一種金介導(dǎo)的近紅外光熱效應(yīng)與自噬抑制劑聯(lián)合殺傷腫瘤細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種金介導(dǎo)的近紅外光熱效應(yīng)與自噬抑制劑聯(lián)合殺傷腫瘤細胞的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明中自噬抑制劑的引入，可以降低金納米顆粒的用量，使用較低劑量的激光即可獲得良好的腫瘤細胞殺傷效果，從而降低激光和金納米顆粒對正常細胞組織造成危害的風(fēng)險。
【專利說明】一種金介導(dǎo)的近紅外光熱效應(yīng)與自嗤抑制劑聯(lián)合殺傷腫瘤 細胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及金介導(dǎo)的近紅外光熱效應(yīng)與自噬抑制劑的聯(lián)合，用于殺傷腫瘤。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是由于控制細胞周期的相關(guān)基因發(fā)生突變，并且遺傳不穩(wěn)定性累積形成的發(fā) 生在各種人群，年齡階段和不同人體器官上的一種難以治愈的頑疾，嚴重威脅人類的健康 及生命。目前還沒有較為行之有效的診療手段，能夠徹底治愈癌癥。
[0003] 目前治療癌癥的手段主要是：外科手術(shù)直接切除病灶處腫瘤，放療，化療或者以上 幾種治療手段的組合治療。然而，采用手術(shù)治療，很難將所有的腫瘤組織切除，對于難以行 使腫瘤切除的部位，或者非實體瘤，手術(shù)治療將變得束手無措。放化療受限于無法區(qū)分腫瘤 細胞及正常細胞，會對正常細胞產(chǎn)生較大的毒副作用，最終有可能引起癌癥病人較大的毒 副反應(yīng)。
[0004] 納米技術(shù)在癌癥的診療上具有獨特的優(yōu)勢。診療用納米材料具有與核酸、多肽以 及蛋白質(zhì)等生物大分子類似的尺度，使得納米材料極易穿過組織間隙進入組織及細胞內(nèi) 部，通過毛細血管、甚至穿透血腦屏障，躲避機體的生物防御系統(tǒng)，便于生物降解或吸收；納 米顆粒的較大的比表面積，提供了功能基團或活性分子錨定修飾的位點，可以被加工修飾 成多功能性的納米顆粒；納米結(jié)構(gòu)特性（如多孔、中空、多層等），使得納米顆粒具有較高的 藥物載負能力，便于藥物的輸送及藥物緩釋控制；納米顆粒表面可以修飾PEG等分子，可以 通過"滲透-滯留增強效應(yīng)"選擇性的在腫瘤部位選擇性的聚集及滯留，增強腫瘤的診療效 果。
[0005] 納米材料介導(dǎo)的腫瘤光熱治療，是通過選擇性進入腫瘤細胞內(nèi)部的納米顆粒將光 的能量轉(zhuǎn)換為局部熱量殺傷癌細胞的一種方法。此種腫瘤治療手段，可以借助于高效低毒 納米顆粒在腫瘤部位的選擇性聚集，在活體外通過非介入式激光直接照射腫瘤灶，實現(xiàn)腫 瘤的光熱殺傷。具有毒副作用小，靶向治療效果好等特點，其相關(guān)的臨床前及臨床研究試驗 方興未艾。
[0006] 近紅外激光具有較強的深層組織穿透能力，加之，金納米顆粒在近紅外區(qū)的光吸 收特性以及其自身的低毒性，使金介導(dǎo)的光熱治療方案成為腫瘤光熱治療的理想平臺之一
[0007] 自噬是細胞的一種細胞自我降解機制，包括自噬泡的起始，包裹待降解物質(zhì)，最后 形成的自噬泡與溶酶體融合，降解內(nèi)含物的完整過程。自噬與人體的重要生理與病理過程 相關(guān)
[0008] 調(diào)控自噬，可以抑制腫瘤的生長，增強化療藥物、納米抗癌試劑對癌細胞的殺傷效 果。自噬相關(guān)基因 Beeline 1在細胞的正常表達，可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在癌癥發(fā)生的早 期，細胞自噬水平的降低，可以導(dǎo)致癌細胞的持續(xù)增殖，這說明自噬是抑制癌癥的。諸如銀 納米顆粒，本身可以作為抗癌試劑，抑制銀納米顆粒引起的自噬效應(yīng)，可以增強其對腫瘤的 殺傷效果，降低納米制劑的劑量，減少毒副作用。C60，Mn0等納米顆粒也可以通過調(diào)節(jié)細胞 自噬效應(yīng)，增強化療藥物對癌細胞的殺傷，降低化療藥物的使用劑量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于通過聯(lián)合金介導(dǎo)的光熱效應(yīng)及自噬抑制劑，提高金介導(dǎo)的光熱 效應(yīng)對癌細胞的殺傷效果，降低金納米顆粒及激光的使用劑量。
[0010] 本發(fā)明的第一個方面提供一種納米顆粒和自噬抑制劑用于制備基于光熱效應(yīng)殺 傷腫瘤的藥物或試劑盒的用途。
[0011] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述納米顆粒選自金納米顆粒，聚多巴胺納米顆粒，單 壁碳納米管，石墨烯或其組合，優(yōu)選金納米顆粒，所述金納米顆粒包括籠形金納米顆粒，球 形金納米顆粒，棒狀金納米顆粒，星狀金納米顆粒。
[0012] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌，乳腺癌或膠質(zhì)瘤。
[0013] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬抑制劑選自3-MA, Wortmannin(渥曼青霉 素），自噬相關(guān)基因的siRNA、shRNA或其組合。
[0014] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬相關(guān)基因包括Atg5[NCBI Reference S equence:NM_058484. 5], Becline-I[mRNA NCBI Reference Sequence :NM_003766. 3 ； mRNA NCBI Reference Sequence :NM_019584.3],Atg7[mRNA NCBI Reference Sequence:NM_001253717. I ；mRNA NCBI Reference Sequence:NM_001136031. 2]〇
[0015] 本發(fā)明的第二個方面提供自噬抑制劑用于制備增強納米顆粒介導(dǎo)的光熱殺傷腫 瘤的藥物或試劑盒的用途。
[0016] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述納米顆粒選自金納米顆粒，聚多巴胺納米顆粒，單 壁碳納米管，石墨烯或其組合，優(yōu)選金納米顆粒，所述金納米顆粒包括籠形金納米顆粒，球 形金納米顆粒，棒狀金納米顆粒，星狀金納米顆粒。
[0017] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述腫瘤為宮頸癌，乳腺癌或膠質(zhì)瘤。
[0018] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬抑制劑選自3-MA，Wortmannin，自噬相關(guān)基因 的siRNA、shRNA或其組合。
[0019] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述自噬相關(guān)基因包括Atg5，BeCline-l，Atg7。
[0020] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
[0021] 1、自噬抑制劑的引入，可以降低金納米顆粒的用量
[0022] 2、使用較低劑量的激光即可獲得良好的腫瘤細胞殺傷效果，從而降低激光對正常 細胞組織的造成危害的風(fēng)險。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1合成的金納米顆粒的透射電鏡（TEM)結(jié)果；
[0024] 圖2合成的金納米籠子的光熱轉(zhuǎn)換曲線，Au :金納米顆粒；PVP:聚乙烯基吡咯烷 酮；
[0025] 圖3籠形金納米顆粒對細胞活力的影響，Con :空白對照，Au :金納米顆粒；PVP:聚 乙稀基批略燒麗；
[0026] 圖4顯示金介導(dǎo)的光熱效應(yīng)隨金納米顆粒用量的增加，增強對癌細胞的殺傷效 果，Au :金納米顆粒；NIR:近紅外激光；
[0027] 圖5顯示增加激光的照射時間可以增加金納米顆粒殺傷腫瘤細胞的效果Con :空 白對照Au :金納米顆粒；NIR:近紅外激光；
[0028] 圖6金納米顆粒，單獨近紅外激光，以及近紅外激光聯(lián)合金納米顆粒處理 GFP-LC3/HeLa細胞對自噬相關(guān)蛋白LC3的影響，其中A為熒光顯微照片，B為蛋白質(zhì)印記結(jié) 果及相應(yīng)Image J軟件分析結(jié)果，Con :空白對照Au :金納米顆粒；NIR:近紅外激光；Wort : 渥曼青霉素；3-MA:3-甲基腺嘌呤；圖7在HeLa細胞中，自噬抑制劑Wortmannin可以顯著 抑制金吸收近紅外激光引起細胞LC3-II過度積累；
[0029] 圖8自噬抑制劑3-MA，Wortmannin增強金介導(dǎo)的光熱殺傷人宮頸癌細胞HeLa及 小鼠乳腺癌細胞4T1的效果，Con :空白對照Au :金納米顆粒；NIR:近紅外激光，Wort :渥曼 青霉素，3-MA:3-甲基腺嘌呤；
[0030] 圖9Atg 5siRNA沉默ATG5的表達后，可以顯著增強金介導(dǎo)的光熱殺傷人宮頸癌細 胞HeLa的效果。NIR:近紅外激光

【具體實施方式】
[0031] 制備金納米籠子，聚多巴胺納米顆粒所用的化學(xué)試劑均購自于sigma ;基化單 壁碳納米管Short-SWCNT (-C00H，l-2nm，>90 % )及石墨烯購自于南京先豐納米；微管 相關(guān)輕鏈 3(LC3)質(zhì)粒獲贈于 N.Mizushima(東京，日本）[Man，N. ;Chen，Y. ;Zheng，F(xiàn).; Zhou,ff. ；ffen,L. P. , Induction of genuine autophagy by cationic lipids in mammalian cells. Autophagy 2010,6(4)，449-54. ] ;3_methyladenine(3-MA,08592)，海 藻糖（Tre，T9531), Hoechst 33342 (B2261),碘化丙啶（PI, P4864)和氯喹（Chloroquine， CQ，C6628)從sigma公司購買；噻唑藍（MTT，TB0799)從上海生工生物購買；渥曼青 霉素（Wortmmanin，Wo;rt，sl952)購自于碧云天生物科技；細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自于 Invitrogen ;LC3 抗體（NB100-2220)購自于 Novus (Littleton, CO)，綠色突光蛋白抗體 GFP(sc_101536)購自于 Santa Cruz Biotechnology;憐酸甘油醒脫氫酶（GAPDH)抗體 (MAB374)購自于Millipore ;帶有HRP抗鼠的二抗（W4021)及抗兔的二抗（W4011)購自于 Promega (Wisconsin, USA);增強化學(xué)發(fā)光試劑盒購自于 Biological Industries (Kibbutz Beit Haemek, Israel) ;Geneticin/G418(Gibco, 11811-031)溶解在滅菌的去離子水中，制 備成lOOmg/mL的儲液，低溫冷凍保存。
[0032] 實施例1 :金納米籠子的制備及表征
[0033] 銀納米立方體的合成制備：
[0034] IOOmL乙二醇加入到250mL的圓底燒瓶中，隨后放入150°C的油浴中預(yù)熱1小時， 并磁力攪拌。L 2mL，3mM的硫氫化鈉（NaHS)乙二醇溶液加入到反應(yīng)溶液中；2分鐘后，10mL， 3mM鹽酸（HCl)乙二醇溶液加入到反應(yīng)溶液中；隨后加入25mL，20mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮 (PVP，分子量?55000) ;2分鐘后，8mL，282mM的三氟醋酸銀（CF3C00Ag)。反應(yīng)進行20分鐘 左右，通過紫外可見吸收光譜儀確定反應(yīng)溶液吸收光譜在440nm左右（對應(yīng)40nm左右的銀 納米立方體），將反應(yīng)燒瓶迅速置入冰水浴中終止反應(yīng)。所得銀納米立方體用丙酮洗一次， 隨后用去離子水離心洗滌2次，隨后懸浮于15mL的水溶液中待用。
[0035] 金納米立方籠的制備：
[0036] 將20mL去離子水加入到IOOmL反應(yīng)燒瓶中，隨后加入ImL銀納米立方體懸浮液， 然后將ImM的氯金酸溶液以lmL/min的速率滴加到反應(yīng)溶液中，待到吸收光譜紅移到800nm 時,停止滴加氯金酸。將反應(yīng)溶液中加入過量氯化鈉溶液并過夜，以溶解反應(yīng)生成的氯化 銀，隨后離心洗滌3次。
[0037] 如圖 1 所不，透射電鏡（transmition electron microscopy，TEM)的結(jié)果顯不合 成的金納米顆粒為籠形,立方體結(jié)構(gòu),大小為40-60nm。
[0038] 實施例2 :金納米籠子的光熱轉(zhuǎn)換曲線
[0039] 將 400μ L 的 DMEM，PBS，含有 100μ g/mL 聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl Pyrrolidone，PVP)的 400μ L PBS 以及分別含有 0· 5, 1，2,2· 5, 3, 4, 5μ g/mL 的金納米籠子 的400yL體系的PBS，置于透明圓底玻璃管內(nèi)，使用MDL-III-808nm-2.5W的激光器（長春 新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公司）照射管底部，輸出功率為Iw,此時激光器未連接稱合光纖。并使 用熱電偶實時測定管內(nèi)液體的溫度。如圖2所示，結(jié)果表明，金納米顆粒具有較為優(yōu)越的光 熱轉(zhuǎn)換能力。
[0040] 實施例3 :細胞培養(yǎng)及細胞活力實驗
[0041] 人宮頸癌細胞系HeLa細胞和小鼠乳腺癌細胞4T1由ATCC購買獲得。微管相關(guān) 輕鏈3(1X3)質(zhì)粒獲贈于N. Mizushima(東京，日本）。基于此GFP-LC3質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn) J. ；Li, Y. ；ffen, L. P. , Autophagy-mediated chemosensitization in cancer cells by fullerene C60nanocrystal. Autophagy 2009,5(8),1107-1117.】人宮頸癌細胞系 HeLa 細 胞，小鼠乳腺癌細胞4T1及穩(wěn)定表達GFP-LC3的HeLa細胞（GFP-LC3/HeLa)培養(yǎng)在溫度為 37°〇、0) 2濃度為5%的培養(yǎng)箱中，01^1培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清）中含有100皿^8/1^ 的青霉素/鏈霉素和2. 5 μ g/mL的兩性霉素 B。GFP-LC3/HeLa細胞，在使用之前使用G418 進行維持生長一段時間。遵循無菌操作原則，在超凈工作臺中完成細胞培養(yǎng)，傳代，處理等 操作。無菌實驗操作過程中所用到的槍頭、EP管、玻璃瓶等實驗耗材均于121°C，60分鐘高 溫高壓滅菌。
[0042] 細胞培養(yǎng)所用磷酸鹽緩沖液（PBS)的配制：準確稱取氯化鈉（NaCl)8g、磷酸二 氫鉀（KH 2PO4)O. 27g、磷酸氫二鈉（Na2HPO 4)1. 42g、氯化鉀（KCl)O. 2g 加入約 900mL 的 Millipore超純水攪拌至溶解，濃鹽酸將pH調(diào)至7. 4,最后定容總體積1L，121°C高壓滅菌后 于室溫妥善保存。
[0043] HeLa細胞分至96孔中，細胞種植密度為10,000細胞/孔，每孔100 μ L的培養(yǎng)基 體系。待細胞貼壁20-24小時后，使用3. 12, 6. 25, 12. 5, 25, 50, 100, 200 μ g/mL的金納米顆 粒分別處理細胞24小時。每孔加入10 μ L的MTT溶液（5mg/mL，用pH = 7. 4的PBS配制）， 繼續(xù)孵育4小時。小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)基上清液，每孔加入150 μ L的DMSO溶液，待甲噴結(jié) 晶充分溶解后，選擇570nm波長，在酶標儀上測定各個培養(yǎng)孔的光吸收值，記錄結(jié)果并除去 背景吸光度后，繪制細胞的生長曲線，計算細胞活力。
[0044] 如圖3所示，籠形金納米顆粒具有較小的細胞毒性，在100 μ g/mL及以下濃度，對 細胞的活力沒有顯著影響（細胞活力大于80% )。
[0045] 實施例4 :金納米顆粒對腫瘤細胞的光熱殺傷
[0046] HeLa經(jīng)胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基重懸，種植到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞貼壁率達 到90 %左右，進彳了后續(xù)的實驗。
[0047] 近紅外激光的劑量及照射時間保持不變，加入不同濃度（0, 25, 50, 75,100 μ g/mL) 的金納米顆粒，與細胞共孵育6h后，胰酶消化細胞，lOOOrpm，5min離心收集細胞，并將細胞 重懸于500 μ L的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)移至48孔板內(nèi)，進行激光照射處理5min。而后，將細胞 進行適當稀釋，分別種植到96孔細胞培養(yǎng)板。16小時后，使用MTT法檢測細胞活力的變化
[0048] 圖4顯示金介導(dǎo)的光熱效應(yīng)能夠隨著金納米顆粒的用量的增加，增強對癌細胞的 殺傷效果。細胞活力實驗結(jié)果顯示，當金納米顆粒的濃度為50 μ g/mL時，能夠殺傷約30% 左右的細胞。
[0049] 保持金納米顆粒的劑量不變，增加激光的照射時間。使用50 μ g/mL金納米顆粒預(yù) 處理細胞6小時后，對細胞分別照射5min，7. 5min，lOmin，檢測對癌細胞的殺傷效果。圖5 顯示，增加激光的照射時間可以增加金納米顆粒殺傷腫瘤細胞的效果。
[0050] 實施例5 :金納米顆粒，單獨近紅外激光，以及近紅外激光聯(lián)合金納米顆粒在HeLa 及GFP-LC3/HeLa細胞中誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生
[0051] HeLa經(jīng)胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基重懸，種植到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞貼壁率達 到90%左右，加入不同濃度50 μ g/mL的金納米顆粒，與細胞共孵育6h后，胰酶消化細胞， lOOOrpm，5min離心收集細胞，并將細胞重懸于500 μ L的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)移至48孔板內(nèi)， 進行激光照射處理5min。而后，將細胞進行適當稀釋，種植到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔10 萬細胞，繼續(xù)培養(yǎng)16小時。胰酶消化，收集細胞，進行蛋白質(zhì)印記實驗，檢測自噬的發(fā)生。
[0052] 圖6中GFP_LC3/HeLa是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并持續(xù)表達GFP標簽的LC3蛋白的HeLa細胞 系。當自噬發(fā)生時，GFP-LC3-I就會被加工成GFP-LC3-II，聚集在自噬泡上，在熒光顯微鏡 下，我們很容易觀測到帶有綠色熒光的膜泡樣結(jié)構(gòu)（膜泡直徑約為300-900nm)。經(jīng)50yg/ mL的金納米顆粒，單獨近紅外激光，以及近紅外激光聯(lián)合金納米顆粒處理GFP-LC3/HeLa細 胞，熒光顯微鏡（Olympus 1X71)觀察細胞內(nèi)部GFP點狀聚集的變化，如圖6A的實驗結(jié)果顯 示，金納米顆粒與近紅外激光共處理可以顯著增強細胞內(nèi)部點狀聚集的產(chǎn)生。
[0053] 自噬相關(guān)蛋白LC3是自噬的標志物蛋白，當細胞自噬水平較低時，LC3蛋白彌散 的分布在胞質(zhì)溶膠中。此時的LC3蛋白為LC3蛋白I型。但自噬被誘導(dǎo)時，分布于胞質(zhì)溶 膠中的LC3蛋白就會被剪切加工成膜結(jié)合的LC3-II，分布在自噬泡的膜上。通過western blotting技術(shù)分析LC3蛋白I型到II型的轉(zhuǎn)換，我們可以在一定程度上斷定自噬的發(fā)生。 如圖6B的蛋白質(zhì)印記的結(jié)果及Image J軟件分析的結(jié)果顯示，金納米顆粒與近紅外激光共 處理可以顯著促進自噬相關(guān)蛋白LC3從I型到II型的轉(zhuǎn)換。
[0054] 實施例6 :金介導(dǎo)的光熱殺傷腫瘤細胞與自噬抑制劑聯(lián)合使用
[0055] HeLa經(jīng)胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基重懸，種植到24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞貼壁 率達到85 %左右時，加入或不加自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA)或者渥曼青霉素 (Wortmannin)，預(yù)處理Ih后，加入50 μ g/mL金納米顆粒，繼續(xù)處理細胞6小時。胰酶消化細 胞，lOOOrpm，5min離心收集細胞，并將細胞重懸于有或無自噬抑制劑的500 μ L DMEM培養(yǎng) 基內(nèi)，轉(zhuǎn)移至48孔板內(nèi)，進行激光照射處理5min。而后，使用有或無自噬抑制的DMEM培養(yǎng) 基將細胞進行適當稀釋，分別種植到96孔細胞培養(yǎng)板或者24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)16 小時。Hochest3342/PI雙染，統(tǒng)計細胞死亡的比例。其中，使用Hochest3342/PI雙染檢測 光熱治療后的細胞死亡情況的步驟如下：移出細胞培養(yǎng)基，使用10 μ g/mL的h〇cheSt3342 著色細胞核；死亡的細胞，細胞膜通透性改變，可以被10 μ g/mL的碘化丙啶（PI)著色，使用 熒光顯微鏡（Olympus 1X71)進行拍照，統(tǒng)計視野中，PI陽性細胞及h〇echst33342著色的 細胞，前者與后者的比值乘以100%，即為死亡率。胰酶消化，收集細胞，進行蛋白質(zhì)印跡實 驗，檢測3-MA及wortmannin對自噬的抑制作用。
[0056] 如圖7所示，在HeLa細胞中，自噬抑制劑Wortmannin可以顯著抑制金吸收近紅 外激光引起細胞LC3-II過度積累。在GFP-LC3HeLa細胞中，自噬抑制劑3-MA可以抑制 GFP-LC3II的積累，抑制細胞內(nèi)部游離GFP的釋放，抑制細胞自噬的水平。
[0057] 如圖8所示，自噬抑制劑3-MA，Wortmannin本身對細胞沒有毒性，并且能夠通過抑 制細胞自噬，增強金介導(dǎo)的光熱殺傷人宮頸癌細胞HeLa及小鼠乳腺癌細胞4T1的效果。
[0058] 實施例7 :金介導(dǎo)的光熱殺傷腫瘤細胞與自噬相關(guān)基因（Atg5) SiRNA的聯(lián)合使用
[0059] Atg5 siRNAs
[0060] (四種Atg5siRNA的等質(zhì)量混合物，其序列分別為：Sense 5'-GGA AUA UCC UGC AGA AGA ATT-3' （SEQ ID No :1)，Anti-sense 5'-UUC UUC UGC AGG AUA UUC CTT-3' （SEQ ID No :2) ;Sense 5'-CAU CUG AGC UAC CCG GAU ATT-3'（SEQ ID No :3)，Anti-sense 5'-UAU CCG GGU AGC UCA GAU GTT-3' (SEQ ID No ：4) ；Sense 5'-GAC AAG AAG ACA UUA GUG ATT-3' （SEQ ID No :5),Anti-sense 5'-UCA CUA AUG UCU UCU UGU CTT-3' （SEQ ID No : 6) ;Sense 5,-CAA UUG GUU UGC UAU UUG ATT-3,（SEQ ID No :7) ,Anti-sense 5,-UCA AAU AGC AAA CCA AUU GTT-3'（SEQ ID No :8))，陰性對照 siRNA 序列為 Sense 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3' （SEQ ID No :9),Antisense 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3' （SEQ ID No:10))由上海吉瑪生物合成。將細胞分到24孔板內(nèi)，使用lipo2000(Invitrogen， 11668-027)轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA及Atg5siRNA St)36小時后，加入或者不加入50μ g/mL金納 米顆粒，繼續(xù)處理細胞6小時。胰酶消化細胞，lOOOrpm，5min離心收集細胞，并將細胞重懸 于500 μ L DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，轉(zhuǎn)移至48孔板內(nèi)，進行激光照射處理5min，或者常溫放置5min。
[0061] 而后，使用DMEM培養(yǎng)基將細胞進行適當稀釋，分別種植到96孔細胞培養(yǎng)板或者24 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)16小時。使用實施例6的細胞死亡檢測方法檢測處理前后細胞 死亡的情況。實驗結(jié)果見附圖9。金納米顆粒與近紅外激光對細胞并沒有細胞毒性，但當兩 者聯(lián)合在一起可以殺傷腫瘤細胞，Atg5siRNAs沉默掉ATG5表達之后，可進一步增強金介導(dǎo) 的光熱殺傷人宮頸癌細胞HeLa的效果。
[0062] 本發(fā)明所涉及的激光器型號為MDL-III-808-2. 5(長春新產(chǎn)業(yè)光電技術(shù)有限公 司），耦合芯徑400 μ m，長1米，SMA905接口的光纖，對細胞進行激光照射處理時，激光器輸 出功率為2. 5W，光纖輸出端距離細胞培養(yǎng)板底部5厘米。
【權(quán)利要求】
1. 納米顆粒和自噬抑制劑用于制備基于光熱效應(yīng)殺傷腫瘤的藥物或試劑盒的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，所述納米顆粒選自金納米顆粒，聚多巴胺納米顆粒，單 壁碳納米管，石墨烯或其組合，優(yōu)選金納米顆粒，所述金納米顆粒包括籠形金納米顆粒，球 形金納米顆粒，棒狀金納米顆粒，星狀金納米顆粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，所述腫瘤為宮頸癌，乳腺癌或膠質(zhì)瘤。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，所述自噬抑制劑選自3-MA，Wortmannin，自噬相關(guān)基因 的siRNA、shRNA或其組合。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，所述自噬相關(guān)基因包括Atg5, Becline-1，Atg7。
6. 自噬抑制劑用于制備增強納米顆粒介導(dǎo)的光熱殺傷腫瘤的藥物或試劑盒的用途。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，所述納米顆粒選自金納米顆粒，聚多巴胺納米顆粒，單 壁碳納米管，石墨烯或其組合，優(yōu)選金納米顆粒，所述金納米顆粒包括籠形金納米顆粒，球 形金納米顆粒，棒狀金納米顆粒，星狀金納米顆粒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，所述腫瘤為宮頸癌，乳腺癌或膠質(zhì)瘤。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，所述自噬抑制劑選自3-MA，Wortmannin，自噬相關(guān)基因 的siRNA、shRNA或其組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，所述自噬相關(guān)基因包括Atg5, Becline-1，Atg7。
【文檔編號】A61K47/34GK104353074SQ201410545330
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】溫龍平, 魏鵬飛, 張強, 周偉, 張云嬌, 梁朝朝, 張力, 石閃閃 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)