本發(fā)明涉及一種預(yù)防及治療糖尿病的藥物組合物，具體涉及含有桑葚和桑白皮為有效成分的干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetes)是多種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點(diǎn)。我國(guó)目前糖尿病的總體患病率已達(dá)9.7％。同期糖尿病前期的患病率高達(dá)15.5％。根據(jù)調(diào)查結(jié)果所做出的推算顯示我國(guó)總糖尿病患病人數(shù)達(dá)9千2百萬(wàn)以上，糖尿病前期人數(shù)達(dá)1億4千8百萬(wàn)以上。糖尿病是胰島β細(xì)胞分泌胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，伴或不伴胰島素抵抗。糖尿病發(fā)病過(guò)程緩慢，機(jī)制尚未完全闡明。

糖尿病的治療幾乎需要貫穿終生，治療主要有胰島素，化學(xué)藥物和中醫(yī)中藥等，其它尚未完全成熟的方法有胰島移植和干細(xì)胞治療。雖然方法不少，但都不能治愈糖尿病，而且糖尿病的發(fā)病率呈快速上升態(tài)勢(shì)。其主要原因是在糖尿病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，胰島β細(xì)胞功能損傷在糖尿病發(fā)病前已經(jīng)存在，這種損傷隨著程度的加重而變?yōu)椴豢赡?。不幸的是糖尿病發(fā)病時(shí)胰島β細(xì)胞功能損傷基本已經(jīng)處于不可逆狀態(tài)，而糖尿病的治療又往往在糖尿病發(fā)生后才開(kāi)始。這就是目前糖尿病不能治愈的主要原因。

有研究表明糖尿病發(fā)病前進(jìn)行干預(yù)治療能有效的阻止或延緩該病發(fā)生，但問(wèn)題在于，由于醫(yī)學(xué)倫理及藥物毒副作用等諸多方面限制，現(xiàn)行的糖尿病治療藥物不能用于人發(fā)病前的預(yù)防性干預(yù)治療。這也為糖尿病的防治研究提供了一個(gè)新的鍥入點(diǎn)，即尋找新的安全的藥物，在糖尿病發(fā)病前，胰島β細(xì)胞功能損傷的早期進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)治療。

在這一點(diǎn)上，中藥經(jīng)過(guò)幾千年的實(shí)踐應(yīng)用，已被證明有效而少有副作用，能用于機(jī)體機(jī)能調(diào)理，健康保健等養(yǎng)生功能而無(wú)醫(yī)學(xué)倫理問(wèn)題。因此中藥在糖尿病的預(yù)防性干預(yù)治療中可以發(fā)揮不可替代的重要作用。桑白皮為桑科植物除去栓皮的根皮，其性味甘、寒。入肝、脾經(jīng)。于冬季采挖，刮去棕黃棕色栓皮，用木槌輕擊，使皮部與木心分離，剝?nèi)“灼ぃ瑫窀?。具有?rùn)肺平喘、利水消腫的功能，主治肺熱喘咳、面目浮腫、小便不利、高血壓等。《本草綱目》載：“桑白皮主治消渴尿多”。桑白皮的有效成分黃酮類化合物具有抗氧化活性，從而具有保護(hù)胰島β細(xì)胞退化和降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用。桑白皮提取物咖啡酸和對(duì)香豆酸可抑制PGE2的含量和COX-2mRNA的表達(dá)，表明桑白皮具有抗炎作用。另外，桑白皮能顯著緩解早期糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)病變。

桑椹，為桑科植物桑的成熟果惠。中醫(yī)認(rèn)為“桑椹味甘性寒，可滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血祛風(fēng)、安神養(yǎng)心、延緩衰老?！鄙ｉ└缓?、氨基酸、維生素、磷脂及礦物質(zhì)等，是維生素C的上等來(lái)源、鉀的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。桑椹同桑葉一樣，具有降血糖、降血脂及抗氧化作用；從桑椹乙酸乙酯提取物分離出的25種多酚化合物均具有顯著的抑制α-葡萄糖苷酶和清除自由基的活性，顯示了桑椹具有抗氧化作用。

以上現(xiàn)有技術(shù)中雖然顯示了桑白皮與桑葚均分別可能具有降血糖的作用，然而現(xiàn)有技術(shù)中卻未給出將桑白皮和桑葚的使用方法。尤其是因?yàn)樯］刂懈缓?，在沒(méi)有弄清楚其機(jī)理及具體有效成分的情況下，擅自服用后富含的果糖將使糖尿病患者的血糖產(chǎn)生急劇的升高，反而不利于患者的健康。再者，烏梅中富含檸檬酸、蘋果酸、及琥珀酸，多食不但損傷牙齒，還會(huì)對(duì)脾胃造成傷害。

在糖尿病的前期干預(yù)治療階段，如何有效控制患者的血糖并不產(chǎn)生副作用是本發(fā)明所提出的課題之一，同時(shí)，為了滿足不同服用人群的需要，提供一種有效且價(jià)格低廉的藥物組合物也本發(fā)明的目的之一。

基于現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本專利所申請(qǐng)的藥物是以純天然植物烏梅、桑椹混合 加工提煉而成的一種具有降血糖功能的藥物，對(duì)預(yù)防胰島β細(xì)胞損傷，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能有特殊的療效。同時(shí)，該桑白皮、桑椹組合物通過(guò)適當(dāng)?shù)呐浔?，消除了該兩種中藥材單獨(dú)服用時(shí)抗糖尿病作用無(wú)法充分顯現(xiàn)，作為前期干預(yù)治療糖尿病的藥物，取得了意想不到的治療效果的同時(shí)，在成本和價(jià)格方便也具有極大的實(shí)用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于為糖尿病在發(fā)病之前提供一種干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人經(jīng)潛心研究發(fā)現(xiàn)了一種干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物，其特征在于，含有桑白皮和桑椹為有效成分。

本發(fā)明所述一種干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物，優(yōu)選有效成分占所述藥物組合物總重量的百分比為：所述桑白皮占60％～８５％，所述桑椹占7％～11％。

本發(fā)明所述一種干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物，更優(yōu)選所述桑白皮占８５％，所述桑椹占11%。

本發(fā)明所述一種干預(yù)治療糖尿病的藥物組合物，還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物在干預(yù)治療糖尿病中的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物組合物含有桑白皮和桑椹為有效成分。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物在干預(yù)治療糖尿病中的應(yīng)用，優(yōu)選所述有效成分占所述藥物組合物總重量的百分比為：所述桑白皮占60％～85％，所述桑椹占7％～11％。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物在干預(yù)治療糖尿病中的應(yīng)用，更優(yōu)選所述桑白皮占85％，所述桑椹占11％。

附圖說(shuō)明

圖1：本發(fā)明實(shí)施方式一例的蒸餾液提取圖。

圖2：本發(fā)明組合物具有降低糖尿病大鼠血糖作用的對(duì)比圖。

圖3：本發(fā)明組合物具有降低糖尿病大鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)曲線下面積的作用的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

下面將具體說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，然而本發(fā)明的實(shí)施方式并不被以下具體實(shí)施方式所限制。

1.桑葚與桑白皮揮發(fā)油的分離收集

揮發(fā)油，又名精油，是一類可隨水蒸氣蒸餾得到的與水不相混溶的油狀液體的總稱。從桑葚和桑白皮的鮮果或其速凍冷藏鮮果中提取揮發(fā)油的常用方法有蒸餾法、溶劑提取法、壓榨法、超臨界液體萃取法。本實(shí)施方式中采用一般中藥揮發(fā)油所采取的水蒸汽蒸餾法，具體方法為常規(guī)方法，也可以采用CN201940071U、CN2928228Y、CN2686690Y等專利文獻(xiàn)中所描述的提取方法。

除了上述從鮮果中提取揮發(fā)油，還可以將原材料通過(guò)各種烘干方式干燥，然后通過(guò)本領(lǐng)域所采用的一般方法制備中藥浸膏，只要在不破壞原料主成分的情況下，本發(fā)明可選用任意方式提取桑葚和桑白皮的主要成分，其中優(yōu)選分離收集揮發(fā)油，因?yàn)閾]發(fā)油中可以將糖分及其它副作用成分降低至合理的范圍內(nèi)。

2.組合物的制備

將上述分別從桑葚和桑白皮中分離收集的揮發(fā)油，按照特定的比例混合，配制組合物原液。還根據(jù)臨床上不同的需求，制成丸劑、散劑、片劑、栓劑、顆粒劑、膜劑、膠囊劑、微囊劑、滴丸劑、氣霧劑、注射劑、膏劑、酒劑、糖漿劑、口服溶液劑、凝膠劑或脂質(zhì)體。

具體實(shí)施方式可以依據(jù)中國(guó)藥典2000年版標(biāo)準(zhǔn)中執(zhí)行。

3.本發(fā)明組合物的效果檢測(cè)

3.1動(dòng)物來(lái)源及模型制備

健康雄性SD大鼠，鼠齡2個(gè)月，體重150～200g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均置于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)環(huán)境一周，自由飲水及標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，保持籠內(nèi)清潔，室溫控制在23±2℃，自然光照(養(yǎng)于寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，相對(duì)濕度為60％～70％。先隨機(jī)選取6只大鼠作為正常對(duì)照組并喂以普通飼料四周。其余大鼠用高糖高脂飼料(15％豬油、20％蔗糖、13蛋黃粉、2％膽酸鈉、50％普通飼料)喂養(yǎng)四周后以30mg/kg的劑量(1周1次，連續(xù)2周)一次性腹腔注射1％鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S0130-1g)檸檬酸緩沖液(以pH為4.2的0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，正常對(duì)照組于尾靜脈同步注射等量的生理鹽水。

兩周后制模的大鼠剪尾取血測(cè)空腹血糖和隨機(jī)血糖，選用空腹血糖值(FBG)≥7.8mol/L，隨機(jī)血糖值≥11.1mol/L的大鼠12只，并隨機(jī)分為糖尿病模型組6只，每天灌胃0.9％生理鹽水；陽(yáng)性藥物對(duì)照組6只，每天灌胃蝦青素。

3.2干預(yù)措施

糖尿病模型制作成功后開(kāi)始干預(yù)治療。桑白皮桑椹按5g/kg劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃4周。正常對(duì)照組同步給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃4周。

本發(fā)明組合物實(shí)驗(yàn)組按照200ml/kg的劑量灌胃，正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組灌胃等溶劑的生理鹽水。其中在配置本發(fā)明的組合物時(shí)，桑葚和桑白皮蒸餾液之外的余份為蒸餾水。灌胃時(shí)間間隔為12小時(shí)。

3.3標(biāo)本的采集與處理

治療結(jié)束后，各組大鼠均測(cè)空腹血糖，稱體重，做好相關(guān)記錄，然后抓緊大鼠直接剪 斷一側(cè)股動(dòng)脈致其死亡，接著對(duì)大鼠進(jìn)行解剖并迅速取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后用4％甲醛固定24h，蒸餾水浸泡4h。取出常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5μm，每隔20片取1片，每個(gè)標(biāo)本取6片，分別裱于涂有聚賴氨酸的載玻片上，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4觀察指標(biāo)

3.4.1一般情況

每日觀察大鼠進(jìn)食，飲水情況，尿量，精神狀況等變化。分別在造模前，造模后，治療后測(cè)體重。

3.4.2血糖測(cè)定

3.4.2.1空腹血糖及隨機(jī)血糖

各組動(dòng)物分別在造模前、造模后、治療后測(cè)空腹血糖(FBG)(mmol/L)，并每隔3天測(cè)一次隨機(jī)血糖，測(cè)空腹血糖前夜，大鼠禁食12h，次日鼠尾靜脈取血，用自動(dòng)血糖儀測(cè)定空腹血糖，并做好相關(guān)記錄。

3.4.2.2口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)

于造模前、造模后、治療后行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)。大鼠禁食12h后，按2g/kg劑量，用50％葡萄糖溶液灌胃，于0h、0.5h、1h、2h取尾靜脈血測(cè)血糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后繪制各組大鼠葡萄糖耐量曲線。

3.4.3病理形態(tài)學(xué)

治療結(jié)束后動(dòng)物處死并迅速摘取胰腺，4℃生理鹽水沖洗干凈后4％甲醛固定24h，蒸餾水浸泡4h。常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，LEICA2135石蠟切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5μm，裱于涂有聚賴氨酸的載玻片上，使用蘇木精-伊紅染色法染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.4.4免疫組織化學(xué)

準(zhǔn)備HIF-1α親和純和抗體、即用型SABC試劑盒，DAB顯色試劑盒。取上述切片置于60℃烤箱考片1h，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，行切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水浸泡2分鐘；加3％過(guò)氧化氫室溫下10分鐘；蒸餾水洗1分鐘×3次；切片置于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液中，微波加熱至沸騰，斷電15分鐘，再次加熱沸騰后自然冷卻；加0.02mol/LPBS洗1分鐘×3次；加5％BSA抗原封閉，室溫下20分鐘，甩去多余液體；滴加一抗(1∶100)稀釋，37℃孵育1小時(shí)；0.02mol/LPBS洗2分鐘×3次；滴加生物素化二抗，37℃孵育20分鐘；0.02mol/LPBS洗2分鐘×3次；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，37℃孵育20分鐘；0.02mol/LPBS洗5分鐘×4次；DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間；蘇木紫復(fù)染10秒，自來(lái)水沖洗；脫水、透明、中性樹(shù)脂封片。光鏡下觀察，特異性染色為片狀棕黃色顆粒。對(duì)每批染色均同步設(shè)立以0.1mol/LPBS液代替一抗的陰性空白對(duì)照。光學(xué)顯微鏡(400倍)下，每張切片隨機(jī)選擇4個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，最后以各組的均數(shù)做比較。

3.4.5免疫熒光染色

組織冰凍切片室溫丙酮(冷丙酮)固定10min，固定后用毛細(xì)滴管吸取經(jīng)適當(dāng)稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min，然后用0.01mol/lpH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體；再滴加間接熒光抗體(如兔抗人γ-球蛋1白熒光抗體等)，再用PBS洗兩次，10min，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，用激光共聚焦顯微鏡鏡下觀察。對(duì)照染色：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。

3.4.6RT-PCR

從組織提取RNA后測(cè)濃度，A1/A2應(yīng)在1.8-2.0之間，將RNA短暫離心后，加入M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1ul、5×RT緩沖液5ul、Oligo(dT)18(20mol/L)2ul、dNTP(20umol/L)2ul、RNA2ug、補(bǔ)去離子水至20ul體積，42℃1h逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，95℃5min滅活M-MLV，再離心，70℃加熱5min，中止上述反應(yīng)，置于冰上，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在PCR反應(yīng)管中嚴(yán)格按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)再依次加入反應(yīng)試劑，再將PCR管插入PCR儀，95℃變性5min；進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)(94℃，1min；退火溫度視引物而定(50-60℃)，1min；72℃，1min)；然后72℃恒溫7min，取出PCR反應(yīng)管，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后取出瓊脂糖凝膠，輕輕地置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)擴(kuò)增條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。

3.4.7Western blot

從組織提取蛋白并定量，經(jīng)10％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜完后稱脫脂奶粉用TBST緩沖液配成5％的濃度封閉，洗膜后加一抗(一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度)孵育1h，再度洗膜后加入用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗并孵育1h，用DAB顯色液顯色1h，用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈上進(jìn)行光密度值。

實(shí)施例

分別將1000g桑葚和烏梅的鮮果(或冷凍鮮果)用攪拌機(jī)攪碎勻漿，置于如圖1所示的蒸餾瓶中，蒸餾后收集蒸餾產(chǎn)物。其中桑葚的蒸餾產(chǎn)物為452g，收率為45.2％，烏梅的蒸餾產(chǎn)物為337g，收率為33.7％。

將上述蒸餾產(chǎn)物進(jìn)行不同比例的配方，并飼喂給模型大鼠及作為對(duì)照的正常大鼠，具體實(shí)驗(yàn)例和對(duì)比例如表1所示。四周飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組大鼠的血液指標(biāo)檢測(cè)值，以葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖的濃度(單位為mg/dl)。

圖2顯示的是本發(fā)明組合物一典型實(shí)驗(yàn)例的結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)組為三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

其中，

a組為正常大鼠的空白對(duì)照

b組為糖尿病模型大鼠的空白對(duì)照

c組為糖尿病模型大鼠經(jīng)本發(fā)明組合物干預(yù)治療后的血糖濃度

d組為單獨(dú)服用桑白皮的糖尿病模型大鼠

e組為單獨(dú)服用桑葚的糖尿病模型大鼠

圖3顯示了本專利所申請(qǐng)的藥物有降低糖尿病大鼠葡萄糖耐量試驗(yàn)曲線下面積的作用，圖中a為正常組，b組，c組，d組和e組分別為糖尿病空白對(duì)照組和不同用藥組，取正常對(duì)照組為1，其余與之對(duì)比。其中，

a組為正常大鼠的空白對(duì)照

b組為糖尿病模型大鼠的空白對(duì)照

c組為糖尿病模型大鼠經(jīng)本發(fā)明組合物干預(yù)治療后的血糖濃度糖尿

d組為單獨(dú)服用桑白皮的糖尿病模型大鼠

e組為單獨(dú)服用桑葚的糖尿病模型大鼠

本發(fā)明的其它實(shí)施例與對(duì)照例的結(jié)果如表1所示，根據(jù)表1所示結(jié)果，可得知使用發(fā)明的藥物組合物后，取得的技術(shù)效果有：

1.與對(duì)照組相比，單獨(dú)飼喂桑白皮或桑葚的蒸餾液，雖然對(duì)糖尿病模型大鼠中高血糖有一定的抑制作用，但是本發(fā)明的組合物卻能將大鼠的血糖降低到更低的水平。，

2.尤其是按照本發(fā)明的比例混合使用桑白皮與桑葚，結(jié)果顯示大鼠的血糖濃度被控制在7-10mg/dl之間的正常值，取得了意想不到的效果。

表1.各實(shí)驗(yàn)例和對(duì)照例中4周后大鼠的血糖濃度