一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋TrkC受體配體明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋TrkC受體配體-神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞的緩釋TrkC受體配體明膠海綿支架材料的構(gòu)建方法。應(yīng)用時(shí)將種植有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞及其分化細(xì)胞的緩釋TrkC受體配體明膠海綿圓柱體支架移植到橫斷性脊髓損傷處，可更好地促進(jìn)受損傷中樞神經(jīng)再生和功能修復(fù)。本發(fā)明在生物組織工程水平上加強(qiáng)對橫斷性脊髓損傷后保護(hù)受損傷神經(jīng)元、促進(jìn)其軸突再生、提高傷病者生存質(zhì)量、減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有重要意義。
【專利說明】-種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋TrkC受體配體明膠海綿圓 柱體支架的構(gòu)建

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋TrkC受體配體-神經(jīng)營養(yǎng) 素-3(neurotrophin_3, NT-3)明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有過表達(dá) TrkC受體細(xì)胞的緩釋TrkC受體配體明膠海綿支架材料的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中樞神經(jīng)損傷如嚴(yán)重的脊髓創(chuàng)傷主要表現(xiàn)為截癱和四肢癱，目前還沒有行之有效 的治療方法。傳統(tǒng)認(rèn)為，脊髓神經(jīng)損傷后很難再生。現(xiàn)在認(rèn)為，脊髓神經(jīng)再生困難的原因主 要是它們所處微環(huán)境中缺乏促進(jìn)神經(jīng)再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子。因此，要想脊髓神經(jīng)損傷后能 夠再生，必需進(jìn)行人工干預(yù)?，F(xiàn)階段促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)的策略，多著力于改善神經(jīng)元發(fā) 出的神經(jīng)纖維再生微環(huán)境，讓再生的神經(jīng)纖維借助橋接物支架穿過損傷區(qū)，進(jìn)入另一側(cè)的 脊髓組織中，重建神經(jīng)通路聯(lián)系，恢復(fù)原有的功能。
[0003] 在脊髓損傷修復(fù)的策略中，生物組織工程材料作為具有保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)其軸突 再生作用的活性因子或作為移植干細(xì)胞的載體，被用于治療脊髓損傷且逐漸引起人們的關(guān) 注。組織工程材料主要有天然高分子生物材料和可降解高分子合成材料。天然高分子生物 材料包括明膠、膠原、殼聚糖和海藻酸鹽等。天然材料具有良好的生物相容性，在體外能促 進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖與分化。它們方便承載神經(jīng)營養(yǎng)因子，與脊髓組織的整合性好，能夠降 低炎癥反應(yīng)以及減少星形膠質(zhì)細(xì)胞增生所形成的疤痕，在一定程度上能夠促進(jìn)受損傷脊髓 的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)。由于天然材料存在加工、機(jī)械性能較差和降解速率不易調(diào)控等問題，在 體內(nèi)應(yīng)用受到一定限制?？山到獾母叻肿雍铣刹牧弦跃圩笮樗幔╬oly D，L-lactic acid, PLLA)和聚乳酸-聚輕基乙酸共聚物（poly D，L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)為代 表，它最大的優(yōu)點(diǎn)易于加工成各種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和形狀，有一定的機(jī)械強(qiáng)度，能夠起到橋接組 織的作用，降解產(chǎn)物易于被吸收。但是，這種材料在體外沒有促進(jìn)細(xì)胞黏附和生長的功能， 植入體內(nèi)后可能存在降解產(chǎn)物呈酸性的問題。
[0004] 天然生物材料做成的凝膠、明膠海綿和膠原海綿，都可用于橫斷性脊髓損傷修復(fù)。 凝膠能夠在脊髓損傷空洞處起填充作用，促進(jìn)軸突再生，減少星形細(xì)胞增生形成的疤痕。但 是，它不能較好地引導(dǎo)再生軸突穿越損傷區(qū)域，尤其是缺乏機(jī)械強(qiáng)度。明膠和膠原具有凝膠 的優(yōu)點(diǎn)，且能夠方便承載活性物質(zhì)。明膠來自于膠原，但去膠原的自然屬性后（de-nature collagen)沒有了膠原的抗原性，而且含有類似精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)序列，能 夠促進(jìn)細(xì)胞的黏附和遷移。另外，明膠價(jià)格比較便宜，但其機(jī)械強(qiáng)度也不高。
[0005] 明膠海綿應(yīng)用于臨床已經(jīng)有許多年的歷史了，這得益于它的良好的組織相容性和 細(xì)胞親和力。但是近年有病例報(bào)告指出，由于明膠海綿吸水容易膨脹，最終導(dǎo)致植入中樞 神經(jīng)后出現(xiàn)對周圍組織擠壓的情況?；谶@種情況，我們設(shè)計(jì)用一種相對膨脹系數(shù)較小的 材料PLGA膜作為導(dǎo)管外殼，并在導(dǎo)管的中央填塞明膠海綿（曾園山，曾湘。一種用于修 復(fù)神經(jīng)損傷的明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建。獲中華人民共和國發(fā)明專利，發(fā)明專利號：ZL 200910040176. 9)。這明膠海綿圓柱體支架一方面可以盡可能保持明膠海綿的良好材料特 性，另一方面可以減少明膠海綿的過度膨脹。此外，由于有了機(jī)械強(qiáng)度較高的PLGA膜作為 導(dǎo)管外殼，導(dǎo)管中間的明膠海綿不容易發(fā)生塌陷。這些優(yōu)點(diǎn)都有利于我們進(jìn)行體內(nèi)、外的實(shí) 驗(yàn)研究。
[0006] 絲素蛋白（Silk fibroin)與其它天然高分子相比有明顯的優(yōu)越性：（1)安全可靠； 絲素蛋白是來源于家蠶的天然高純度蛋白質(zhì)，向人類傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)比較少，而且具有明 確的一級結(jié)構(gòu)，不存在潛在的危害性。（2)通過不同處理方法可以獲得膜狀或液態(tài)性狀。（3) 可以通過某些氨基酸的氨基和側(cè)鏈的化學(xué)修飾，改變其表面性能，較容易吸附細(xì)胞。（4)在 體內(nèi)、外可緩慢降解，具有一定的緩釋性。
[0007] 應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子治療中樞神經(jīng)損傷是目前研究的熱點(diǎn)之一，但所運(yùn)用的多是神 經(jīng)生長因子（NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素-3 (neurotrophin-3, NT-3) 等神經(jīng)營養(yǎng)因子?，F(xiàn)已證明NGF主要作用于感覺神經(jīng)元，對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元作用不明顯，而BDNF 作用的神經(jīng)元類型范圍較窄小。許多研究認(rèn)為，NT-3對神經(jīng)元的發(fā)育、分化以及對受損傷 中樞神經(jīng)元的存活及其軸突再生有重要作用。有研究還證實(shí)，NT-3對脊髓損傷處皮質(zhì)脊髓 束神經(jīng)纖維的再生有明顯的促進(jìn)作用，這也在我們先前的研究中得到了驗(yàn)證。許多研究表 明，NT-3通常與細(xì)胞膜上的高親力受體-TrkC結(jié)合而發(fā)揮作用。
[0008] 目前脊髓損傷后神經(jīng)再生尚未得到有效解決，損傷處微環(huán)境缺乏神經(jīng)營養(yǎng)因子可 能是最關(guān)鍵的因素之一。因此，給予外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子是必要的。新近認(rèn)為，聯(lián)合治療策 略有望使脊髓損傷修復(fù)達(dá)到更好的效果，如神經(jīng)營養(yǎng)因子與生物支架材料聯(lián)合應(yīng)用等。研 究表明，由于外源性給藥方式不能滿足在脊髓神經(jīng)再生過程中的要求，傳統(tǒng)注射神經(jīng)營養(yǎng) 因子等給藥途徑取得的臨床效果并不理想，使得神經(jīng)營養(yǎng)因子的廣泛應(yīng)用受到了限制。因 此，亟需找到一種理想的承載神經(jīng)營養(yǎng)因子，且能使其在脊髓損傷處微環(huán)境一定時(shí)間內(nèi)維 持有效濃度的方法。
[0009] 綜合上述研究中存在的問題，本項(xiàng)發(fā)明專利試圖通過在天然生物材料一一多孔 隙明膠海綿圓柱體支架內(nèi)添加 NT-3/絲素蛋白，利用絲素蛋白特性將使NT-3結(jié)合到明膠 上，構(gòu)建一種用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋NT-3明膠海綿圓柱體支架。然后，在此支架內(nèi)種植 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 目前，在國內(nèi)、外尚未見有文獻(xiàn)資料報(bào)道用于修復(fù)脊髓損傷的緩釋TrkC受體配體 (NT-3)明膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建方法，尤其是一種含有過表達(dá)TrkC受體干細(xì)胞的緩釋 TrkC受體配體明膠海綿支架材料的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是想克服現(xiàn)有臨床上 治療脊髓損傷所使用的方法上的不足，應(yīng)用我們自行構(gòu)建的含有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞的 緩釋TrkC受體配體明膠海綿支架材料治療脊髓創(chuàng)傷性疾病，可能會(huì)更好地促進(jìn)受損傷脊 髓神經(jīng)再生和功能修復(fù)。
[0011] 本發(fā)明的基本方案包括：
[0012] 以多孔隙明膠海綿為主體，加入絲素蛋白和NT-3,外面應(yīng)用PLGA薄膜包裹，形成 一種形貌像圓柱體的支架材料。在此基礎(chǔ)上種植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，構(gòu)建成能夠促進(jìn)脊 髓神經(jīng)再生的人工神經(jīng)導(dǎo)管。應(yīng)用時(shí)，將其移植到脊髓橫斷性損傷處。
[0013] 本發(fā)明有其顯著優(yōu)點(diǎn)；它是在我們前一項(xiàng)發(fā)明專利（一種用于修復(fù)神經(jīng)損傷的明 膠海綿圓柱體支架的構(gòu)建，發(fā)明專利號：ZL 200910040176.9)的基礎(chǔ)上構(gòu)建一種含有過表 達(dá)TrkC受體細(xì)胞的緩釋TrkC受體配體（NT-3)明膠海綿支架，用于促進(jìn)受損傷的脊髓神經(jīng) 再生及其功能修復(fù)，對危害人民健康較大的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病進(jìn)行臨床前研究，將會(huì)有 力地推動(dòng)整個(gè)創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治研究領(lǐng)域的發(fā)展。這對延長人類壽命，提高傷病者 生存質(zhì)量，減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，促進(jìn)我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都具有重要意義。本發(fā)明將使我國 的創(chuàng)傷性中樞神經(jīng)疾病防治水平居于國際領(lǐng)先水平。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明所用的主要儀器、可降解天然生物材料、可降解高 分子合成材料、家蠶蠶繭、神經(jīng)營養(yǎng)因子、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑作詳盡的描述：
[0015] 1.主要儀器
[0016] 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、普通離心機(jī)（日本久保田制作所）、低溫 高速離心機(jī)（美國Eppendorf公司）、5% CO2培養(yǎng)箱（美國Queue公司）、倒置突光顯微鏡 (德國Leica公司）、酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司）、恒冷箱切片機(jī)（英國Shandon 公司）和XL30FEG型掃描電鏡（德國Philips公司）。
[0017] 2.可降解天然生物材料
[0018] 明膠海綿購自南京金陵藥業(yè)股份有限公司的產(chǎn)品。
[0019] 3.可降解高分子合成材料
[0020] PLGA (50 : 50)薄膜購自濟(jì)南岱罡生物科技公司的產(chǎn)品。
[0021] 4.家蠶蠶繭
[0022] 制備絲素蛋白溶液所用的原料家蠶蠶繭，是由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所 贈(zèng)送的產(chǎn)品。
[0023] 5.神經(jīng)營養(yǎng)因子
[0024] 人NT-3基因重組蛋白（neurotrophin-3, NT-3 ;購自Sigma公司的產(chǎn)品）
[0025] 6.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0026] 綠色熒光骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs，自行分離培養(yǎng)獲?。┖途G色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因 SD(Sprague-Dawley)大鼠乳鼠 （Osaka University, Osaka, Japan)。
[0027] 7.主要試劑
[0028] DMEM-LG (Gibico)，優(yōu)級胎牛血清（TBD)，多聚賴氨酸（Sigma)，D-Hank' s 平衡液 (自配），胰蛋白酶（Sigma), EDTA(Sangon)，0· Olmol/IPBS(中杉金橋），MTT(Sigma),二甲 基亞砜（DMSO) (Sangon), Hoechst33IM2 (Sigma)，山羊血清（中杉金橋）等。
[0029] 本發(fā)明詳細(xì)的具體操作技術(shù)說明如下：
[0030] 1.緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構(gòu)建
[0031] 所述的緩釋NT-3的多孔隙明膠海綿PLGA圓柱體支架的構(gòu)建可分為4個(gè)步驟。第 1步驟是制備支架外殼：外殼薄壁是環(huán)繞圓柱體的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物（poly D， L-lactic-co-glycolic acid, PLGA)，其由可降解的高分子合成材料PLGA (聚乳酸與聚輕 基乙酸比值為50 : 50,分子量為100000)構(gòu)成。0.02mm厚PLGA薄膜購自山東濟(jì)南岱罡生 物技術(shù)公司，材料的構(gòu)建方法如下：取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5 %溶液，待 PLGA完全溶解后，澆注與已調(diào)水平的聚四氟模具中，室溫（控制溫度在20°C )，揮發(fā)24小 時(shí)，第2天小心揭下薄膜，反置于模具中24小時(shí)，剪裁到適宜大小后干燥保存。將薄膜包繞 在直徑為3mm的不銹鋼圓柱磨具上一圈，邊緣用丙酮粘貼，形成直徑為3mm的圓筒狀PLGA 外殼。使用時(shí)將PLGA外殼剪成2mm長度，酒精浸泡15分鐘，隨后用無菌D-Hank' s平衡液 浸洗3次，每次10分鐘。
[0032] 第2步驟是制備絲素蛋白溶液：（1)將20g Na2CO3溶于4升水中，加熱至KKTC，放 入75g家蠶蠶繭（由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所贈(zèng)送），保持溶液微沸，并不斷攪拌。1小 時(shí)后，倒去溶液。再重復(fù)上述過程1次。將煮沸好的蠶繭自然冷卻，用去離子水沖洗干凈，放 在烘箱內(nèi)24小時(shí)，50°C烘干后備用。（2)取CaCl 244. 40g、乙醇46. 00ml，去離子水57. 60ml 制成混合溶液，在此溶液中放入烘干的蠶繭15. 00g。使溶液充分浸沒蠶繭后，80°C水浴加 熱，攪拌溶解。1小時(shí)后，蠶繭全部溶解為絲素蛋白溶液。停止加熱和攪拌，自然冷卻絲素蛋 白溶液至室溫。（3)用透析袋（購自于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司）透析去除絲素蛋白 溶液中的鹽離子。前2天用自來水浸泡含有絲素蛋白溶液的透析袋,后1天改用去離子水 浸泡，共透析3天。在透析期間，每隔3小時(shí)換1次自來水或去離子水。（4)將透析后的絲 素蛋白溶液倒入量筒中，靜置4小時(shí)，除去溶液中的固體雜質(zhì)。用錐形瓶收集靜置后的絲素 蛋白溶液，4°C冰箱保存，在1周內(nèi)使用完畢。（5)取約IOml靜置后的絲素蛋白溶液倒入小 燒杯中，60°C烘干。稱量烘干后的絲素蛋白的質(zhì)量，除以溶液質(zhì)量，即可得到絲素蛋白溶液 的濃度。計(jì)算公式為

【權(quán)利要求】
1. 一種用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞的緩釋TrkC受體配體 明膠海綿支架材料，其形貌結(jié)構(gòu)特征是：支架中央填充著負(fù)載TrkC受體配體/絲素蛋白的 明膠海綿；通過負(fù)載TrkC受體配體/絲素蛋白的明膠海綿吸附種植的過表達(dá)TrkC受體細(xì) 胞，構(gòu)建成有利于受損傷脊髓神經(jīng)再生及其功能修復(fù)的緩釋TrkC受體配體明膠海綿支架。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞的緩 釋TrkC受體配體明膠海綿支架材料，其過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞特征是：所吸附種植的過表達(dá) TrkC受體細(xì)胞為過表達(dá)TrkC受體的干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于修復(fù)橫斷性脊髓損傷的含有過表達(dá)TrkC受體細(xì)胞的緩 釋TrkC受體配體明膠海綿支架材料，其負(fù)載的TrkC受體配體特征：是能夠與TrkC這種高 親力受體特異性結(jié)合的NT-3。
【文檔編號】A61L27/22GK104258460SQ201410545001
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】曾園山, 張可 申請人:中山大學(xué)