一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白及其應(yīng)用，本發(fā)明的針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為含有人乳頭瘤病毒16亞型E7原癌蛋白的融合蛋白，本發(fā)明還進(jìn)一步公開(kāi)了一種重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的基因組中整合有密碼子優(yōu)化的HPV16E7的編碼基因。本發(fā)明的融合蛋白或其編碼基因或重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌可用于制備宮頸癌疫苗。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的蛋白及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的融合蛋 白及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌居于全球女性癌癥發(fā)病率的第二位，是重要的公共健康問(wèn)題。全球每年新 發(fā)宮頸癌病例約50萬(wàn)，有27. 3萬(wàn)人死于宮頸癌，其中約85%死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家， 中國(guó)每年新增宮頸癌病例約有13. 5萬(wàn)，占全球新發(fā)病例的1/3,因此中國(guó)也是宮頸癌高發(fā) 國(guó)之一。當(dāng)前，人乳頭瘤病毒（HPV)已被證實(shí)是引起宮頸癌的主要病原，至少在99%宮頸癌 患者組織內(nèi)檢測(cè)到HPV DNA。
[0003] 依據(jù)HPV的致癌危險(xiǎn)性，分類(lèi)為低危型和高危型。高度致癌危險(xiǎn)的病毒主要包括 HPV16、18、26、31、33、35、45、51、52、56、66等亞型，通常在高度鱗狀上皮內(nèi)病變（CIN2?3) 中發(fā)現(xiàn)。其中HPV16、18可在絕大多數(shù)宮頸癌中發(fā)現(xiàn)，并且50%以上的宮頸癌患者由HPV16 引起。2008年6月，歷時(shí)5年的《中國(guó)婦女人乳頭瘤病毒感染和宮頸癌流行病學(xué)調(diào)查》結(jié)果 顯示，HPV16和HPV18是導(dǎo)致中國(guó)婦女患子宮頸癌的最主要類(lèi)型。
[0004] E7蛋白可以抑制Rb (retinoblastoma gene)的抑癌功能，從而以多種方式擾亂正 常細(xì)胞周期，引起細(xì)胞周期的失控，導(dǎo)致細(xì)胞的過(guò)度增殖，細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡變。E7是維持細(xì)胞 轉(zhuǎn)化和惡性癌變所必需的，因此E7常作為HPV血清學(xué)診斷抗原和宮頸癌治療性疫苗研究的 革巴抗原。
[0005] 單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)是一種宿主譜廣泛的兼 性胞內(nèi)菌。LM被巨噬細(xì)胞和其它吞噬細(xì)胞吞噬后，既能存在于吞噬體內(nèi)，又能定居在細(xì)胞胞 漿中，使LM運(yùn)送的外源抗原可以同時(shí)進(jìn)入MHC I類(lèi)和MHC II類(lèi)抗原提呈途徑，從而誘導(dǎo)強(qiáng) 烈的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答。這種獨(dú)特的胞內(nèi)生活史，使單增李斯特菌成為研究 宿主和細(xì)菌相互作用及宿主免疫應(yīng)答的模式細(xì)菌，尤其誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，其 作為傳染性疾病和腫瘤疾病疫苗載體具有廣闊應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種具有宮頸癌免疫原性的融合 蛋白及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為在減毒重組李斯特菌 中分泌表達(dá)的HPV16 E7的融合蛋白。
[0008] 所述融合蛋白具體為單核細(xì)胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO與HPV16 E7的融 合蛋白。
[0009] 所述HPV16 E7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 所述單核細(xì)胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LLO的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 /Jn 〇
[0011] 所述減毒重組李斯特菌包含編碼HPV16 E7蛋白的多核苷酸，所述編碼HPV16 E7 蛋白的多核苷酸序列為SEQ ID NO. 6。
[0012] 所述融合蛋白中，密碼子優(yōu)化的HPV16 E7蛋白插入于前述單核細(xì)胞增生性李斯特 菌溶血素蛋白LLO的第37位和第38位氨基酸殘基之間。
[0013] 進(jìn)一步的，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 所述融合蛋白針對(duì)宮頸癌具有較強(qiáng)的免疫原性。
[0015] 本發(fā)明第二方面提供了 一種多核苷酸，其編碼所述融合蛋白。
[0016] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。
[0017] 進(jìn)一步的，所述多核苷酸中，編碼HPV16 E7的基因序列為SEQ ID NO. 6。
[0018] 所述多核苷酸可用于構(gòu)建HPV16 E7的表達(dá)載體，并進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)HPV16 E7的 宿主細(xì)胞。
[0019] 本發(fā)明第三方面提供了一種載體，其含有所述多核苷酸。
[0020] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建所述載體。這些方法包括重組DNA技 術(shù)、DNA合成技術(shù)等?？蓪⒕幋a所述融合蛋白的DNA有效連接到載體中的多克隆位點(diǎn)上，以 指導(dǎo)mRNA合成進(jìn)而表達(dá)蛋白，或者用于同源重組。
[0021] 較佳的，所述載體為原核載體或穿梭質(zhì)粒，如原核載體PMD-20T、穿梭質(zhì)粒PKSV7 等。
[0022] 本發(fā)明第四方面提供了 一種宿主細(xì)胞，其被所述載體所轉(zhuǎn)化。
[0023] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門(mén)菌、李斯特 細(xì)菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO, COs. 293細(xì)胞、或Bowes 黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0024] 其中，特別優(yōu)選單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌（Listeria monocytogenes,以下簡(jiǎn)寫(xiě) 為 LM)。。
[0025] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的血清型為l/2a。如yzuLM4等。
[0026] 本發(fā)明第五方面提供了一種重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，所述重組減毒 單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的基因組中，整合有HPV16 E7基因，所述HPV16 E7基因的序列 為SEQID NO. 6,所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌能融合表達(dá)單核細(xì)胞增生性李斯 特菌溶血素蛋白LLO與HPV16 E7的融合蛋白。
[0027] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的血清型為l/2a。如yzuLM4等。
[0028] 進(jìn)一步的，所述編碼HPV16 E7蛋白的基因重組整合于野生型單核細(xì)胞增生李斯特 菌基因組DNA中hly基因的111位與154位堿基之間。
[0029] 進(jìn)一步的，相比野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌，本發(fā)明將野生型單核細(xì)胞增生李 斯特菌hly基因的第112-153位堿基替換為HPV16 E7基因 SEQ ID. 6。亦即，本發(fā)明的重組 減毒單核細(xì)胞增生李斯特菌中，野生型的hly編碼基因被替換成了 SEQ ID NO. 3的融合蛋 白的編碼基因。
[0030] 本發(fā)明第六方面公開(kāi)了所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的構(gòu)建方法，包 括下列步驟：
[0031] 1)合成密碼子優(yōu)化的HPV16 E7蛋白編碼基因片段；從單核細(xì)胞增生李斯特菌株 中擴(kuò)增出待插入位點(diǎn)的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ;
[0032] 2)將步驟1)獲得的密碼子優(yōu)化的HPV16 E7編碼基因及上下游同源臂片段拼接成 hlya_HPV16 E7_hlyb融合片段并連接入穿梭質(zhì)粒獲得重組穿梭質(zhì)粒；
[0033] 3)將步驟2)獲得的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，經(jīng)過(guò)抗性和 溫度雙壓力篩選，再通過(guò)無(wú)抗性傳代得到無(wú)抗性基因的重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì) 菌。
[0034] 進(jìn)一步的，步驟1)中，擴(kuò)增獲得的上游同源臂片段hlya的序列為SEQ ID NO. 4,下 游同源臂片段hlyb的序列為SEQ ID NO. 5, HPV16 E7基因?yàn)镾EQ ID NO. 6。
[0035] 進(jìn)一步的，步驟1)和3)中所述單核細(xì)胞增生李斯特菌株的血清型為l/2a。如為 單核細(xì)胞增生李斯特菌株yzuLM4等。
[0036] 進(jìn)一步的，步驟2)可采用重疊衍生PCR技術(shù)（SOEing PCR)拼接各片段，再利用酶 切位點(diǎn)將拼接片段插入穿梭載體中。
[0037] 進(jìn)一步的，步驟2)中，穿梭質(zhì)?？蔀閜KSV7。拼接成的hlya-E7_hlyb融合片段的 序列為 SEQ ID NO. 7。
[0038] 本發(fā)明第六方面，提供了所述的融合蛋白或其編碼基因或所述重組減毒單核細(xì)胞 增生性李斯特細(xì)菌在制備宮頸癌疾病疫苗上的用途。
[0039] 進(jìn)一步的，所述重組細(xì)菌疫苗為針對(duì)宮頸癌疾病的治療性疫苗。
[0040] 本發(fā)明第七方面，提供了一種疫苗，包括所述融合蛋白或所述重組減毒單核細(xì)胞 增生性李斯特細(xì)菌。
[0041] 所述疫苗中還可進(jìn)一步包括佐劑。
[0042] 本發(fā)明利用單核細(xì)胞增生李斯特菌能在細(xì)胞吞噬體內(nèi)存活，同時(shí)也能從細(xì)胞吞噬 體中"逃逸"出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)繁殖，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的特性。利用 同源重組技術(shù)，將外源融合蛋白基因定點(diǎn)插入到載體生物基因組中。本發(fā)明驚奇的發(fā)現(xiàn)，通 過(guò)對(duì)HPV16 E7編碼基因經(jīng)過(guò)特定的優(yōu)化，獲得的融合表達(dá)HPV16 E7抗原的疫苗相比未優(yōu) 化的融合表達(dá)HPV16 E7抗原的疫苗更能有效提高宿主對(duì)宮頸癌疾病的免疫保護(hù)效應(yīng)，其預(yù) 防及治療效果獲得了進(jìn)一步的提高，為宮頸癌疫苗提供了新的思路。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖 1 是 pKSV7-hlya-E7_hlyb 的 Xba I 與 Kpn I 雙酶切及 PCR 電泳圖；
[0044] Μ: λ -HMarker
[0045] L：DL2000Marker
[0046] I :PCR 結(jié)果
[0047] 2:pKSV7-E7_hly 雙酶切結(jié)果。
[0048] 圖2是重組細(xì)菌的鑒定結(jié)果；
[0049] I:DL2000Marker
[0050] 2:LM4Ahly : : E7-1 PCR 產(chǎn)物。
[0051] 圖3是蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)
[0052] M:預(yù)染 marker
[0053] 123:LM4Ahly : : E7-1 的分泌蛋白
[0054] 4:LM4的分泌蛋白。
[0055] 圖4是分泌融合蛋白LL0-HPV16 E7的溶血活性檢驗(yàn)
[0056] PBS = PBS 對(duì)照組
[0057] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0058] LM4 Λ hly: :E7-1 :E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0059] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌 [0060] 圖5是重組菌對(duì)C57BL/6小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的結(jié)果。
[0061] PBS = PBS 對(duì)照組
[0062] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0063] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0064] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0065] 圖6淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0066] PBS: PBS 對(duì)照組
[0067] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0068] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0069] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0070] 圖7細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
[0071] PBS = PBS 對(duì)照組
[0072] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0073] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0074] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌
[0075] 圖8免疫治療效力評(píng)價(jià)：治療36天時(shí)各免疫組小鼠腫瘤大小的測(cè)定
[0076] PBS = PBS 對(duì)照組
[0077] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0078] LM4 Λ hly: :E7-1:E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0079] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌 [0080] 圖9免疫治療效力評(píng)價(jià)：各免疫組小鼠腫瘤大小的動(dòng)態(tài)測(cè)定
[0081] PBS = PBS 對(duì)照組
[0082] LM4 Λ hly:單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4 Λ hly組
[0083] LM4 Λ hly: :E7-1 :E7密碼子優(yōu)化的重組減毒菌組。
[0084] LM4 Λ hly: :E7 :表達(dá)HPV16 E7抗原的重組李斯特菌

【具體實(shí)施方式】
[0085] 本發(fā)明實(shí)施例采用了下列技術(shù)方案：
[0086] 首先，從公司合成密碼子優(yōu)化的HPV16 E7基因序列命名為E7-1，序列如下（SEQ ID NO:6)：
[0087] Catggtgatacaccaacattacatgaatatatgttagatttacaaccagaaacaacagatttatattgt tatgaacaattaaatgatagtagtgaagaagaagatgaaattgatggtccagcaggtcaagcagaaccagatcgtgc acattataatattgttacattttgttgtaaatgtgatagtacattacgtttatgtgttcaaagtacacatgttgata ttcgtacattagaagatttattaatgggtacattaggtattgtttgtccaatttgtagtcaaaaacca
[0088] 從單核細(xì)胞增生李斯特菌株yzuLM4中擴(kuò)增出hly上游片段和下游片段，經(jīng)膠回收 后得到的hlya_HPV16 E7_hlyb融合片段與pMD_20T(TaKaRa公司）載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送至南京金斯瑞公司并測(cè)序； 將測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行提取質(zhì)粒，進(jìn)而雙酶切，回收目的片段，再與穿梭載體PKSV7連 接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證正確，將陽(yáng)性質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至 yzuLM4感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)抗性和溫度雙壓力篩選，再通過(guò)無(wú)抗性傳代得到無(wú)抗性基因的同 源重組單核細(xì)胞增生李斯特菌。該菌為一種重組減毒菌LM4 Ahly:: E7-1。該菌可在正常 生活情況下表達(dá)E7-LL0蛋白。
[0089] 構(gòu)建重組減毒菌具體方法主要包括下列步驟：
[0090] 1.用PCR技術(shù)擴(kuò)增出目的基因 E7-1以及hly基因待插入位點(diǎn)的上下游同源片段 hlya、hlyb。所用到的引物如下：
[0091] 正義 E7F :5'-AAAGAAAATTCAATTTCACATGGTGATACACCAACATT-3'（SEQ ID NO. 8)反 義E7R:5'-GTGTTTCTTTTCGATTGGTGGTTTTTGACTACAAATTG-3'（SEQIDN0·9)回收長(zhǎng)為 327bp 的E7-1基因。
[0092] 正義 hlyaF :5'-CACGGGTACCAGGTTTGTTGTGTCAGGTAGAGC-3'（SEQ ID NO. 10)反義 hlyaR :5'-TGTTGGTGTATCACCATGTGAAATTGAATTTTCTTTAT-3'（SEQ ID NO. 11)回收長(zhǎng)為 543bp 的hlya片段。
[0093] 正義 hlybF :5, -ATTTGTAGTCAAAAACCACCAATCGAAAAGAAACACGC-3,（SEQ ID NO. 12) 反義hlybR:5'-CTAGTCTAGAACTTGAGATATATGCAGGAGG-3'（SEQIDN0·13)回收長(zhǎng)為 750bp 的hlyb片段。
[0094] 2.然后利用SOEing PCR技術(shù)將三者拼接起來(lái)，再利用酶切位點(diǎn)將拼接片段插入 穿梭載體PKSV7中。
[0095] hlya 片段和 E7-1 基因 SOEing PCR 拼接為 hlya-E7-l 的方法：采用 hlyaF、E7-1R 引物對(duì)純化的hlya片段、E7-1基因進(jìn)行SOEing PCR拼接?；厥臻L(zhǎng)為816bp的hlya-E7片 段。
[0096] hlya-E7 片段和 hlyb 片段 SOEing PCR 拼接為 hlya-E7-l-hlyb 的方法：采用 hlyaF、hlybR引物對(duì)純化的hlya-E7片段、hlyb進(jìn)行SOEing PCR拼接。回收長(zhǎng)為1548bp 的 hlya-E7-l_hlyb 片段。
[0097] hlya-E7-l_hlyb片段插入穿梭載體pKSV7的方法：將回收的hlya-E7-l_hlyb 片段用Xba I、KpnI酶雙酶切，同時(shí)用Xba I、Kpn I雙酶切穿梭載體pKSV7,然后將 hlya-E7-l_hlyb片段與載體進(jìn)行連接。
[0098] 3.經(jīng)電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pKSV7-hlya-E7-l_hlyb導(dǎo)入單核細(xì)胞增生李斯特菌，在 抗生素和溫度雙重選擇壓力下實(shí)現(xiàn)同源重組，再通過(guò)無(wú)抗性傳代得到無(wú)抗性基因的重組減 毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌。
[0099] 其次，將獲得的重組減毒菌LM4 Ahly : : E7-1分泌蛋白進(jìn)行Western-blotting實(shí) 驗(yàn)。一抗為鼠免蛋白E7陽(yáng)性血清，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，顯色劑為DAB 和ECL，結(jié)果顯示LM4Ahly :: E7-1分泌的蛋白與E7陽(yáng)性血清發(fā)生特異性的免疫學(xué)反應(yīng)。
[0100] 同時(shí)，對(duì)獲得的重組減毒菌LM4 Λ hly :: E7-1的安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，結(jié)果表明所 獲得的重組減毒菌LM4Ahly :: E7-1與yzuLM4菌株相比較，其毒性明顯下降，表明其在安 全性方面是可靠的。
[0101] 進(jìn)一步的，對(duì)獲得的重組減毒菌LM4 Ahly : : E7-1的免疫保護(hù)性方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)， 結(jié)果表明所獲得的重組減毒菌LM4 Ahly :: E7-1能夠誘導(dǎo)荷瘤小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)效 應(yīng)，且更傾向于Thl型的免疫應(yīng)答；與對(duì)照組PBS組、LM4Ahly :: E及LM4Ahly組相比較， 重組減毒菌LM4 Λ hly :: E7-1可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。
[0102] 實(shí)施例1基因工程菌的構(gòu)建
[0103] I. 1引物的設(shè)計(jì)
[0104] 根據(jù)公司合成的密碼子優(yōu)化的HPV16 E7基因序列（SEQ ID.6)分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異 性的引物E7F、E7R，引物由北京六合華大基因合成。
[0105] 根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4的基因組DNA的LLO上下游序列分別設(shè)計(jì)一 對(duì)特異性的引物，引物由北京六合華大基因合成，采用引物為hlyaF、hlyaR ;hlybF、hlybR。
[0106] 1.2目的基因的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收以及克隆載體的構(gòu)建
[0107] 采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取單核細(xì)胞增生李斯特菌株yzuLM4基 因組DNA，并從公司合成密碼子優(yōu)化的E7基因序列，分別以其為模板，以E7F、E7R ;hlyaF、 hlyaR，hlybF、hlybR為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25yL:
[0108] 滅菌超純水： 17.35 μ? l〇x高保真酶 BulTbr: 2.5 μ?
[0109] 上游引物（ΙΟΟμιηοΙ/L): 下游引物（ΙΟΟμηιοΙ/L): 高保真DNA聚合酶（51Ι/μυ: 0.15pL dNTP C2.5mmol/L)： 2 μ? 細(xì)菌基因組模板或質(zhì)粒： 1 μ?
[0110] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s， 111^11，11^11，30個(gè)循環(huán)，721：再延伸1〇1^11。？0?產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分離， 用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收327bp，543bp，750bp的DNA片段后，以E7、hlya 回收片段為模板，hlyaF、E7R作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μ L:
[0111] 滅菌超純水： 15.35pL IOx高保真酶 Buffer: 2.5 μ? 上游引物（ΙΟΟμηιοΙ/L): IpL 下游引物（ΙΟΟμπιοΙ/L): 高保真DNA聚合酶（5U4iL): 0.15pL dNTP (2.5mmol/L)： 2 pL 回收片段模板： 各1.5pL
[0112] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin， 30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多 功能DNA純化回收試劑盒回收816bp的DNA片段后以hlyb、hlya-E7-l回收片段為模板， hlyaF、hlyaR作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為25 μ L:
[0113] 滅菌超純水： 15 35μ【 IOx高保真酶 Buffer: 2.5 pL 上游引物（1 ΟΟμηιοΙ/L ): Ιμ? 下游引物（1 ΟΟμιηοΙ/L): 1 μι 高保真DNA聚合酶（5U>L): 0.15pL dNTP (2.5mmol/L)： 2 pL 回收片段模板： 各1.5 μ?^
[0114] PCR 反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 2min， 30個(gè)循環(huán)，72°C再延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多 功能DNA純化回收試劑盒回收1548bp的DNA片段分別與pMD-20T載體在16°C金屬浴條件 下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR與雙酶切驗(yàn)證來(lái)篩選陽(yáng)性克隆。將得到的陽(yáng) 性克隆送至南京金斯瑞測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD-20T-hlya-E7-l-hlyb。
[0115] 其中，pMD-20T-hlya-E7_hlyb的測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO. 14,均符合預(yù)期。
[0116] 1. 3穿梭載體pKSV7-hlya-E7-l_hlyb的構(gòu)建與鑒定
[0117] pMD-20T-hlya-E7-l_hlyb經(jīng)Xba I與Kpn I雙酶切后，酶切產(chǎn)物用濃度為1%的 瓊脂糖凝膠電泳分離，用百泰克多功能DNA純化回收試劑盒回收1548bp的DNA片段后，與 PKSV7載體在16°C金屬浴條件下連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR與雙 酶切驗(yàn)證來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，結(jié)果見(jiàn)圖1。驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pKSV7-hlya-E7-l-hlyb。
[0118] 1. 4 重組菌 LM4 Λ hly : : E7-1 的構(gòu)建
[0119] 采用電轉(zhuǎn)化的方法（2200v、5ms)將重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-hlya-E7-l_hlyb轉(zhuǎn)化感 受態(tài)yzuLM4。接種于BHI培養(yǎng)基，在溫度（42°C )和紅霉素（10μ g/ml)雙重選擇壓力下連 續(xù)傳過(guò)8代以實(shí)現(xiàn)同源重組，使目的基因定點(diǎn)整合進(jìn)細(xì)菌基因組DNA中。再在無(wú)選擇壓力 條件下傳12代以脫去穿梭質(zhì)粒。將菌液稀釋后涂布到BHI平板上30°C培養(yǎng)長(zhǎng)出單菌落， 再將單菌落轉(zhuǎn)種至含有紅霉素（10 μ g/ml)的BHI平板上30°C培養(yǎng)。挑取在BHI平板上生 長(zhǎng)、轉(zhuǎn)種后不再生長(zhǎng)的單菌落，提取基因組后進(jìn)行PCR鑒定，鑒定為陽(yáng)性的克隆即為重組菌 LM4Ahly :: E7-1。
[0120] PCR反應(yīng)的引物為：
[0121] hlya+：5-CCGTATTCCTGCTTCTAGTTGTTGG-3(SEQ ID NO. 15)
[0122] hlyb+：5-ACCTCCGTAAATTACGGCTTTGAAG-3(SEQ ID NO. 16)
[0123] PCR 反應(yīng)體系（25 μ 1)為：
[0124] 滅菌超純水： 17 μ-- IOxPCR BuITen 2.5 μ? 上游引物（I ΟΟμιηοΙ/L ): 下游引物（1 ΟΟμηιοΙ/L): Ιμ? Taq 酶（3U4iL): 0.5pL dNTP (2.5mmol/L)； 2 \\L 細(xì)菌基因組模板： I pL
[0125] PCR 反應(yīng)條件為：94 °C 5min ;94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C 2min，28 個(gè)循環(huán)； 72°C lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小應(yīng)為1548bp，見(jiàn)圖2。
[0126] 由圖2結(jié)果可知，目的基因片段成功的定點(diǎn)整合到單核細(xì)胞增生李斯特菌 yzuLM4基因組中，且在無(wú)抗壓力傳代下，成功脫去了質(zhì)粒，得到了無(wú)抗性的重組減毒菌 LM4Ahly :: E7-1。
[0127] 重組減毒菌LM4 Λ hly : : E7的構(gòu)建：
[0128] 合成HPV16 E7基因序列及其特異引物：
[0129] HPV16 E7 的基因序列（SEQ ID NO. 17):
[0130] atgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagatttgcaaccagagacaactgatctctac tgttatgagcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacag agcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtag acattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgttctcagaaaccataa
[0131] PCR擴(kuò)增目的基因 HPV16 E7的引物為：
[0132] 正義：5' -AAAGAAAATTCAATTTCAcatggagatacacctacatt-3'（SEQ ID NO. 18)反義： 5' -GTGTTTCTTTTCGATTGGTGGTGGTTTCTGAGAACAGA-3'（SEQ ID NO. 19)其余步驟及所用體系 均同LM4Ahly :: E7-1的構(gòu)建，最終獲得重組減毒菌LM4Ahly :: E7。減毒菌yzuLM4Ahly 的構(gòu)建（參考 Yuelan Yin, Chenju Zhang, Hui Dong, Zhongwei Niu，Zhiming Pan, Jinlin Huang,Xinan Jiao*. Protective immunity induced by a LL〇-deficient Listeria monocytogenes. Microbio· 54 (4) : 175-183, 2010 文獻(xiàn)的記載構(gòu)建）
[0133] 實(shí)施例2蛋白水平檢測(cè)目的基因的表達(dá)
[0134] 接種實(shí)施案例1中所構(gòu)建的LM4Ahly : : E7-1至BHI液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng) 15小時(shí)后取Iml菌液，離心去除菌體、收集培養(yǎng)上清液。用TCA沉淀法得到的分泌的蛋白并 進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，量出長(zhǎng)與寬，并剪出比膠的長(zhǎng)與寬各短0. 5cm 的NC膜，剪出比膠的長(zhǎng)與寬各短Icm的濾紙，將它們浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，按濾紙一濾紙一 凝膠一NC膜一濾紙一濾紙的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)儀中，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，取出NC膜，置于1 % BSA- PBS封閉液中，封閉過(guò)夜。用含0. 05% Tween20的PBS(PBST)室溫振蕩洗3次，用封閉液按 1:500稀釋鼠免蛋白E7陽(yáng)性血清作為一抗，室溫振搖3h ;用PBST洗5次，每次5min ;用封 閉液按1:3000稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG作為二抗，室溫振搖Ih ;用PBST洗 5次，每次5min ;最后將NC膜分別浸于DAB (3, 3-二氨基聯(lián)苯胺）溶液中顯色和ECL (化學(xué) 發(fā)光底物）顯色，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0135] 由圖3結(jié)果可以看出，用鼠免蛋白E7陽(yáng)性血清作為一抗有66kDa左右的目的條 帶，表明目的片段E7得到了正確的表達(dá)。
[0136] 實(shí)施例3重組菌安全性評(píng)價(jià)
[0137] 3. 1分泌融合蛋白LL0-E7的溶血活性檢驗(yàn)
[0138] 分別接種實(shí)施案例 1 中所構(gòu)建的 LM4Ahly : : E7-1、LM4Ahly : : E7、yzLM4Ahly 至定量體積的BHI液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)15小時(shí)后取Iml菌液，離心去除菌體、收集培 養(yǎng)上清液。調(diào)整上清液0D600至相同大小后，取60 μ 1上清液用PBS (pH 6. 0)從原液到27 等倍梯度稀釋后加入到加入到V形96孔血凝板中，再向各孔中加入20 μ L 1%山羊紅細(xì)胞 懸液，混勻，置于37°C溫箱作用1小時(shí)后觀察溶血情況，以50%紅細(xì)胞發(fā)生溶血的孔的稀釋 度判為溶血效價(jià)。以PBS作為對(duì)照組。結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0139] 結(jié)果表明，單核細(xì)胞增生李斯特菌yzuLM4組的溶血活性在25左右，具有較強(qiáng)的溶 血活性，而重組減毒菌LM4 Ahly :: E7-1溶血效價(jià)在23左右，溶血活性大大降低。使其在 安全性上得到了保障。為該重組減毒菌后續(xù)的發(fā)展提供了安全基礎(chǔ)。
[0140] 實(shí)施例4重組菌的免疫保護(hù)效應(yīng)的評(píng)價(jià)
[0141] 4.1小鼠免疫
[0142] 按照實(shí)施例3. 1中方法制備細(xì)菌，腹腔免疫6-8周齡雌性C57BL/6荷瘤小鼠， LM4 Λ hly :: E7-1和對(duì)照菌株LM4 Λ hly :: E7的免疫劑量為5 X IO8CFU/只，每組6只，同時(shí) 設(shè)定PBS磷酸緩沖液（100 μ L/只），免疫陰性對(duì)照組，LM4 Λ hly組，劑量為2. 15 X IO8CFU/ 只。第一次免疫一周后進(jìn)行第二次免疫,二免7天后撲殺小鼠,進(jìn)行相關(guān)免疫學(xué)試驗(yàn)。
[0143] 4. 2小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的制備
[0144] 將各小鼠摘取眼球采血后脫頸處死，生物安全柜內(nèi)無(wú)菌取出小鼠脾臟，置于盛有 3-5mL冰浴培養(yǎng)基（CM)的平皿中，用磨砂玻片鈍端充分?jǐn)D壓、研磨脾細(xì)胞，使其分散成單 細(xì)胞懸液；經(jīng)200目銅網(wǎng)過(guò)濾后，4°C，1000rpm離心lOmin，棄掉上清，用2-3mL紅細(xì)胞裂解 液重懸沉淀以裂解紅細(xì)胞，37°C作用3-5min，加入2倍體積的PBS終止；4°C，IOOOrpm離心 lOmin，去上清，用新鮮的CM重懸并離心洗滌細(xì)胞兩次，最終將細(xì)胞重懸于CM中，臺(tái)盼蘭染 色后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至IX IO7個(gè)細(xì)胞/mL，冰浴備用。
[0145] 4. 3夾心ELISA定量檢測(cè)特異性IFN- γ和IL-4細(xì)胞因子
[0146] 4. 3. 1細(xì)胞培養(yǎng)上清制備
[0147] 將上述制備的各組小鼠脾臟細(xì)胞懸液調(diào)整至IX IO6個(gè)/50 μ L加至96孔細(xì)胞板 中，再分別加入50 μ L用CM稀釋的Ε749_57多肽（10 μ g/mL)進(jìn)行刺激，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照 (未刺激細(xì)胞），試驗(yàn)中各種處理均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。4°C，IOOOrpm 離心5min，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清備用。
[0148] 4. 3. 2 夾心 ELISA 試驗(yàn)
[0149] 于試驗(yàn)前一天取ELISA板分別包被抗小鼠 IFN- γ mAb及IL-4mAb，2 μ g/mL， 100 μ L/孔，4°C過(guò)夜；次日PBST (磷酸鹽吐溫緩沖液）洗5遍，加入含I % BSA的PBS于 37°C封閉2h ;PBST洗5遍，加入各待檢測(cè)細(xì)胞上清，100 μ L/孔，同時(shí)加入商品化標(biāo)準(zhǔn)品重 組鼠 IFN- γ、IL-4分別從2000和4000pg/mL開(kāi)始做系列倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)照，室 溫靜置反應(yīng)3小時(shí)；PBST洗5遍，分別加入對(duì)應(yīng)的生物素化檢測(cè)抗體IFN- γ -biotin mAb、 IL-4-biotin mAb，1 μ g/mL，IOOuL/ 孔，室溫放置 Ih ;PBST 洗 5 遍，用含 I % BSA 的 PBS 1:1000稀釋鏈親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶（streptavidin HRP)，100 μ L/孔，室溫放置 30min ;PBST洗7遍，加入TMB底物顯色，2Μ H2SCM終止，酶聯(lián)免疫閱讀儀讀取OD45tl值，根據(jù) 繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組細(xì)胞上清中IFN-Y和IL-4細(xì)胞因子的含量（pg/mL)。
[0150] 結(jié)果如圖5所示：
[0151] 在對(duì)PBS陰性對(duì)照組、缺失株LM4Ahly、表達(dá)E7的重組菌株LM4Ahly::E7-l 和LM4 Λ hly: :E7小鼠進(jìn)行兩次免疫后，取出相應(yīng)免疫組小鼠的脾臟細(xì)胞,在體外分別 用E749_57多肽進(jìn)行刺激和孵育培養(yǎng)后，對(duì)脾臟細(xì)胞分泌產(chǎn)生的IFN-γ和IL-4含量測(cè) 定結(jié)果顯示：1)PBS陰性對(duì)照組和缺失株LM4 Λ hly分泌的這兩種細(xì)胞因子的含量極 低，而表達(dá)E7的重組菌株LM4Ahly::E7-l分泌上述兩種細(xì)胞因子的水平極高，這說(shuō)明 LM4 Λ hly: :E7-1免疫小鼠后誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了針對(duì)原癌蛋白E7的特異性免疫應(yīng)答。2)重 組減毒菌LM4Ahly :: E7-1組的IFN-r分泌水平（lOOOpg/mL)顯著高于IL-4的分泌水平 (250pg/mL)，這表明重組菌所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答類(lèi)型更傾向于Thl型的免疫應(yīng)答，即細(xì)胞免 疫應(yīng)答。3)LM4Ahly :: E7-1免疫組的IFN-r分泌水平與LM4 Λ hly: :E7免疫組呈現(xiàn)顯著 性差異。總上所述，LM4 Λ hly: :E7-1免疫小鼠后具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)原癌蛋白E7的Thl 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)E7多肽特異性的細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度顯著高于LM4 Λ hly :: E7,該重組疫 苗對(duì)于宮頸癌疾病的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[0152] 4. 4淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
[0153] 將制備的各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟單細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基調(diào)整濃度至5X IO4個(gè)/50 μ L， 加入96孔細(xì)胞板中，相應(yīng)孔中加入50 μ L Ε749_57多肽（終濃度為10 μ g/mL)進(jìn)行刺激，同 時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照（未刺激細(xì)胞）。每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，然后將細(xì)胞板置37°C、5% CO2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。48h后向各試驗(yàn)孔中加入IOul BrdU標(biāo)記液，37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12h。4°C、1000rpm、8min離心，去除標(biāo)記液，60°C恒溫箱中放置lh，徹底去除孔中剩余水分。 200 μ L/孔加入 fixdenat，37°C孵育 30min 后去除 fixdenat。100 μ L/孔加入 anti-BrdU-POD 工作液，37°C孵育90min后去除工作液。PBS洗滌3次，100 μ L/孔加入底物，37°C顯色，顯 色完畢后25 μ L/孔加入IM的H2SO4終止反應(yīng)，OD45tl檢測(cè)吸光度。
[0154] 圖6結(jié)果顯示，在Ε749_57多肽刺激下，LM4Ahly: :Ε7-1免疫組與LM4Ahly: :Ε7免 疫組相比，能夠誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞顯著性增殖（Ρ < 0. 05)，說(shuō)明重組菌LM4 Ahly: :Ε7-1誘 導(dǎo)小鼠細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷活性顯著好于LM4 Ahly: :Ε7。
[0155] 4. 5細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)實(shí)驗(yàn)
[0156] 無(wú)菌取各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟制備單細(xì)胞懸液，將其分為A和B兩等份；A組細(xì)胞 (CFSE high)用10μ g/mL Ε749_57多肽刺激，37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45min ;離心棄上清后用 含5yMCFSE的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min進(jìn)行染色。此時(shí)， B組細(xì)胞（CFSE1?)用含0. 5 μ M CFSE的PBS緩沖液進(jìn)行染色，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 15min進(jìn)行染色。15min后，A、B兩組分別加入5倍體積的預(yù)冷培養(yǎng)基終止反應(yīng)，室溫作用 5min。將A組細(xì)胞及B組細(xì)胞1:1比例混合，以I X IO7細(xì)胞尾靜脈注射各實(shí)驗(yàn)組小鼠。15h 后，取各實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟制備單細(xì)胞懸液，用適量的1% BSA的PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)ACS分析 A組細(xì)胞（CFSEhigh)和B組細(xì)胞（CFSEltw)的細(xì)胞數(shù)量變化。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的特異性 殺傷率計(jì)算：特異性殺傷率=100 - (100X (% CFSEhigh immunized/% CFSE1? immunized)/ (% CFSEhigh control/% CFSEltw control))。
[0157] 圖7結(jié)果顯示，LM4 Λ hly: : E7-1組和LM4 Λ hly: : E7組荷瘤小鼠體內(nèi)的CFSEhigh峰 均要顯著低于CFSElw峰，說(shuō)明重組菌均能誘導(dǎo)荷瘤小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的E7特異性的CTL活性， LM4Ahly: :E7-1免疫組產(chǎn)生的E7特異性的CTL效應(yīng)高于LM4Ahly: :E7組，而PBS組和 LM4 Λ hly組小鼠體內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生特異性的CTL活性。通過(guò)殺傷率公式計(jì)算，LM4 Λ hly: :E7-1 產(chǎn)生的E7特異性殺傷效率為68. 73 %，LM4 Λ hly: :E7產(chǎn)生的E7特異性殺傷效率為 58. 96%，LM4Ahly: :E7-1 殺傷效率比 LM4Ahly: :E7 提高 9. 77%。
[0158] 4. 6二次免疫后小鼠腫瘤大小
[0159] 各組實(shí)驗(yàn)小鼠第一次免疫一周后進(jìn)行第二次免疫,二免7天后撲殺小鼠,解剖小 鼠，取每只小鼠腫瘤，進(jìn)行拍照。結(jié)果如圖8所示。
[0160] LM4Ahly組及PBS組的小鼠，隨時(shí)間的推移腫瘤逐漸生長(zhǎng)，至第36天時(shí)，兩組中 所有小鼠因腫瘤過(guò)大而死亡；而免疫組小鼠經(jīng)過(guò)疫苗LM4Ahly: :E7-1及LM4Ahly: :E7免 疫治療后，部分小鼠體內(nèi)腫瘤完全消除，剩余小鼠則腫瘤生長(zhǎng)緩慢（圖9)，LM4Ahly::E7-l 免疫組與LM4Ahly: :E7免疫組相比，表現(xiàn)出更顯著的治療性作用。
[0161] 以上的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明公開(kāi)的實(shí)施方案，并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限 制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍 和精神的前提下對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體 優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施例。 事實(shí)上，各種如上所述的對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的修改來(lái)獲取發(fā)明都應(yīng)包括 在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種針對(duì)宮頸癌具有免疫原性的融合蛋白，為在減毒重組李斯特菌中分泌表達(dá)的 HPV16E7的融合蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白為單核細(xì)胞增生性李斯特 菌溶血素蛋白LLO與HPV16E7的融合蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 如權(quán)利要求1-3任一所述融合蛋白，其特征在于，所述減毒重組李斯特菌包含編碼 HPV16E7蛋白的多核苷酸，所述編碼HPV16E7蛋白的多核苷酸序列為SEQ ID N0.6。
5. -種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-4任一所述融合蛋白，所述融合蛋白中編碼 HPV16E7的基因序列為SEQ ID NO. 6。
6. -種載體，其含有權(quán)利要求5所述多核苷酸。
7. -種宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化。
8. 如權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為單核細(xì)胞增生性李斯特 細(xì)菌。
9. 如權(quán)利要求8所述宿主細(xì)胞，其特征在于，所述單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的血清 型為l/2a。
10. -種重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特 細(xì)菌的基因組中，整合有HPV16E7基因，所述HPV16E7基因的序列為SEQ ID NO. 6,所述重組 減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌能融合表達(dá)單核細(xì)胞增生性李斯特菌溶血素蛋白LL0與 HPV16E7的融合蛋白。
11. 如權(quán)利要求10所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，其特征在于，所述單核 細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的血清型為l/2a。
12. 如權(quán)利要求10所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，其特征在于，所述單核 細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌為單核細(xì)胞增生李斯特菌株yzuLM4。
13. 如權(quán)利要求10所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，其特征在于，所述編碼 HPV16E7蛋白的基因重組整合于野生型單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA中hly基因的 111位與154位堿基之間。
14. 如權(quán)利要求10-13任一所述重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌的構(gòu)建方法，包 括下列步驟： 1) 合成HPV16E7蛋白編碼基因片段；從單核細(xì)胞增生李斯特菌株中擴(kuò)增出待插入位點(diǎn) 的上游同源臂片段hlya和下游同源臂片段hlyb ; 2) 將步驟1)獲得的HPV16E7編碼基因及上下游同源臂片段拼接成 hlya-HPV16E7_hlyb融合片段并連接入穿梭質(zhì)粒獲得重組穿梭質(zhì)粒； 3) 將步驟2)獲得的重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌，經(jīng)過(guò)抗性和溫度 雙壓力篩選，再通過(guò)無(wú)抗性傳代得到無(wú)抗性基因的重組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌。
15. 如權(quán)利要求1-4任一所述的融合蛋白或其編碼基因或權(quán)利要求11-14任一所述重 組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌在制備宮頸癌疾病疫苗上的用途。
16. -種疫苗，包括如權(quán)利要求1-4任一所述的融合蛋白或權(quán)利要求11-14任一所述重 組減毒單核細(xì)胞增生性李斯特細(xì)菌。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104371025SQ201410666087
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】焦新安, 殷月蘭, 段斐斐, 潘志明, 陳祥, 孫林, 黃金林 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)