重組Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化作用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及重組融合Tat-Cygb蛋白的新用途，實(shí)驗(yàn)研究證明：所述Tat-Cygb可以治療炎癥、愈合創(chuàng)傷以及抗肝纖維化，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)，有望為臨床提供重組融合Tat人源細(xì)胞球蛋白的新治療手段。
【專利說明】重組Tat-Cygb融合蛋白的抗炎、創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化作用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及重組融合蛋白在抗炎、創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]炎癥(inflammation):是具有血管系統(tǒng)的活體組織對(duì)損傷因子發(fā)生的防御反應(yīng)，是感染及其許多疾病的最基本病理過程。炎癥的發(fā)生發(fā)展過程一般分為三期:毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性亢進(jìn) ；血小板吸附及白細(xì)胞游走；肉芽組織增生。炎癥是臨床常見的病理過程，可以發(fā)生于機(jī)體各組織和器官。急性炎癥具有紅、腫、熱、痛等變化，同時(shí)常伴有發(fā)熱、白細(xì)胞增多等全身反應(yīng)。致炎因子作用于機(jī)體后，一方面引發(fā)細(xì)胞損傷壞死；另一方面，刺激機(jī)體抗病機(jī)能增加，使機(jī)體的內(nèi)壞境及內(nèi)境界和外壞境之間達(dá)到新的均衡。
[0003]創(chuàng)傷愈合(wound healing):是機(jī)體遭受外力作用后,皮膚等組織出現(xiàn)離斷或缺損后的愈合恢復(fù)過程，包括各種組織的再生和肉芽組織增生、瘢痕組織形成等。
[0004]皮膚創(chuàng)傷愈合的基本過程主要包括:急性炎癥期、細(xì)胞增生期、瘢痕形成期、表皮及其它組織再生期。根據(jù)創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度分為三種情況:創(chuàng)傷僅限于皮膚表皮層；稍重者皮膚和皮下組織斷裂并出現(xiàn)傷口 ；嚴(yán)重的創(chuàng)傷可有肌肉、肌腱、神經(jīng)的斷裂。
[0005]創(chuàng)傷愈合可分為一般愈合、二期愈合、痂下愈合三種類型。
[0006]I) 一般愈合(healing by first intention):一般愈合的時(shí)間短,形成瘢痕較少。多見于如手術(shù)切口等組織缺損少、創(chuàng)緣整齊、無感染、經(jīng)粘合或縫合后創(chuàng)面對(duì)合嚴(yán)密的傷口，傷口中只有少量血凝塊，炎癥反應(yīng)輕微，表皮再生在24~48小時(shí)內(nèi)便可覆蓋傷口。肉芽組織在第3天就可從傷口邊緣長(zhǎng)出并很快將傷口填滿，5~6天膠原纖維形成，約2~3周完全愈合。
[0007]2) 二期愈合(healing by second intention):見于組織缺損較大、倉(cāng)ll緣不整、無法整齊對(duì)合，或伴有感染的傷口。與一期愈合相比，主要有如下不同:①由于壞死組織多，或由于感染，繼續(xù)引起局部組織變性、壞死，炎癥反應(yīng)明顯。只有控制感染，清除壞死組織，再生才能開始。②傷口大,且傷口收縮明顯,從傷口底部及邊緣長(zhǎng)出肉芽組織將傷口填平。③愈合的時(shí)間較長(zhǎng)，形成的瘢痕較大。
[0008]3)痂下愈合(healing under scab):傷口表面的血液、滲出液及壞死物質(zhì)干燥后形成黑褐色硬痂，在痂下進(jìn)行愈合。待上皮再生完成后，痂皮即脫落。如果痂下滲出物較多，如果有細(xì)菌感染，痂皮阻礙滲出物排出，不利于愈合。此種愈合所需時(shí)間長(zhǎng)于無痂者，因這種情況下表皮再生必須首先將痂皮溶解，然后才能生長(zhǎng)。
[0009]所以，創(chuàng)傷愈合用藥原則應(yīng)該包括縮小創(chuàng)面、防止再損傷和促進(jìn)組織再生。損傷的程度及組織的再生能力決定修復(fù)的方式、愈合的時(shí)間及瘢痕的大小。組織的再生能力主要在進(jìn)化過程中獲得，但仍受全身及局部條件的影響。全身因素(如年齡、營(yíng)養(yǎng))及局部因素(如感染與異物感染、局部血液循環(huán)、神經(jīng)支配、電離輻射等)兩方面都會(huì)影響再生修復(fù)的進(jìn)展。
[0010]肝纖維化OfepatiC fibrosis, HF):是多種慢性肝臟疾病的共有病理階段，肝纖維化持續(xù)發(fā)展可轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不踔粮伟?，且肝病的中晚期都?huì)發(fā)生致命的并發(fā)癥。我國(guó)是一個(gè)肝病大國(guó)，高發(fā)病率和高死亡率是肝臟疾病的最大特點(diǎn)。肝纖維化是肝臟應(yīng)對(duì)不同病因(炎癥、酒精、寄生蟲、化學(xué)毒物、免疫、營(yíng)養(yǎng)代謝障礙、血液循環(huán)障礙、慢性病毒感染、膽管阻塞等)損傷刺激的自我修復(fù)反應(yīng)；損傷的肝細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，伴隨肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、血小板分泌的細(xì)胞因子和某些化學(xué)介質(zhì)共同激活肝星狀細(xì)胞，使其轉(zhuǎn)化為肝肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFB)，MFB通過旁分泌和自分泌作用，產(chǎn)生大量以膠原為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix, ECM), ECM的過渡沉積,合成與降解失衡,導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展。研究證明，肝纖維化是可逆的，而一旦發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，人們將束手無策。肝纖維化是肝硬化的早期階段和必經(jīng)階段，在一定情況下可以逆轉(zhuǎn)，但若病因持續(xù)存在，肝纖維化逐漸加重，肝小葉及血管等逐漸被改建，肝臟的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，中心靜脈區(qū)和匯管區(qū)出現(xiàn)間隔、假小葉形成，即發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化。
[0011]積極探索肝纖維化發(fā)病機(jī)制，尋求有效治療措施，對(duì)降低肝硬化發(fā)病率和死亡率具有重要意義。目前，肝纖維化治療研究主要集中在以下幾個(gè)方面:1)保護(hù)肝細(xì)胞，抑制HSC激活，2)抑制ECM合成，促進(jìn)其降解，3)抑制細(xì)胞因子活性，調(diào)節(jié)信號(hào)通路。
[0012]細(xì)胞球蛋白(Cytoglobin, Cygb),是近幾年來在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的六配位血紅素球蛋白(hxHb)超家族中的新成員，在多種生物及組織中表達(dá)。研究表明，細(xì)胞球蛋白Cygb可能與癌癥的發(fā)生有關(guān)。食管癌、肺癌及結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，Cygb的表達(dá)常常是被抑制的，通過基因治療的方法表達(dá)Cygb，能夠抑制肺癌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。
[0013]細(xì)胞穿膜肽，即CPPs，又稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域或膜轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，是一種由30個(gè)或者更少氨基酸組成的能夠穿透細(xì)胞膜的多肽，能夠運(yùn)載生物活性物質(zhì)如肽、蛋白、反義核苷酸和脂質(zhì)體等許多物質(zhì)。細(xì)胞穿膜肽的出現(xiàn)，解決了因藥物無法進(jìn)入細(xì)胞而導(dǎo)致藥效嚴(yán)重削弱的難題。Tat是近年研究較深入的細(xì)胞穿膜肽，通過與生物大分子(如核酸或蛋白質(zhì))的融合，能夠使融合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
[0014]本發(fā)明所述重組融合Tat-Cygb人源細(xì)胞球蛋白的抗炎、創(chuàng)傷愈合及抗肝纖維化作用，迄今為止，尚未見有國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0015]本發(fā)明提供了重組融合Tat人源細(xì)胞球蛋白在抗炎癥中的應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明提供了重組融合Tat人源細(xì)胞球蛋白在創(chuàng)傷愈合中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明提供了重組融合Tat人源細(xì)胞球蛋白在抗肝纖維化中的應(yīng)用。
[0018]Tat -Cygb抗炎癥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:通過模型組與各給藥組的對(duì)比可以看出，各給藥組均可不同程度地緩解小鼠的耳廓腫脹，高劑量TAT -Cygb組和地塞米松組與模型組相比，均具有顯著性差異(P〈0.01)，其中高劑量TAT -Cygb的抗炎效果略遜色于地塞米松組，但二者之間無顯著性差異(P>0.05)，而低劑量TAT - Cygb組小鼠的耳廓腫脹程度較地塞米松組和高劑量組高，與模型組相比無顯著性差異(P〈0.05)。
[0019]Tat -Cygb創(chuàng)傷愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TAT -Cygb和Cygb均可促進(jìn)傷口愈合,推測(cè)二者均因具有過氧化物酶活性而具有抗炎癥作用，從而促進(jìn)傷口愈合。此外，由于TAT - Cygb帶有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮膚細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)作用，促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)，因此效果較Cygb更明顯。
[0020]Tat - Cygb抗肝纖維化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
[0021]利用CCI4致小鼠肝纖維化模型，通過觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和肝組織外觀、測(cè)定血清及組織中各項(xiàng)肝功能指標(biāo)含量以及病理切片分析驗(yàn)證，治療組肝臟恢復(fù)了血色和光澤，肝臟內(nèi)膠原纖維含量明顯減少；在肝功能檢測(cè)中，治療組血清ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常組，與模型組相比有顯著差異；纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)中，HA、LN、C-1I1、C-1V等含量變化證明TAT-Cygb可減少肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的含量；肝組織指標(biāo)含量變化顯示，TAT-Cygb治療組可減輕超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢復(fù)正常水平，同時(shí)可降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量和膠原纖維的亞氨基成分Hyp，綜上可知，通過尾靜脈注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促進(jìn)CCl4導(dǎo)致的小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)。
[0022]本發(fā)明提供了以重組融合Tat-Cygb蛋白為活性成分組成的藥物組合物在抗炎癥中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供了以重組融合Tat-Cygb蛋白為活性成分組成的藥物組合物在創(chuàng)傷愈合中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供了以重組融合Tat-Cygb蛋白為活性成分組成的藥物組合物在抗肝纖維化中的應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0025]圖1重組TAT-Cygb對(duì)小鼠耳廓腫脹急性炎癥的影響
[0026]其中:1-模型組；2—地塞米松組；3—低劑量組；4一高劑量組
[0027]圖2大鼠創(chuàng)傷模型構(gòu)建
[0028]圖3皮膚創(chuàng)傷愈合情況
[0029]圖4大鼠皮膚創(chuàng)傷組織切片HE染色(第16天，X 100)
[0030]其中:(a)-正常皮膚；(b)-對(duì)照組；(C)—紅藥水組；(d)-低劑量組；(e)-聞劑量Cygb 組；(f)-低劑量 TAT-Cygb 組；(g)-高劑量 TAT-Cygb 組
[0031]圖5各組小鼠肝臟外觀
[0032]其中:(a)-正常組；(b)-剛造模完小鼠;(C)-模型組；(d)-低劑量TAT-Cygb組；(e)_高劑量TAT-Cygb組
[0033]圖6各組小鼠肝臟HE染色(40倍)
[0034]其中:(a)-正常組；(b)-剛造模完小鼠;(C)-模型組；(d)-低劑量TAT-Cygb組；(e)_高劑量TAT-Cygb組
[0035]圖7各組小鼠肝臟天狼猩紅染色(40倍)
[0036]其中:(a)-正常組；(b)-剛造模完小鼠；(C)-模型組；(d)-低劑量TAT - Cygb組;(e)-高劑量TAT - Cygb組
[0037]圖8各組小鼠肝臟Masson三色染色(40倍)
[0038]其中:(a)-正常組；(b)-剛造模完小鼠;(C)-模型組；(d)-低劑量TAT-Cygb組；(e)高劑量TAT-Cygb組
[0039]圖OTAT-Cygb融合蛋白對(duì)各組小鼠血清ALT和AST的影響[0040]其中:1-剛造模完的小鼠；2_正常組；3_模型組；4_高劑量TAT-Cygb組；5_低劑量 TAT-Cygb 組；*p〈0.05vs 模型組；**p〈0.01vs 模型組
[0041]圖1OTAT-Cygb融合蛋白對(duì)各組小鼠血清HA、LN、C-111, C-1V的影響
[0042]其中:1-剛造模完的小鼠；2_正常組；3_模型組；4_高劑量TAT-Cygb組；5_低劑量 TAT-Cygb 組；*p〈0.05vs 模型組；**p〈0.01vs 模型組
[0043]圖1ITAT-Cygb融合蛋白對(duì)各組小鼠肝組織SOD、MDA、Hyp的影響
[0044]其中:1 -剛造模完的小鼠；2 -正常組；3 -模型組；4 -高劑量TAT - Cygb組；5 -低劑量TAT - Cygb組;*p〈0.05vs模型組;**p〈0.01vs模型組
[0045]實(shí)施方案:
[0046]以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0047]《實(shí)施例1》重組Tat-Cygb抗炎癥功能驗(yàn)證
[0048]按照專利號(hào)201010202986.2所述方法，制備重組融合Tat-Cygb蛋白。
[0049]I) 二甲苯致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn):將40只25g雌雄對(duì)半的KM小白鼠，按每組5只雄鼠和5只雌鼠，隨機(jī)分為5組，分別為高劑量TAT-Cygb組、低劑量TAT-Cygb組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型組；
[0050]2)在每只小白鼠左耳廓內(nèi)均勻涂30 μ L的二甲苯，引發(fā)急性的耳廓腫脹炎癥，可見小白鼠左耳紅腫脹大；
[0051]3) 30min后，給小白鼠左耳廓均勻涂藥，對(duì)照組為右耳廓。高劑量TAT-Cygb組(500 μ g/只)，低劑量TAT -Cygb (100 μ g/只)，陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松軟膏)，模型組(生理鹽水)；
[0052]4) Ih后，脫頸椎處死小鼠，用棉簽輕擦去小白鼠左耳廓上殘余的藥，用眼科剪剪下左右耳；
[0053]5)用打孔器(直徑8_)打下兩只耳朵相同的部位，得到兩個(gè)圓形耳片，分別置于分析天平上稱重，記錄。
[0054]結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的耳廓腫脹率(圖1)，通過模型組與各給藥組的對(duì)比可以看出，各給藥組均可不同程度地緩解小鼠的耳廓腫脹，高劑量TAT -Cygb組和地塞米松組與模型組相比，均具有顯著性差異(P〈0.01)，其中高劑量TAT -Cygb的抗炎效果略遜色于地塞米松組，但二者之間無顯著性差異(P>0.05)，而低劑量TAT -Cygb組小鼠的耳廓腫脹程度較地塞米松組和高劑量組高，與模型組相比無顯著性差異(P〈0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量的TAT - Cygb抗炎效果較弱，而高劑量的TAT - Cygb具有較好的抗炎效果。
[0055]《實(shí)施例2》皮膚創(chuàng)傷愈合動(dòng)物模型驗(yàn)證
[0056]I)正常飼養(yǎng)10只(200g±20g)雄性KM大白鼠7d，開始造模；
[0057]2)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉大鼠，該劑量可使大鼠維持昏迷狀態(tài)2h ~3h ;
[0058]3)用眼科彎剪剪去大鼠背部的大部分毛，涂上適量脫毛膏；
[0059]4) IOmin~15min后,用醫(yī)用棉花擦去殘余的脫毛膏和毛,再用溫水擦干凈,注意不要讓大鼠受涼；
[0060]5)用75%酒精消毒大鼠背部皮膚，然后用直徑12mm的圓形打孔器在大鼠背部均勻切6個(gè)相同的圓形創(chuàng)面，醫(yī)用棉花止血，造模完成；
[0061]促進(jìn)創(chuàng)傷愈合治療:
[0062]I)在每次給藥前腹腔注射3%戊巴比妥鈉(15mg/kg)麻醉大鼠；
[0063]2)右前部創(chuàng)面為高劑量TAT - Cygb組，每天涂抹無菌TAT - Cygb (80 μ g/次)，一日兩次；
[0064]3)左前部創(chuàng)面為低劑量TAT - Cygb組,每天涂抹無菌TAT - Cygb (30 μ g/次)，一日兩次；
[0065]4)右中部創(chuàng)面為高劑量Cygb組,每天涂抹無菌TAT - Cygb (80 μ g/次)，一日兩次；
[0066]5)左中部創(chuàng)面為低劑量Cygb組,每天涂抹無菌TAT - Cygb (30 μ g/次)，一日兩次；
[0067]6)右后部創(chuàng)面為陽(yáng)性對(duì)照組，每天涂抹紅藥水(100 μ L/次)，一日兩次；
[0068] 7)左后部創(chuàng)面為陰性對(duì)照組，每天涂抹無菌生理鹽水(100 μ L/次)，一日兩次。
[0069]8)每天觀察傷口創(chuàng)面表皮肉芽組織的生長(zhǎng)情況，以及上皮組織的生長(zhǎng)愈合情況，并拍照記錄。在給藥后包上傷口敷料，避免感染。
[0070]皮膚組織切片的制備與染色:
[0071]給藥15d后，取創(chuàng)傷愈合處皮膚組織固定，做皮膚組織石蠟切片，觀察傷口愈合后疤痕組織的大小。
[0072]TAT - Cygb對(duì)大鼠皮膚創(chuàng)傷愈合的影響:
[0073]于正常條件下飼養(yǎng)KM大白鼠10只，7d后造模。利用12mm的皮膚打孔器在脫毛后的大鼠背部按順序均勻打6個(gè)孔。分別代表高劑量TAT-Cygb組(160yg/d)、低劑量TAT -Cygb 組(60 μ g/d)、高劑量 Cygb 組(160 μ g/d)、低劑量 Cygb 組(60 μ g/d)、陽(yáng)性對(duì)照組(紅藥水，200 μ L/d)、陰性對(duì)照組(無菌生理鹽水，200 μ L/d)(圖2)。每天用藥前，肉眼觀察大鼠傷口創(chuàng)面表皮肉芽組織的成長(zhǎng)情況，以及上皮組織的生長(zhǎng)愈合速度，拍照記錄。
[0074]通過每天用藥后的跟蹤觀察可發(fā)現(xiàn)，各劑量的TAT - Cygb和Cygb組與紅藥水組、對(duì)照組的傷口創(chuàng)面修復(fù)程度與愈合方式有較顯著的差別(圖3)。造模第一天，各組創(chuàng)面差別不大，傷口面積大小相同，表面比較濕潤(rùn)；用藥第四天，可見高低劑量的TAT - Cygb組、Cygb組以及紅藥水組的創(chuàng)面已長(zhǎng)出肉芽組織，帶少量滲出液，局部已經(jīng)長(zhǎng)出薄層或點(diǎn)狀上皮，而對(duì)照組傷口已形成褐色結(jié)痂，這是由傷口表面的血液、壞死物質(zhì)以及滲出液干燥后形成的；用藥后第七天，傷口面積縮小，高低劑量的TAT - Cygb組和高劑量Cygb組傷口皮膚創(chuàng)緣明顯收縮，肉芽組織生長(zhǎng)完好，傷口紅潤(rùn)，而低劑量Cygb組和紅藥水組傷口形成痂皮，與對(duì)照組相似，這種于痂下愈合的方式一般比無痂傷口愈合慢，雖然同樣是在創(chuàng)緣增生表皮基底細(xì)胞，但其在痂下進(jìn)行，必須在溶解部分痂皮后，才能不斷由外圍向創(chuàng)面中心移動(dòng)再生表皮，直至表皮再生完成，痂皮才能脫落，因此這種愈合方式耗時(shí)較長(zhǎng)；用藥后第十天，傷口面積繼續(xù)縮小，高低劑量TAT - Cygb組傷口趨于愈合，高劑量Cygb組傷口肉芽組織生長(zhǎng)完好，低劑量Cygb組、紅藥水組和對(duì)照組仍有痂皮，部分再生表皮上的痂皮脫落。用藥后第十三天，高低劑量TAT - Cygb組和高劑量Cygb組創(chuàng)面已愈合，但仍需要時(shí)日待表皮完全上皮化，低劑量Cygb組痂皮脫落，傷口肉芽組織生長(zhǎng)完好，紅藥水組和對(duì)照組仍見小塊痂皮，愈合程度欠佳。[0075]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TAT - Cygb和Cygb均可促進(jìn)傷口愈合，推測(cè)二者均因具有過氧化物酶活性而具有抗炎癥作用，從而促進(jìn)傷口愈合。此外，由于TAT -Cygb帶有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮膚細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)作用，促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)，因此效果較Cygb更明顯。
[0076]正常皮膚由表皮、真皮和皮下組織構(gòu)成，真皮層中可見大量結(jié)蹄組織和皮膚附屬器，如汗腺、皮脂腺和毛囊等。而全層皮膚切除的大鼠，其皮膚附屬器被完全破壞，愈合過程中，肉芽組織增生，通過改建成熟后，形成由膠原纖維和彈性纖維組成的纖維結(jié)締組織，即瘢痕組織。
[0077]將用藥16d后的大鼠創(chuàng)傷皮膚組織切片，可觀察每組大鼠創(chuàng)傷處瘢痕修復(fù)區(qū)域的大小。如(圖4)所示，對(duì)照組B大鼠皮膚創(chuàng)傷處在100倍鏡下的一個(gè)視野內(nèi)僅能看到玻璃樣變的瘢痕組織，周圍的毛囊、汗腺和皮脂腺等皮膚附屬器在視野之外；同樣，紅藥水組C大鼠皮膚創(chuàng)傷由于痂下愈合較慢，一個(gè)視野內(nèi)看不到正常皮膚構(gòu)造；低劑量Cygb組D，在100倍鏡的一個(gè)視野內(nèi)已能看到部分皮膚附屬器；高劑量Cygb組E、低劑量TAT - Cygb組F和高劑量TAT-Cygb組G可見周圍的皮膚附屬器向中心靠攏，瘢痕修復(fù)區(qū)域依次減小。推測(cè)TAT -Cygb和Cygb因其可改善細(xì)胞氧化應(yīng)激，防止成纖維細(xì)胞過度增殖遷移和細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，使得瘢痕組織比對(duì)照組和紅藥水組的小，另一反面，TAT - Cygb和Cygb均通過抗炎癥作用促進(jìn)創(chuàng)傷較快愈合，上皮形成較快，其中TAT -Cygb組比Cygb組效果更明顯,而對(duì)照組和紅藥水組由于痂下愈合較慢，同時(shí)在愈合過程中大鼠的運(yùn)動(dòng)加劇了傷口的反復(fù)感染，使肉芽組織過 度增生，導(dǎo)致瘢痕組織較大。
[0078]《實(shí)施例3》=Tat-Cygb融合蛋白治療小鼠肝纖維化
[0079]肝纖維化小鼠模型的構(gòu)建及治療:
[0080]I)實(shí)驗(yàn)分組:模型組、TAT - Cygb高劑量組、TAT - Cygb低劑量組、正常組，每7只小白鼠一組，共28只小白鼠。
[0081]2)肝纖維化小鼠模型構(gòu)建:正常飼養(yǎng)25g的KM小白鼠一周，開始造模。模型組、高劑量TAT -Cygb組和低劑量TAT -Cygb組的小白鼠以lmL/100g體重腹腔注射CCl4溶液，每隔兩天腹腔注射一次，共注射16次，造模歷時(shí)46天。前3次使用15%的CCl4溶液，中間10次使用25%的CCl4溶液，最后3次使用30%的CCl4溶液。正常組小白鼠腹腔注射相同體積的生理鹽水。所有小白鼠均用足量的鼠糧和水飼養(yǎng)。
[0082]3)TAT-Cygb治療:待46天造模完成，立即開始治療。高劑量TAT - Cygb組以120 μ g/ (次?只)尾靜脈注射TAT -Cygb融合蛋白，低劑量TAT -Cygb組以60 μ g/ (次?只)尾靜脈注射TAT - Cygb融合蛋白，模型組和正常組小白鼠以200 μ L/ (次.只)尾靜脈注射生理鹽水。每隔一天尾靜脈注射一次，共注射15次，歷時(shí)四周。
[0083]造模46d中，小鼠精神萎靡不振，皮毛不干凈，肚子脹大，活動(dòng)減少，嗜睡，進(jìn)食量和飲水減少，尿液黃，說明小鼠肝臟因CCl4受損，進(jìn)而影響到小鼠的健康生長(zhǎng)。而正常組皮毛順滑，體重恒定，較活躍，進(jìn)食量和飲水均正常。
[0084]在給藥的一個(gè)月內(nèi)，高劑量TAT - Cygb組小鼠逐漸活躍起來，皮毛變得順滑，進(jìn)食量和飲水趨于正常。低劑量TAT - Cygb組小鼠比模型組稍好，活動(dòng)較活躍，但皮毛不順滑。而模型組小鼠仍然有皮毛不干凈、嗜睡、進(jìn)食量和飲水較少的癥狀。小鼠肝臟外觀:
[0085]在給藥I個(gè)月后，解剖小鼠，肉眼觀察肝臟外觀，并拍照記錄。
[0086]如(圖5)，可以明顯看出各組小鼠肝臟外觀的區(qū)別及變化。正常組小鼠肝臟質(zhì)地軟，光澤度高，表面光滑，邊緣銳利整齊，整個(gè)肝臟呈暗紅色，見(圖5a);模型組小鼠肝臟質(zhì)地硬光澤度低，表面粗糙有顆粒狀，邊緣較鈍，整個(gè)肝臟發(fā)黃，趨向于肝硬化，個(gè)別肝臟部分與膈膜和周圍器官粘連，如(圖5b);—個(gè)月后的模型組小鼠肝臟質(zhì)地仍較硬，光澤度低，表面粗糙有顆粒狀，邊緣比剛造模完的肝臟有所好轉(zhuǎn)，整個(gè)肝臟仍較黃，見(圖5c);低劑量TAT - Cygb組小鼠肝臟質(zhì)地比模型組軟，但仍比正常組硬，光澤度低，表面有模糊顆粒，邊緣較銳利，肝臟顏色稍黃，見(圖5d);高劑量TAT-Cygb組小鼠肝臟質(zhì)地軟，光澤度明顯增加，表面較光滑，邊緣銳利整齊，肝臟呈暗紅色，見圖5e。
[0087]肝臟切片HE染色(圖6)顯示:
[0088]正常組小鼠肝組織的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，有完整的網(wǎng)狀纖維支架，分布規(guī)律，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心朝四周放射排列，肝索細(xì)胞排列緊湊，形態(tài)正常，見(圖6a);模型組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)纖維化并擴(kuò)大，膠原沉積于其周圍，匯管之間有纖維間隔形成，肝細(xì)胞體積增大，伴隨大片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明嚴(yán)重的損傷性病理改變，見(圖6b);一個(gè)月后的模型組小鼠肝組織有稍微的恢復(fù)，但仍有嚴(yán)重的損傷性病理改變，如(圖6c);低劑量TAT - Cygb組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈周圍仍有膠原沉積，偶見匯管區(qū)纖維化和匯管之間的纖維間隔，肝索細(xì)胞排列緊湊，形態(tài)正常，見(圖6d);高劑量TAT - Cygb組小鼠肝組織的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索呈放射排列，無炎性細(xì)胞，個(gè)別偶見匯管區(qū)纖維化，與低劑量TAT-Cygb組和模型組對(duì)比明顯好轉(zhuǎn)，如(圖6e)。HE染色結(jié)果可初步說明TAT - Cygb對(duì)CCI4導(dǎo)致的肝纖維化有劑量依賴的治療作用。
[0089]肝臟切片苦味酸天狼猩紅染色
[0090]采用苦味酸天狼猩紅染色法以更好地識(shí)別膠原纖維。染色結(jié)果可見(圖7)，正常組小鼠肝組織肝小葉完整，結(jié)構(gòu)正常，只在中央靜脈、門管區(qū)、肝門靜脈和肝動(dòng)脈邊緣有少量膠原著色，無纖維化，如(圖7a);模型組小鼠肝組織匯管區(qū)周圍大量膠原沉積、纖維化，伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管之間以及匯管和中央靜脈之間形成纖維間隔，使肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，并形成假小葉，如(圖7b);低劑量TAT-Cygb組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)完整，纖維化程度較輕，匯管區(qū)纖維化，纖維間隔減少，膠原著色比模型組淺，如(圖7c);高劑量TAT-Cygb組小鼠肝組織小葉完整，結(jié)構(gòu)正常，偶見小葉內(nèi)小纖維瘢痕，匯管區(qū)膠原著色淺，纖維化程度低，如(圖7d)?？辔端崽炖切杉t染色表明TAT -Cygb可顯著降低小鼠肝臟中的膠原含量，減輕肝纖維化程度。
[0091]肝臟切片Masson三色染色:
[0092]采用Masson三色染色(圖8)以區(qū)分組織中的膠原纖維和肌纖維。如圖8a，正常組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)正常，有完整的網(wǎng)狀纖維支架，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心朝四周放射排列，僅肝動(dòng)脈、肝門靜脈和少量中央靜脈邊緣存在少量膠原，無纖維化存在；模型組小鼠肝組織肝小葉紊亂，匯管區(qū)有大量膠原沉積，匯管之間以及匯管和中央靜脈之間形成膠原纖維間隔，假小葉形成，伴隨炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，如(圖Sb);低劑量TAT-Cygb組小鼠肝組織纖維化程度降低，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)纖維化較輕，但門管區(qū)周圍仍有較多膠原存在，如(圖8c);高劑量TAT-Cygb組小鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列有序，匯管區(qū)及門管區(qū)膠原含量明顯降低，纖維化程度輕，較接近正常組，如(圖8d)。Masson三色染色結(jié)果同樣表明TAT - Cygb可顯著降低小鼠肝臟中的膠原含量，減輕肝纖維化程度。肝功能檢測(cè)(ALT、AST):[0093]谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)主要存在于肝細(xì)胞中，是檢測(cè)肝損傷中較靈敏的指標(biāo)，通過檢測(cè)其含量可反映TAT - Cygb對(duì)肝細(xì)胞的治療作用。
[0094]如(圖9)，剛造模完的小鼠血清中ALT含量是正常組的3倍多，AST含量是正常組的2倍多，說明肝臟受到了很大的損傷，I個(gè)月后的模型組雖然恢復(fù)了很多，但其ALT含量仍顯著高于正常組小鼠，說明造模較成功，而高劑量TAT -Cygb組小鼠血清ALT和AST含量均顯著降低，與模型組相比有顯著性差異，其中低劑量TAT -Cygb組小鼠血清ALT含量也顯著低于模型組。
[0095]纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)(HA、LN、C -1I1、C -1V):
[0096]透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、C -1II膠原、C -1V均是肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的主要成分，通過測(cè)其含量變化，可指示肝纖維化的程度。如(圖10)，剛造模完的小鼠血清中HA、LN、C -1II和C -1V含量均明顯高于正常組，I個(gè)月后的模型組含量降低，但仍與正常組相比具有顯著性差異，其中高劑量TAT-Cygb組小鼠血清中的LN、C-1I1、C-1V含量顯著低于模型組，低劑量TAT - Cygb組血清中C -1V顯著低于模型組。
[0097]肝組織指標(biāo)檢測(cè)(S0D、MDA、 Hyp):
[0098]在肝組織中，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的變化可指示機(jī)體內(nèi)活性氧和其衍生物含量的高低。作為膠原纖維的亞氨基酸成分，Hyp可間接指示肝內(nèi)的膠原纖維水平。如(圖11)，剛造模完的小鼠和模型組因肝中的氧化應(yīng)激導(dǎo)致SOD消耗增加，超氧化物歧化酶含量顯著低于正常組(P〈0.05)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA含量顯著高于正常組(p〈0.01)，可促進(jìn)激活肝星狀細(xì)胞，并合成膠原；Hyp含量顯著高于正常組(p〈0.01)，指示膠原纖維含量的增加。在高劑量TAT-Cygb作用下，SOD含量顯著增加，MDA和Hyp含量顯著降低，低劑量TAT-Cygb作用下，MDA含量與模型組相比也具有顯著性差異(p〈0.05)。
[0099]利用CCI4致小鼠肝纖維化模型，通過觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和肝組織外觀、測(cè)定血清及組織中各項(xiàng)肝功能指標(biāo)含量以及病理切片分析，研究了 TAT-Cygb融合蛋白對(duì)肝纖維化的作用。從肝臟外觀和病理切片上觀察，治療組肝臟恢復(fù)了血色和光澤，肝臟內(nèi)膠原纖維含量明顯減少，表明TAT-Cygb可促進(jìn)CCI4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)；在肝功能檢測(cè)中，治療組血清中ALT和AST含量均不同程度地降低，接近正常組，與模型組相比有顯著差異；纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)中，HA、LN、C-1I1、C-1V等含量變化證明TAT-Cygb可減少肝細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的含量；肝組織指標(biāo)含量變化顯示，TAT-Cygb治療組可減輕超氧化物歧化酶的消耗，使SOD含量恢復(fù)正常水平，同時(shí)可降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量和膠原纖維的亞氨基成分Hyp。綜上可知，通過尾靜脈注射TAT-Cygb融合蛋白，可以促進(jìn)CCl4導(dǎo)致的小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)。
【權(quán)利要求】
1.重組融合Tat- Cygb人源細(xì)胞球蛋白在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
2.重組融合Tat-Cygb人源細(xì)胞球蛋白為活性成分組成的藥物組合物在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。
3.重組融合Tat- Cygb人源細(xì)胞球蛋白在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。
4.重組融合Tat-Cygb人源細(xì)胞球蛋白為活性成分組成的藥物組合物在制備創(chuàng)傷愈合藥物中的應(yīng)用。
5.重組融合Tat- Cygb人源細(xì)胞球蛋白在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
6.重組融合Tat-Cygb人源細(xì)胞球蛋白為活性成分組成的藥物組合物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用 。
【文檔編號(hào)】A61P1/16GK103990112SQ201410232396
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】許瑞安, 李招發(fā), 張如倩 申請(qǐng)人:許瑞安