，用HPD722型吸附樹脂純化，純化時上樣濃度為5mg/ml，上樣流速為3BV/h，上樣量為6.5BV ;吸附30min，用3.5BV蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，再用50%的乙醇洗脫，洗脫時的洗脫流速為3BV/h，洗脫液用量為4BV。
[0017](3)收集步驟(2)所得的洗脫液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄葉總黃酮的含量大于70%。
[0018]本發(fā)明提供的一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，方法簡便、高效、環(huán)保，且針對性強，能獲得高純度的、美白祛斑活性強秋茄葉總黃酮。

【具體實施方式】
[0019]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0020]1、秋茄葉總黃酮含量測定采用NaNO2-Al (NO3) 3_NaOH法，具體操作為:用60%乙醇稀釋和定容樣品，加入0.6mLNaN02溶液(5%)搖勻后立即加入0.6mLAl (NO 3) 3溶液(10%)，搖勻后放置6min，加入6mLNa0H溶液(I mol/L)后立即在波長500 nm處測定吸光度。
[0021]2、靜態(tài)吸附-解吸附實驗方法具體為:分別取不同型號已預處理好的濕樹脂，每份1.0mL，置250mL磨口三角瓶中，加入2.63mg/mL提取液樣品80 mL，放置恒溫搖床中25°C, 100 r/min恒溫振蕩12h后將樹脂濾出，濾液定容于100 mL容量瓶，測定濾液中總黃酮濃度。將吸附平衡的樹脂用蒸餾水洗滌后放入錐形瓶中，加入95%乙醇80 mL, 25°C，100r/min振蕩12 h進行洗脫，然后將樹脂濾出，濾液定容于100 mL容量瓶，測定洗脫液中總黃酮濃度，計算總黃酮吸附量，解吸率。
[0022]吸附量和解吸率按下面公式計算:
Q=(C1V1-C2V2) / V0
R=C3XV3/ QXV1
其中，Q-吸附量(mg/mL) ;R-解吸率(％) ;C1_吸附前溶液中總黃酮的濃度(mg/mL)；C2-吸附后樣品液中總黃酮的濃度(mg/mL) ;C3_洗脫液中總黃酮濃度(mg/mL) ；V0-樹脂體積(mL) ；V1-樣品液體積(mL) ；V 2-吸附液體積(mL) V3-洗脫液體積(mL)。
[0023]3、動態(tài)吸附-解吸附實驗方法具體為:取預處理好的大孔樹脂裝柱(樹脂柱體積20mL，固定徑高比1:6)，加入2.88mg/mL的提取液至流出液中顯色反應呈陽性，靜置30min，用蒸餾水洗柱至無色，收集蒸餾水并測體積和吸光度。用80%乙醇進行洗脫至顯色反應陰性，收集洗脫液測體積和吸光度，計算吸附量，解吸率。
[0024]吸附量(mg/mL)=(CJ1-C5isV5is-C7mV7m ) /V 解吸率(qZq)=CbiVbi/ (C± N1-Cm Nm-CymNym ) X 100%
其中，c±為上樣液中黃酮濃度，V±為上樣液總體積，Cm為過柱流出液中黃酮平均濃度，Va為過柱流出液總體積，(^|為蒸餾水洗脫下來的黃酮平均濃度，為洗脫的蒸餾水體積，Cs為乙醇洗脫下來的黃酮平均濃度，Vs為洗脫的乙醇總體積，V為樹脂的體積，
實施例1: (1)提取:取秋茄葉粉碎成粗粉，取lOOOg，以體積分數(shù)60%的乙醇為提取劑，料液比1:15 (質(zhì)量與體積比)，提取溫度80 0C，提取時間0.5 h，提取2次；
(2)分離純化:以HPD722大孔吸附樹脂對步驟(I)獲得的秋茄葉總黃酮進行純化，具體純化工藝為:上樣總黃酮濃度為5.0 mg/mL,上樣流速為3BV/h，上樣量為6.5 BV樹脂柱體積，吸附時間30 min,以3.5倍水沖洗除雜，洗脫劑為體積分數(shù)50%的乙醇，洗脫流速為3BV/h，洗脫劑用量為4 BV樹脂柱體積，收集乙醇液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，得到黃棕色秋茄葉總黃酮粉末94.51g，總黃酮含量為77.58%。
[0025]實施例2
(1)提取:取秋茄葉粉碎成粗粉，取1000g，以體積分數(shù)70%的乙醇為提取劑，料液比1:15 (質(zhì)量與體積比)，提取溫度60 °C，提取時間1.5 h，提取2次；
(2)分離純化:以HPD722大孔吸附樹脂對步驟(I)獲得的秋茄葉總黃酮進行純化，具體純化工藝為:上樣總黃酮濃度為5.0mg/mL，上樣流速為2.5BV/h，上樣量為6BV樹脂柱體積，吸附時間30 min,以3.5倍水沖洗除雜，洗脫劑為體積分數(shù)35%的乙醇，洗脫流速為4BV/h，洗脫劑用量為4 BV樹脂柱體積，收集乙醇液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，得到黃棕色秋茄葉總黃酮粉末93.23g，總黃酮含量為75.11%。
[0026]實施例3
(1)提取:取秋茄葉粉碎成粗粉，取1000g，以體積分數(shù)70%的乙醇為提取劑，料液比1:15 (質(zhì)量與體積比)，提取溫度80 0C，提取時間0.5 h，提取2次；
(2)分離純化:以HPD100大孔吸附樹脂對步驟(I)獲得的秋茄葉總黃酮進行純化，具體純化工藝為:上樣總黃酮濃度為5.0mg/mL,上樣流速為3BV/h，上樣量為5.5 BV樹脂柱體積，吸附時間30 min，以3.5倍水沖洗除雜，洗脫劑為體積分數(shù)50%的乙醇，洗脫流速為3BV/h，洗脫劑用量為4 BV樹脂柱體積，收集乙醇液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，得到黃棕色秋茄葉總黃酮粉末85.51g，總黃酮含量為65.21%。
[0027]實施例4
(1)提取:取秋茄葉粉碎成粗粉，取1000g，以體積分數(shù)70%的乙醇為提取劑，料液比1:15 (質(zhì)量與體積比)，提取溫度80 0C，提取時間0.5 h，提取2次；
(2)分離純化:以HPD826大孔吸附樹脂對步驟(I)獲得的秋茄葉總黃酮進行純化，具體純化工藝為:上樣總黃酮濃度為5.0mg/mL,上樣流速為2BV/h，上樣量為4.5 BV樹脂柱體積，吸附時間30 min，以3.5倍水沖洗除雜，洗脫劑為體積分數(shù)50%的乙醇，洗脫流速為5BV/h，洗脫劑用量為4 BV樹脂柱體積，收集乙醇液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，得到黃棕色秋茄葉總黃酮粉末84.25g，總黃酮含量為64.51%。
[0028]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【權(quán)利要求】
1.一種高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，包括如下步驟: (1)取秋茄葉粉碎成粗粉，用15倍的60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取時間為0.5-1.5h，提取溫度為60~80°C，合并提取液； (2)濃縮步驟(1)所得的提取液使其濃度為5mg/ml，離心，取上清液，用非極性大孔吸附樹脂純化，吸附30min，水洗除雜，再用35~80%的乙醇洗脫；所述非極性大孔吸附樹脂為HPD722型、HPDlOO型、HPD826型吸附樹脂中的一種或幾種； (3)收集步驟(2)所得的洗脫液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄葉總黃酮的含量至少為60%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:所述步驟(I)的提取時間優(yōu)選0.5h，提取溫度優(yōu)選80°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:所述步驟(2)中非極性大孔吸附樹脂優(yōu)選HPD722型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:所述步驟(2)上樣流速為2~3BV/h，上樣量為4.5-6.5BV。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:所述步驟(2)米用50%的乙醇洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:所述步驟(2)乙醇洗脫時的洗脫流速為3?6BV/h，洗脫液用量為3~5BV。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度秋茄葉總黃酮的分離純化方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)取秋茄葉粉碎成粗粉，用15倍的體積分數(shù)60~70%的乙醇溶液提取2次，每次的提取時間為0.5h，提取溫度為80°C，合并提取液； (2)濃縮步驟(I)所得的提取液使其濃度為5mg/ml，離心，取上清液，用HPD722型吸附樹脂純化，純化時上樣濃度為5mg/ml，上樣流速為3BV/h，上樣量為6.5BV ;吸附30min，用3.5BV蒸餾水洗去水溶性雜質(zhì)，再用50%的乙醇洗脫，洗脫時的洗脫流速為3BV/h，洗脫液用量為4BV ； (3)收集步驟(2)所得的洗脫液，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，即得本品，所述本品中秋茄葉總黃酮的含量大于70%。
【文檔編號】A61K127/00GK104473981SQ201410725902
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】李成平, 唐嵐, 饒桂維, 計燕萍, 徐興, 嚴小平, 活潑 申請人:浙江樹人大學