在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，選取健康、無患病史、體況正常、乳房發(fā)育良好、處于第一胎次泌乳中期，SCC〈10萬/mL，所有乳區(qū)乳汁細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性的中國荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物，對上述奶牛的4個(gè)乳區(qū)分別作如下處理：利用通乳針分別將1X107CFU/mL的金黃色葡萄球菌的細(xì)菌懸液和1X106CFU/mL鏈球菌懸液經(jīng)乳頭管注射入奶牛乳房內(nèi)，對照組注射等量的滅菌ros，空白組不作處理；大拇指和食指相連成圓形，自乳頭基部自下而上反向按壓，使菌液均勻擴(kuò)散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，確定奶牛乳房炎模型構(gòu)建成功。本發(fā)明完全排除了個(gè)體差異對試驗(yàn)的影響。
【專利說明】在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物科學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種利用同一奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨 床型乳房炎模型的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳腺炎又稱乳房炎，是由多種病因引起的一種炎性反應(yīng)，是奶牛最常見的疾 病之一，受奶牛自身遺傳背景、環(huán)境條件、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等因素的影響。
[0003] 乳腺炎嚴(yán)重影響了原料奶質(zhì)量、奶牛的利用年限、奶牛養(yǎng)殖效益、牛奶制品的營養(yǎng) 價(jià)值和消費(fèi)者的健康。奶牛乳腺炎是牛業(yè)生產(chǎn)效率低，成本高的主要原因之一。大多數(shù)國家 奶牛乳腺炎的發(fā)病率在是40%左右(包括隱性乳腺炎)，奶產(chǎn)量會減少15%，我國由于技術(shù)不 成熟，設(shè)施不配套等原因。每年因奶牛患乳腺炎造成的損失高達(dá)數(shù)十億元。奶牛感染乳腺 炎，其乳中含有大量病原微生物及其釋放的毒素和殘留的抗生素，飲用這類牛奶會引起人 類腹瀉、嘔吐、發(fā)燒等現(xiàn)象，繼而嚴(yán)重影響人類的健康。乳腺炎的病因有多種，其中微生物感 染是引起奶牛乳腺炎發(fā)生的最主要的原因，已發(fā)現(xiàn)的病原體達(dá)150多種，金黃色葡萄球菌、 鏈球菌和大腸桿菌引起的病例高達(dá)90%。金葡菌和鏈球菌都是兼性厭氧的革蘭氏陽性菌。 金葡菌主要引起哺乳動物乳房內(nèi)的感染，在奶牛中，25%-30%乳房內(nèi)的感染都是由金葡菌引 起的。鏈球菌屬中能夠引起乳腺炎的有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿鏈球菌 和獸疫鏈球菌。
[0004] 臨床型乳腺炎癥狀明顯，乳房及乳汁均有不同程度的異常癥狀。輕者乳汁稀薄， 并伴有絮片、凝塊，乳房輕度發(fā)熱或疼痛；重者乳汁變淡黃色，有時(shí)出現(xiàn)膿汁，乳房紅腫、質(zhì) 硬、發(fā)熱、疼痛，泌乳減少且分泌不暢，同時(shí)出現(xiàn)不同程度的全身反應(yīng)，如食欲喪失、體溫升 高、精神抑郁等，發(fā)病率約為21-23%。根據(jù)炎癥炎性過程的不同分為急性乳腺炎、漿液性乳 腺炎、卡他性乳腺炎、纖維蛋白性乳腺炎、膿性乳腺炎、出血性乳腺炎、蜂窩織炎性乳腺炎。 但臨床型乳房炎動物模型的建立一直以來都是一個(gè)重點(diǎn)難點(diǎn)問題，受到很多外界因素的影 響。
[0005] 目前，直接應(yīng)用奶牛建立乳房炎模型的研究較少，一般用泌乳小鼠、泌乳兔取而代 之，以降低成本，增加試驗(yàn)的靈活性。但乳房炎的發(fā)生、發(fā)展和防治和動物自身的遺傳背景 有著密不可分的關(guān)系。直接運(yùn)用奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物無疑可以消除自身遺傳背景對試驗(yàn)的影 響。
[0006] 現(xiàn)有的建立乳房炎模型方法如下： 1.小鼠乳腺炎模型。主要通過細(xì)菌培養(yǎng)，而后取100微升注入細(xì)菌感染組小鼠乳腺組 織中，功菌24h之后，觀察乳房組織外部結(jié)構(gòu)變化，頸椎脫白法處死小鼠，迅速取出乳腺組 織做石蠟切片，一部分進(jìn)行HE染色做病理學(xué)分析。
[0007] 2.家兔乳腺炎模型。運(yùn)用從乳腺炎病牛奶樣中分離到的金黃色葡萄球菌，人工誘 發(fā)家兔乳腺炎，建立家兔乳腺炎模型。并設(shè)立l〇4CFU、106CFU和108CFU 3個(gè)不同劑量組以 及健康對照組和生理鹽水組。家兔乳腺攻菌24h耳緣靜脈采血測定血常規(guī)。觀察攻菌家兔 的臨床表現(xiàn)、體溫變化、采食、飲水情況，同時(shí)結(jié)合血常規(guī)檢測報(bào)告進(jìn)行診斷，篩選成功的家 兔乳腺炎模型。
[0008] 本發(fā)明從實(shí)驗(yàn)動物的選擇入手，通過一系列的指標(biāo)選擇合適的實(shí)驗(yàn)動物。然后通 過定點(diǎn)攻菌、無菌取樣等技術(shù)建立同一奶牛不同乳區(qū)兩種菌型臨床型乳房炎模型。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方 法，直接應(yīng)用奶牛建立乳房炎模型，以消除其它方法存在的自身遺傳背景對試驗(yàn)的影響的 問題。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，其特征在于：包括以下 步驟： (1) 選擇標(biāo)準(zhǔn)：選取健康、無患病史、體況正常、乳房發(fā)育良好、處于第一胎次泌乳中期， SCC〈10萬/mL，所有乳區(qū)乳汁細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性的中國荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物，連續(xù)隔 離觀察7天后進(jìn)行試驗(yàn)； (2) 分區(qū)攻菌方式：對上述奶牛的4個(gè)乳區(qū)分別作如下處理：利用通乳針分別將IX 107 CFU/mL的金黃色葡萄球菌的細(xì)菌懸液和1 X 106 CFU/mL鏈球菌懸液經(jīng)乳頭管注射入奶牛乳 房內(nèi)，注射劑量為5mL，對照組注射等量的滅菌PBS，空白組不作處理； (3) 乳區(qū)按壓方式：大拇指和食指相連成圓形，自乳頭基部自下而上反向按壓，使菌液 均勻擴(kuò)散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，確定奶牛乳房炎模型構(gòu)建成功。
[0011] 后續(xù)研究可立即無菌操作采集奶牛的乳腺組織，放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn) 入-70°C冰箱備用，全程無菌操作。
[0012] 攻菌前后定時(shí)采集各頭奶牛各乳區(qū)的牛奶樣品，進(jìn)行乳汁外觀檢查，BMT試驗(yàn)，體 細(xì)胞數(shù)（SCC)測定，乳腺組織切片理學(xué)檢測；乳汁細(xì)菌學(xué)檢測，判斷單一乳區(qū)是否只感染接 種菌型，而無交叉感染，從而判斷奶牛兩種菌型臨床型乳房炎模型構(gòu)建成功與否。
[0013] 以下技術(shù)方法為行業(yè)通用或國標(biāo)方法，與本專利獨(dú)有技術(shù)一起構(gòu)成本專利技術(shù)體 系。
[0014] 1)細(xì)菌懸液制作及計(jì)數(shù)方法 金黃色葡萄球菌（ATCC29213)，鏈球菌（C55912)來自于揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。
[0015] 金黃色葡萄球菌（ATCC29213)，接種于肉湯培養(yǎng)基中，在37°C電熱恒溫箱中培 養(yǎng)24 h復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的金葡菌培養(yǎng)并傳代，調(diào)整細(xì)菌濃度并進(jìn)行菌計(jì)數(shù)。試驗(yàn)用金 葡球菌的分離、培養(yǎng)、鑒定及細(xì)菌計(jì)數(shù)等操作方法與步驟均參考衛(wèi)生部于2010年頒布的 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》 (GB4789. 10-2010)進(jìn)行。
[0016] 將鏈球菌（C55912)接種于100毫升Todd-Hewitt肉湯中，置37°C生化培養(yǎng)箱中6h 復(fù)蘇。將肉湯培養(yǎng)物稀釋于無菌哺乳動物林格氏溶液中，得到約1X106 CFU/mL鏈球菌懸 液。奶樣中鏈球菌的檢測方法參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)溶 血性鏈球菌檢驗(yàn)》（GB/T 4789. 11-2003)。
[0017] 2)北京乳腺炎試驗(yàn)法（BMT法） BMT法是一種間接檢測乳汁中體細(xì)胞數(shù)的方法，最早由Scalm和Noorlander提出加州 乳腺炎試驗(yàn)法（CMT)，該方法操作簡單，靈敏度高，價(jià)格便宜，且可進(jìn)行現(xiàn)場操作，是目前各 國普遍采用的診斷方法，診斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。我國根據(jù)CMT的原理研制出了北京乳腺炎試驗(yàn)法 (BMT)、上海乳腺炎試驗(yàn)法（SMT)、蘭州乳腺炎試驗(yàn)法（Lanzhou Mastitis Test, LMT)、杭州 乳腺炎試驗(yàn)法（Hangzhou Mastitis Test, HMT)等。
[0018] 表1北京奶牛乳腺炎測定（BMT)標(biāo)準(zhǔn)

【權(quán)利要求】
1. 一種在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，其特征在于：包括以 下步驟： (1) 選擇標(biāo)準(zhǔn)：選取健康、無患病史、體況正常、乳房發(fā)育良好、處于第一胎次泌乳中期， SCC〈10萬/mL，所有乳區(qū)乳汁細(xì)菌培養(yǎng)均為陰性的中國荷斯坦奶牛作為實(shí)驗(yàn)動物； (2) 分區(qū)攻菌方式：對上述奶牛的4個(gè)乳區(qū)分別作如下處理：利用通乳針分別將1 X 107 CFU/mL的金黃色葡萄球菌的細(xì)菌懸液和1 X 106 CFU/mL鏈球菌懸液經(jīng)乳頭管注射入奶牛乳 房內(nèi)，對照組注射等量的滅菌PBS，空白組不作處理； (3) 乳區(qū)按壓方式：大拇指和食指相連成圓形，自乳頭基部自下而上反向按壓，使菌液 均勻擴(kuò)散至乳腺管，不在乳池蓄留，攻菌24h后，確定奶牛乳房炎模型構(gòu)建成功。
2. 如權(quán)利要求1所述的在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：步驟（1)中，選取的中國荷斯坦奶牛在連續(xù)隔離觀察7天后進(jìn)行試驗(yàn)。
3. 如權(quán)利要求1所述的在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：步驟（2)中，注射劑量為5mL。
4. 如權(quán)利要求1所述的在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法， 其特征在于：后續(xù)研究可立即無菌操作采集奶牛的乳腺組織，放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，轉(zhuǎn) 入-70°C冰箱備用，全程無菌操作。
5. 如權(quán)利要求1所述的在奶牛不同乳區(qū)構(gòu)建兩種菌型臨床型乳腺炎模型的方法，其特 征在于：攻菌前后定時(shí)采集各頭奶牛各乳區(qū)的牛奶樣品，進(jìn)行乳汁外觀檢查，BMT試驗(yàn)，體 細(xì)胞數(shù)（SCC)測定，乳腺組織切片理學(xué)檢測；乳汁細(xì)菌學(xué)檢測，判斷單一乳區(qū)是否只感染接 種菌型，而無交叉感染，從而判斷奶牛兩種菌型臨床型乳房炎模型構(gòu)建成功與否。
【文檔編號】A61K35/74GK104208104SQ201410476668
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】楊奕李, 銳楊, 章平 申請人:揚(yáng)州大學(xué)