小檗堿在抑制ppp1r3c基因表達(dá)方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)和藥物領(lǐng)域，具體為抑制肝臟糖異生的小檗堿抑制PPP1R3C基因的表達(dá)，以及PPP1R3C基因促進(jìn)糖異生的作用。小檗堿呈時間和劑量依賴性地降低PPP1R3C的mRNA水平，證實小檗堿抑制糖異生的作用機(jī)制是通過下調(diào)PPP1R3C基因的表達(dá)，而干擾PPP1R3C的表達(dá)后可以抑制糖異生關(guān)鍵酶基因表達(dá)，抑制糖異生。因此，可將PPP1R3C基因用于制備篩選抑制或促進(jìn)糖異生的藥物。
【專利說明】小檗堿在抑制PPP1R3C基因表達(dá)方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體為抑制肝臟糖異生的小檗堿抑制PPP1R3C 基因的表達(dá)，以及PPP1R3C基因促進(jìn)糖異生的作用。

【背景技術(shù)】
[0002] 人們生活條件的改善和飲食結(jié)構(gòu)的變化使人類面臨非傳染性疾病的危險日益增 加，2型糖尿病患者數(shù)量急劇上升，糖尿病及其并發(fā)癥給人類健康和社會發(fā)展帶來嚴(yán)重負(fù) 擔(dān)，預(yù)防和治療2型糖尿病已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。
[0003] 肝臟是人體內(nèi)參與營養(yǎng)代謝和能量平衡的重要器官，對維持機(jī)體葡萄糖穩(wěn)態(tài)具有 重要作用。肝臟糖異生的增加導(dǎo)致的空腹高血糖是2型糖尿病的重要特征。
[0004] 空腹時，機(jī)體的能量來源從葡萄糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)橹緞訂T，同時低血糖刺激胰島α 細(xì)胞分泌胰高糖素，使肝糖原分解、糖異生增加，以維持紅細(xì)胞及大腦等僅能依靠葡萄糖供 能的組織的能量供應(yīng)；進(jìn)食后，血糖增高刺激胰島素分泌，胰島素促進(jìn)肝臟攝取葡萄糖合成 糖原，并抑制肝糖原分解及肝糖異生。內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生的增加導(dǎo)致的空腹高血糖是2型 糖尿病的重要特征，而肝臟糖異生是內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生的主要來源。因此，關(guān)于肝臟糖異生 這一生理過程的調(diào)控研究對于2型糖尿病的防治就具有非常重要的意義。
[0005] 糖異生過程是糖酵解的逆過程，包括三個不可逆反應(yīng)（6-磷酸葡萄糖生成葡萄 糖，1，6二磷酸果糖生成6-磷酸果糖，丙酮酸生成磷酸烯醇型丙酮酸），需四個與糖酵解過 程不共用的催化酶--丙酮酸羧化酶（PC)、PEPCK、G6pase、Fbpase。PC受乙酰輔酶Α的 變構(gòu)激活，F(xiàn)bpase受2,6_二磷酸果糖的變構(gòu)抑制，關(guān)于它們受轉(zhuǎn)錄調(diào)控的信息所知甚少。 PEPCK、G6pase的活性受變構(gòu)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的報道較少，它們主要受多種激素信號的轉(zhuǎn) 錄調(diào)控，在PEPCK、G6pase啟動子上有胰島素、甲狀腺激素、糖皮質(zhì)激素受體、cAMP反應(yīng)元 件。
[0006] 中藥黃連的提取物小檗堿具有顯著的降糖調(diào)脂作用，其降糖機(jī)制已成為近年來代 謝領(lǐng)域的研究熱點。二甲雙胍是世界上應(yīng)用最廣的口服降血糖藥物，越來越多的臨床研究 和動物模型都證實二甲雙胍治療糖尿病的最重要作用是抑制肝臟糖異生，但具體作用機(jī)制 仍未完全闡明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供小檗堿抑制PPP1R3C基因的表達(dá)的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明還提供了 PPP1R3C基因在增加或抑制糖異生方面的應(yīng)用。
[0009] 通過比較小檗堿與二甲雙胍對抑制肝臟糖異生的作用，其藥物作用有許多相似之 處，呈時間和劑量依賴性地降低小鼠肝臟原代細(xì)胞以乳酸和丙酮酸為底物的糖異生，但作 用機(jī)制并不完全相同。
[0010] 二甲雙胍及小檗堿均可降低肝糖異生關(guān)鍵酶PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶（G6pase)、 果糖1，6-二磷酸酶（Fbpase)和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子F0X01、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP) a、C/ ΕΒΡβ、肝細(xì)胞核因子（HNF)4a、過氧化物酶增殖物激活受體Y共激活子（PGC)la的mRNA 水平；降低PEPCK的啟動子活性，抑制PEPCK的蛋白表達(dá)；均不影響CREB的磷酸化，但均可 促進(jìn)CRTC2磷酸化；均可增加 AMPK(AMP活化的蛋白激酶）和乙酰輔酶A羧化酶（ACC)的磷 酸化，但AMPK的抑制劑Compound C僅能逆轉(zhuǎn)二甲雙胍的作用，對小檗堿無效。
[0011] PPP1R3C(蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3C)是蛋白磷酸酶1(PP1)的調(diào)節(jié)亞基。PP1屬 于蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶的一類，通過去磷酸化其它蛋白參與一系列細(xì)胞功能的調(diào) 節(jié)。PP1在控制糖原代謝、肌肉收縮、細(xì)胞周期進(jìn)程、神經(jīng)元活動、RNA剪切、有絲分裂、細(xì)胞 分裂、細(xì)胞凋亡、蛋白合成、膜受體與膜通道的調(diào)節(jié)等方面都有有重要作用。每個PP1酶都 包含一個催化亞基PP1C和一個調(diào)節(jié)亞基PP1R。PP1C為一個30kD單結(jié)構(gòu)域蛋白，在真核細(xì) 胞內(nèi)高度保守，說明催化機(jī)制都是相同的。PP1功能的實現(xiàn)依賴于其催化亞基與一系列的 調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，PP1C可與不同調(diào)節(jié)亞基組合，因此其具有不同的作用。調(diào)節(jié)亞基可使PP1C 錨定至特殊的細(xì)胞亞單位，與特異底物相結(jié)合，并對胞外信號產(chǎn)生反應(yīng)。PP1R包括PPP1R5、 PPP1R3A/GM、PPP1R3B/GL、PPP1R3C/PTG/R5、R6、PPP1R4、PPP1R8 等。PPP1R3C/PTG、R6、GM 和 GL均是PP1的糖原錨定亞基，可使PP1C結(jié)合至糖原，但是GM和GL主要在橫紋肌和肝臟表 達(dá)，而PPP1R3C/PTG和R6表達(dá)組織更廣泛。這四個調(diào)節(jié)亞基在相同物種之間并不保守，說明 它們的作用機(jī)制并不完全相同，但是這四個亞基表達(dá)的變化均能導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖 尿病。PP1通過調(diào)節(jié)糖原代謝對血糖穩(wěn)定具有重要作用。糖原合成由糖原合成酶（glycogen synthase,GS)催化，糖原分解由糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，GP)催化，這兩個 酶的活性均受磷酸化/去磷酸化修飾調(diào)控。GS被PKA、GSK3 (glycogen synthase kinase3) 等蛋白激酶磷酸化后其活性被抑制，被GSP(glycogen synthase phosphatase)去磷酸化后 活性恢復(fù)。與之相反，GP被蛋白激酶磷酸化后激活，被PP1去磷酸化后失活。PP1通過影響 磷酸酶a(phosphorylase a)和磷酸酶b(phosphorylase b)相互轉(zhuǎn)化，對糖原的合成和分解 具有重要作用。磷酸酶a(phosphorylase a)是肝細(xì)胞內(nèi)葡萄糖感受器，當(dāng)葡萄糖水平低時， 處于活化狀態(tài)的磷酸酶a與PP1緊密結(jié)合，阻止PP1的磷酸酶活性，保持磷酸酶a處于活化 狀態(tài)，促進(jìn)糖原分解直到血糖達(dá)到一定程度。當(dāng)葡萄糖水平很高時，磷酸酶a失活，PP1從 它們的復(fù)合體中解離下來，PP1去磷酸化磷酸酶a，使其變?yōu)榱姿崦竍，阻止糖原的分解，促 進(jìn)糖原的合成。在細(xì)胞水平和動物模型內(nèi)過表達(dá)或者敲除PPP1R3C/PTG的實驗已經(jīng)明確了 PTG在調(diào)節(jié)糖原合成中的重要性，例如Sean等報道小鼠 PPP1R3C/PTG雜合敲除后隨著年齡 增長可以導(dǎo)致多個組織糖原合成障礙和胰島素抵抗。在過表達(dá)胰島素受體的中國倉鼠卵細(xì) 胞內(nèi)，過表達(dá)PPP1R3C/PTG可顯著增加基礎(chǔ)的和胰島素刺激的糖原合成。
[0012] 并且小檗堿呈時間和劑量依賴性地降低PPP1R3C的mRNA水平。通過cDNA芯片篩 選出PPP1R3C為小檗堿調(diào)節(jié)糖異生的關(guān)鍵作用靶點，證實小檗堿抑制糖異生的作用機(jī)制是 通過下調(diào)PPP1R3C基因的表達(dá)，抑制蛋白磷酸酶1(PP1)的活性，PP1對P-CRTC2的去磷酸 化作用減弱，P-CRTC2阻滯于胞漿內(nèi)，不能入核發(fā)揮其促進(jìn)PEPCK基因轉(zhuǎn)錄的作用。而且還 證實了 PPP1R3C基因的過表達(dá)可以增加糖異生，而干擾PPP1R3C基因的表達(dá)則可以抑制糖 異生關(guān)鍵酶的表達(dá)，抑制糖異生。
[0013] PPP1R3C/PTG對血糖的平衡和穩(wěn)態(tài)具有重大影響，但關(guān)于PPP1R3C/PTG的研究基 本上都是圍繞糖原代謝方面，關(guān)于它是否參與調(diào)節(jié)糖異生的過程完全是一個未知的領(lǐng)域。 本發(fā)明的芯片檢測結(jié)果以及后續(xù)的驗證實驗說明PPP1R3C與糖異生過程具有很大的相關(guān) 性，在小鼠肝原代細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)PPP1R3C可以增加糖異生，而干擾PPP1R3C的表達(dá)后可以抑 制糖異生關(guān)鍵酶基因表達(dá)，抑制糖異生。因此，可將PPP1R3C基因用于制備篩選抑制或促進(jìn) 糖異生的藥物。
[0014] 本發(fā)明提供了小檗堿在抑制PPP1R3C基因的表達(dá)和抑制PPP1R3C基因的mrNA水 平方面的應(yīng)用，可將小檗堿用于制備抑制PPP1R3C基因表達(dá)的藥物和抑制PPP1R3C的mRNA 水平的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例1中，2mmol/L二甲雙胍作用下葡萄糖濃度隨時間變化
[0016] 圖2為實施例1中，2. 5 μ mol/L小檗堿作用下葡萄糖濃度隨時間變化
[0017] 圖3為實施例1中，不同劑量二甲雙胍和小檗堿作用下葡萄糖濃度的變化
[0018] 圖4為實施例1中，2mmol/L二甲雙胍作用下肝糖異生相關(guān)基因的mRNA水平隨時 間變化
[0019] 圖5為實施例1中，2. 5 μ mol/L小檗堿作用下肝糖異生相關(guān)基因的mRNA水平隨時 間變化
[0020] 圖6為實施例1中，不同劑量二甲雙胍作用下肝糖異生相關(guān)基因的mRNA水平隨時 間變化
[0021] 圖7為實施例1中，不同劑量小檗堿作用下肝糖異生相關(guān)基因的mRNA水平隨時間 變化
[0022] 圖8為實施例1中，不同劑量小檗堿作用下對PEPCK移動子活性的抑制
[0023] 圖9為實施例2中，小鼠空腹及再進(jìn)食對PPP1RC3基因及糖異生相關(guān)基因表達(dá)的 影響
[0024] 圖10為實施例2中，用小檗堿處理小鼠原代肝臟細(xì)胞后cDNA芯片檢測結(jié)果，
[0025] 圖11為實施例2中，2. 5 μ mol/L小檗堿作用下PPP1RC3基因表達(dá)隨時間變化
[0026] 圖12為實施例2中，不同劑量小檗堿作用8小時后PPP1RC3基因表達(dá)的變化
[0027] 圖13為實施例2中，轉(zhuǎn)染PPP1R3C過表達(dá)腺病毒后肝原代細(xì)胞PPP1R3C的表達(dá)
[0028] 圖14為實施例2中，轉(zhuǎn)染PPP1R3C過表達(dá)腺病毒后肝原代細(xì)胞糖異生變化
[0029] 圖15為實施例2中，轉(zhuǎn)染PPP1R3C小干擾腺病毒后PPP1RC3基因表達(dá)的變化
[0030] 圖16為實施例2中，轉(zhuǎn)染PPP1R3C小干擾腺病毒后PEPCK、G6pase基因表達(dá)的變 化
[0031] 圖17實施例2中，轉(zhuǎn)染PPP1R3C小干擾腺病毒后糖異生變化

【具體實施方式】
[0032] 實施例1小檗堿和二甲雙胍抑制肝細(xì)胞糖異生
[0033] -、小鼠肝臟原代細(xì)胞的分離
[0034] 1、取10?12周齡，體重約18?20g的雄性C57小鼠，術(shù)前自由進(jìn)飲食，腹腔注 射1%戊巴比妥0. lml/g麻醉；分離肝臟，并將肝臟放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，緩慢離體循環(huán)灌注 20ml37°C預(yù)熱的0. 05% IV型膠原酶，直到肝臟表面出現(xiàn)龜裂，約15?20min后灌注完畢， 用剪刀剪開包膜，剪刀尖輕刮結(jié)締組織使肝細(xì)胞分離；將培養(yǎng)皿拿入細(xì)胞房的超凈臺（提 前用紫外照射30min)，用100 μ m的篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液。4°C 500轉(zhuǎn)/min (上、下加速度均為 5)離心5min，棄上清，加入冰PBS液20ml輕輕吹打，混勻，若有大塊組織雜質(zhì)可用移液槍挑 去，重復(fù)上述步驟共三次。清洗完畢，用肝細(xì)胞培液重懸細(xì)胞，鋪板24h后細(xì)胞貼壁即可換 成普通DMffl培液。
[0035] 2、MTT實驗證實：作用24h，5 μ mol/L以上的小檗堿對小鼠肝臟原代細(xì)胞有明顯毒 性作用（P〈〇. 05), 2. 5 μ mol/L的小檗堿為其所能耐受的最大作用濃度，后續(xù)實驗所用小檗 堿作用濃度均不超過2. 5 μ mol/L ;而Η印G2細(xì)胞能耐受10 μ mol/L及以下濃度的小檗堿。 二甲雙胍的作用濃度參考文獻(xiàn)確定，其作用濃度不超過2mmo 1 /L。
[0036] 二、二甲雙胍及小檗堿對小鼠肝臟原代細(xì)胞糖異生的影響
[0037] ( -）方法
[0038] 1.將分離的小鼠肝臟原代細(xì)胞鋪于24孔板內(nèi)，貼壁24h后，以高糖的DMEM培液和 無糖的DMEM培液配置低糖（5mmol/L)DMEM培液，加100nmol/LDex預(yù)處理16h，再加入含糖 異生底物（10mm〇l/L-乳酸/lmmol/L-丙酮酸）和 100nmol/L 地塞米松（DEX)/100ymol/L cAMP的無糖無酚紅DMEM培液，同時加入相應(yīng)濃度的二甲雙胍或小檗堿處理不同時間；
[0039] 2.收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，4°C 2000Xg離心10min，取上清待測；
[0040] 3.于96孔板內(nèi)，先加5 μ 1空白對照（無糖無酚紅DMEM培液）、標(biāo)準(zhǔn)品（用無糖 無酚紅 DMEM 培液稀釋 10mmol/L 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品為 2000、1000、500、250、125、62. 5、31. 25、 15. 625 μ M)和待測樣本，再加入195 μ 1工作溶液（由試劑盒內(nèi)R1與R2按4:1配置），輕 微振蕩15s ;
[0041] 4. 37°C水浴鍋中孵育20?30min，570nm測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到待 測樣本的葡萄糖濃度。
[0042] (二）結(jié)果
[0043] 1、二甲雙胍及小檗堿呈時間依賴性降低肝臟糖異生
[0044] 在無糖無酚紅DMEM培液中，加入lmmol/L丙酮酸和10mmol/L乳酸作為肝糖異生 的底物，地塞米松和cAMP分別代表糖皮質(zhì)激素和胰高糖素的信號通路刺激肝臟糖異生（即 Pyrucate/Lactate+Dex/cAMP)，通過檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度來反映肝原代細(xì)胞糖異生 水平，二甲雙狐（Pyrucate/Lactate+Dex/cAMP+Met)及小檗喊（Pyrucate/Lactate+Dex/ cAMP+BBR)可呈時間依賴性地降低肝細(xì)胞內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生。2mmol/L二甲雙胍作用4、8、 12和24h時肝葡萄糖產(chǎn)生分別下降28%、56%、80%和98% (均P〈0. 05,與丙酮酸/乳酸 +地塞米松/cAMP相比，aP〈0. 05,圖1)。2. 5 μ mol/L的小檗堿作用2、4、8、12和24h時肝葡 萄糖產(chǎn)生分別下降33%、57%、65%、76%和92% (均P〈0. 05,與丙酮酸/乳酸+地塞米松 /cAMP 相比，aP〈0. 05,圖 2)。
[0045] 2、二甲雙胍及小檗堿呈劑量依賴性降低肝臟糖異生
[0046] 作用時間為8h時，與對照相比，0. 1、0. 25mmol/L二甲雙胍作用并不明顯，濃 度為0.5mmol/L時二甲雙胍開始起作用，2mmol/L二甲雙胍明顯降低肝臟葡萄糖產(chǎn)生 [(79. 51±1· 52 對 343. 87±37· 96) μ mol/L，Ρ〈0· 05]，同時加 AMPK 的抑制劑 Compound C后明顯減弱二甲雙胍對肝糖產(chǎn)生的抑制[(176. 42 ±0. 97對79. 51 ± 1. 52) μ mol/L， Ρ〈0· 05] ;0· 1 μ mol/L的小檗堿無降低糖異生的作用，0· 5、1 μ mol/L的作用還不十分明顯， 2. 5 μ mol/L小檗堿明顯降低肝臟葡萄糖產(chǎn)生[(100. 37 ±16. 10對343. 87 ±37. 96) μ mol/ L，P〈0. 05]，但是加 Compound C后不能逆轉(zhuǎn)小檗堿對肝糖產(chǎn)生的抑制（圖3,與底物對照組 比較，aP〈〇. 05 ;與加入地塞米松/cAMP組比較，bP〈0. 05 ;與加入地塞米松/cAMP組+2mM二 甲雙胍組比較，cP〈0. 05)。
[0047] 3、二甲雙胍及小檗堿時間依賴性降低肝糖異生相關(guān)基因的mRNA水平
[0048] PEPCK、葡萄糖-6-磷酸酶（G6pase)、果糖1，6-二磷酸酶（Fbpase)是糖異生途徑 所需的催化酶，而且其中的PEPCK、G6pase是糖異生過程的限速酶。F0X0UCCAAT增強(qiáng)子結(jié) 合蛋白（C/ΕΒΡ) α、C/ΕΒΡβ、過氧化物酶增殖物激活受體γ共激活子（PGC) 1 α、肝細(xì)胞核 因子（HNF)4a是對PEPCK、G6pase轉(zhuǎn)錄起正性調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。
[0049] 用熒光實時定量PCR的反應(yīng)體系檢測。引物設(shè)計：基因組序列網(wǎng)站（NCBI)查 找基因序列，擴(kuò)增序列的選擇采用跨內(nèi)含子的策略以排除DNA污染的干擾，引物均采用 Primer3. 0軟件在線設(shè)計（http://frodo. wi. mit. edu/)。設(shè)計要求產(chǎn)物擴(kuò)增長度100? 250bp，Optimal Tm60 ?65°C，Primer GC% 40 ?60%。序列如表 1 :
[0050] 表1RT-PCR引物序列
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 小檗堿在抑制PPP1R3C基因表達(dá)方面的應(yīng)用。
2. 小檗堿在抑制PPP1R3C的mRNA水平方面的應(yīng)用。
3. 小檗堿用于制備抑制PPP1R3C基因表達(dá)的藥物。
4. 小檗堿用于抑制PPP1R3C的mRNA水平的藥物。 5. PPP1R3C基因用于制備篩選抑制或促進(jìn)糖異生的藥物。
【文檔編號】A61K31/4375GK104055772SQ201410260796
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月12日
【發(fā)明者】寧光, 唐紅菊, 周麗斌, 王曉, 李鳳英, 劉赟, 張宏利, 李文毅, 顧燕云 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院