鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種鹽酸芐達(dá)明在制備預(yù)防或治療流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首先檢測了鹽酸芐達(dá)明對MDCK細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示鹽酸芐達(dá)明的最大無毒性濃度為50.0μM；其次，在完全無毒性的濃度范圍內(nèi)測定了鹽酸芐達(dá)明的抗病毒活性，結(jié)果顯示這種小分子化合物具有顯著的抗病毒活性，且抗病毒作用呈劑量依賴效應(yīng)；最后，檢測了鹽酸芐達(dá)明對不同型和亞型的流感病毒的抗病毒活性，結(jié)果顯示鹽酸芐達(dá)明可以劑量依賴地抑制所有被檢測流感病毒株的復(fù)制，表明鹽酸芐達(dá)明的抗流感病毒活性具有廣譜性。因此，本發(fā)明首次披露了鹽酸芐達(dá)明是一種新型廣譜抗流感病毒藥物，可以用于制備預(yù)防或治療流感病毒感染的藥物。
【專利說明】鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae),流感病毒屬。根據(jù)病毒粒子核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也稱甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因組由8條大小不等的單股負(fù)鏈RNA組成，分別以節(jié)段I至節(jié)段8命名。病毒基因組全長約13.6kb，編碼10種結(jié)構(gòu)蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)。根據(jù)病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可進(jìn)一步分為17個H(H1-H17)和10個N(Nl-NlO)亞型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亞型。而目前危害嚴(yán)重的高致病性禽流感多為H5、H7和H9亞型，其中以H5N1亞型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大爆發(fā)，僅在人和海豹中發(fā)現(xiàn)。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流感流行，可感染人類和豬。
[0003]流感病毒的整個生活周期需要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)完成。感染的起始是病毒顆粒表面的刺突HA識別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面含唾液酸的受體。唾液酸與次末端半乳糖的連接鍵，決定了病毒的宿主特異性，該連接鍵在禽類中為α (2-3),在人類中為α (2_6)。病毒吸附細(xì)胞后，細(xì)胞通過網(wǎng)格蛋白受體介導(dǎo)的胞飲作用攝入病毒。在細(xì)胞內(nèi)，網(wǎng)格蛋白分子解離，病毒與內(nèi)涵 體融合形成吞噬體，使得病毒粒子周圍的PH值下降至5.0左右。在此pH條件下，病毒HA蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，使位于輕鏈(HA2) N端的融合肽暴露，從而引起病毒囊膜與細(xì)胞膜融合。低PH環(huán)境也致使大量H+經(jīng)由M2離子通道進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部，導(dǎo)致Ml蛋白與vRNPs的解離。兩者的共同結(jié)果致使病毒粒子的vRNPs釋放到被感染細(xì)胞的胞漿。vRNPs隨后轉(zhuǎn)到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，復(fù)制時病毒首先以自身RNA為模板合成互補(bǔ)RNA (cRNA)，然后以cRNA為模板再合成vRNA。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA由核內(nèi)轉(zhuǎn)移到胞漿，翻譯出病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。一部分合成蛋白如NP需要重新轉(zhuǎn)移到核內(nèi)與新生成的vRNA組裝成vRNP，vRNP出核后與其余的病毒蛋白開始組裝成新的病毒粒子，新生成的子代病毒通過神經(jīng)氨酸酶(NA)水解細(xì)胞表面的糖蛋白，釋放N-乙酰神經(jīng)氨酸，促使病毒粒子從出芽位點(diǎn)釋放出來。病毒成熟的最后一步是HA在宿主蛋白酶的作用下裂解為HAl和HA2多肽，這樣的病毒粒子才具有感染性，從而開始新一輪病毒的復(fù)制。
[0004]流感病毒自20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)以來已在全球范圍內(nèi)造成五次大流行，十年左右會產(chǎn)生一次暴發(fā)流行，在全球范圍內(nèi)造成了巨大的損失。流感流行每年可導(dǎo)致25萬~50萬例死亡，300萬~500萬重病例，全球約共有5~15%的人被感染。接種疫苗和使用抗病毒藥物是應(yīng)對流感大流行的重要手段，然而由于流感病毒抗原變異能力強(qiáng)，在大流行前基本上不可能大規(guī)模生產(chǎn)疫苗。目前，經(jīng)美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)正式上市的抗流感病毒藥物有兩類:(1)以金剛烷胺和金剛乙胺為代表的M2離子通道阻斷劑。此類藥只對甲型流感病毒有預(yù)防和治療作用，研究表明此類藥物具有神經(jīng)毒性等毒副作用，而且由于耐藥株的普遍存在，所以CDC建議此類藥物不再用于預(yù)防流感病毒感染。(2)神經(jīng)氨酸酶抑制劑，此類藥的代表是奧斯他韋和扎拉米韋。此類藥物對所有已知的人流感病毒及高致病性禽流感病毒均有效。但是近年來關(guān)于奧斯他韋耐藥株的確不斷有報道。因此，研究并開發(fā)新型抗流感病毒藥物有重要意義。
[0005]鹽酸節(jié)達(dá)明(Benzydamine Hydrochloride),別名消炎靈或炎痛靜，化學(xué)名為1-芐基-3-[3-( 二甲氨基)丙氧基]-1H-吲唑鹽酸鹽。本品為非特異性消炎藥物，具有消炎，解熱、鎮(zhèn)痛作用。對因炎癥引起的疼痛有效。本品尚有罌粟堿樣解痙作用。常用于手術(shù)及外傷所致的各種炎癥及關(guān)節(jié)炎、氣管炎、咽炎等?？膳c抗菌素或磺胺類合用療效更好。
[0006] 目前，沒有見到關(guān)于鹽酸芐達(dá)明在抗流感病毒及治療流感病毒感染引起疾病的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種小分子化合物鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用，從而為臨床上流感的治療提供一種安全有效的小分子化合物。鹽酸芐達(dá)明在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制流感病毒的復(fù)制，可進(jìn)一步開發(fā)為治療或預(yù)防流感病毒感染疾病的藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0008]為了證明鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒(甲型或乙型)感染藥物中的可行性，本發(fā)明采取了以下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證:
[0009]鹽酸芐達(dá)明對MDCK細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn):犬腎細(xì)胞(MDCK)按8X IO3個細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后，分別用0.8μΜ、1.6μΜ、3.125μΜ、6.25μΜ、12.5μΜ、25.0 μ Μ、50.0 μ M和100.0 μ M的鹽酸芐達(dá)明進(jìn)行處理，每組重復(fù)兩個孔，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后，Alamarblue檢測細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，鹽酸芐達(dá)明對MDCK的CC50 (半數(shù)致死濃度)為84.5 μ M0
[0010]鹽酸芐達(dá)明抗流感病毒活性的評價:將MDCK細(xì)胞按照1.5X IO4細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18-24h后，用IOOTCID5q的病毒液(A/PuertoRico/8/34 (HlNl))感染細(xì)胞，同時加入不同濃度梯度藥物。細(xì)胞于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。結(jié)果顯示鹽酸芐達(dá)明能夠劑量依賴地抑制流感病毒的復(fù)制，其IC5tl為6.2 μ M。
[0011]鹽酸芐達(dá)明抗流感病毒作用的廣譜性分析:將MDCK細(xì)胞按照1.5父104細(xì)胞/孔接種于96細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C、5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24h待細(xì)胞長成單層后，用IOOTCId50 病毒液(分別為 A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)、A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8)、B/human/Huber/1/2007)感染細(xì)胞，同時加入各濃度梯度藥物。細(xì)胞于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。結(jié)果顯示鹽酸芐達(dá)明能夠明顯抑制甲型流感病毒亞型H6N6株、甲型流感病毒亞型H7N8株和乙型流感病毒的復(fù)制，且均具有劑量依賴效應(yīng)。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0013]1.鹽酸芐達(dá)明是小分子化合物，其CC5tl (半數(shù)致死濃度)為84.5 μ Μ。鹽酸芐達(dá)明能夠劑量依賴的抑制流感病毒復(fù)制，其ICki (半數(shù)抑制濃度)為6.2 μ Μ。選擇指數(shù)(SI)約為13.6。而且鹽酸芐達(dá)明已經(jīng)在臨床上有數(shù)十年的應(yīng)用，安全性良好。這說明鹽酸芐達(dá)明是安全有效的抗流感病毒藥物。
[0014]2.鹽酸芐達(dá)明能夠劑量依賴的抑制甲型流感病毒亞型H6N6株、甲型流感病毒亞型H7N8株和乙型流感病毒的復(fù)制，具有非常廣譜的抗病毒活性。
[0015]3.利用現(xiàn)代常用藥物制劑手段，可將鹽酸芐達(dá)明作為活性成分制成片劑、膠囊、顆粒劑、口服液、緩釋制劑、控釋制劑、納米制劑或注射劑等任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為一種鹽酸芐達(dá)明細(xì)胞毒性檢測示意圖。
[0017]圖2為一種鹽酸芐達(dá)明處理流感病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)液上清中神經(jīng)氨酸酶活性示意圖。
[0018]圖3為一種鹽酸芐達(dá)明抗流感病毒活性廣譜性檢測示意圖，其中:
[0019]圖3A 為甲型流感病毒亞型 H6N6 株(A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6))；
[0020]圖3B 為甲型流感病毒亞型 H7N8 株(A/Duck/Hubei/216/1983 (H7N8))；
[0021]圖3C 為乙型流感病毒(B/human/Huber/1/2007)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了更好地闡述本發(fā)明的內(nèi)容，下面 申請人:將結(jié)合具體實(shí)施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明請求保護(hù)的范圍不局限于以下實(shí)施例。
[0023]目前，抗流感病毒藥物體外篩選模型分為細(xì)胞培養(yǎng)模型和病毒酶的無細(xì)胞系統(tǒng)篩選模型。酶反應(yīng)篩選模型具有高通量的特點(diǎn)，但篩選的化合物仍需進(jìn)行更多的細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和體內(nèi)毒性、藥效實(shí)驗(yàn)等以確定其效果。細(xì)胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點(diǎn)在于:可提供大量遺傳性狀相同的細(xì)胞為研究對象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機(jī)理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用MDCK細(xì)胞培養(yǎng)篩選法檢測鹽酸芐達(dá)明對流感病毒感染的影響，基于對上清中代表流感病毒復(fù)制水平的神經(jīng)氨酸酶表達(dá)水平的檢測，定量分析鹽酸芐達(dá)明的抗流感病毒活性。
[0024]實(shí)施例1:鹽酸芐達(dá)明抗流感病毒活性的評價
[0025]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0026]1.1細(xì)胞、病毒和藥物
[0027]MDCK細(xì)胞購自美國模式菌種保藏中心(ATCC);病毒株:A/PuertoRi co/8/34(HlNl);藥物:鹽酸芐達(dá)明(CAS =132-69-4)購于Sigma公司。
[0028]1.2實(shí)驗(yàn)儀器
[0029]多標(biāo)記微孔板讀取儀(Perkin Elmer)。
[0030]2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果
[0031]2.1細(xì)胞培養(yǎng):37°C，5%C02加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10% FBSU00U/mL的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞至90%匯合度后傳代，傳代比例1/3 - 1/4。
[0032]2.2病毒培養(yǎng):取9~11日齡SPF雞胚，接種病毒前用驗(yàn)蛋器檢查，并在遠(yuǎn)離胚胎的位置標(biāo)記，消毒并打孔后按0.2ml/枚接種24血凝效價的病毒液，用指甲油封口，置37°C恒溫箱孵育48h (接種24h后死亡的雞胚一般為操作不當(dāng)致死，棄之)。取出雞胚置4°C冷胚12h。75%酒精消毒雞胚氣室，無菌操作剪去氣室外殼，毛細(xì)吸管吸取雞胚尿囊液和羊水，3000rpm4°C離心30min，檢測血凝效價，200 μ I/管分裝并置_70°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0033]2.3鹽酸芐達(dá)明的細(xì)胞毒性檢測:MDCK細(xì)胞按8X103細(xì)胞/孔(體積100 μ I)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后備用；用細(xì)胞維持液(DMEM+2%血清)將藥物按照
0.8 μ M、1.6 μ Μ、3.125 μ Μ、6.25 μ Μ、12.5 μ Μ、25.0 μ Μ、50.0 μ M 和 100.0 μ M 共 8 個梯度濃度配制，每個梯度濃度設(shè)2個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后棄掉培養(yǎng)上清，于每孔中加入100 μ I含有10%Alamarblue試劑的新DMEM培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)lh，Ih后用微孔板讀取儀分別測量熒光強(qiáng)度和吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0034]結(jié)果顯示(圖1)鹽酸芐達(dá)明在50.0μ M范圍內(nèi)對MDCK細(xì)胞完全沒有細(xì)胞毒性，說明鹽酸芐達(dá)明有比較安全的適用范圍，即鹽酸芐達(dá)明的給藥劑量按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用量為
0.0 ~50.0 μ Mo
[0035]2.4鹽酸芐達(dá)明對流感病毒株A/PuertoRico/8/34 (HlNl)的抗病毒活性評價
[0036]2.4.1.實(shí)驗(yàn)原理:MUNANA (4-methylumbelliferyl- a -N-acetyl-neuraminate)是流感病毒 神經(jīng)氨酸酶的特異性底物，在神經(jīng)氨酸酶作用下產(chǎn)生的催化產(chǎn)物在355nm激發(fā)光照射下，可以產(chǎn)生460nm突光,突光強(qiáng)度的強(qiáng)弱代表了病毒神經(jīng)氨酸酶表達(dá)量的多少，反映了培養(yǎng)細(xì)胞上清中的病毒量。
[0037]2.4.2.將MDCK細(xì)胞按1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCID5q病毒液(100 μ I)和不同濃度藥物(100 μ I)于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以50.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度設(shè)置兩個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、陽性對照組(利巴韋林)、陰性對照組(病毒感染后無藥物處理)和實(shí)驗(yàn)藥物組。
[0038]2.4.3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES, ρΗ6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37 °C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014μΜ NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，微孔讀板儀上測定熒光值(激發(fā)光波長355nm,發(fā)射光波長465nm)。
[0039]2.4.4.計(jì)算各檢測孔中藥物對流感病毒復(fù)制的抑制率。
[0040]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對照)/ (酶活對照-空白對照)*100%
[0041]結(jié)果顯示:隨著鹽酸芐達(dá)明藥物濃度的增加，藥物對流感病毒復(fù)制的抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)很明顯的劑量依賴效果。其在6.2 μ M濃度能夠抑制50%的病毒復(fù)制，選擇指數(shù)為13.6，在50.0μ M濃度時達(dá)到接近100%抑制率。(見圖2)。
[0042]實(shí)施例2:鹽酸芐達(dá)明抗流感病毒作用廣譜性的評價
[0043]在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，本實(shí)施例進(jìn)一步檢測了鹽酸芐達(dá)明對甲型流感病毒亞型Η6Ν6株、甲型流感病毒亞型Η7Ν8株和乙型流感病毒的抗病毒活性。
[0044]1.實(shí)驗(yàn)使用病毒株包括:A/Duck/Hubei/5/2010(H6N6)、
[0045]A/Duck/Hubei/216/1983(H7N8)、B/human/Huber/1/2007
[0046]2.將MDCK細(xì)胞按1.5 X IO4細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~18h后，待細(xì)胞長成單層后備用。將孔板中培養(yǎng)基棄去，PBS清洗兩遍后，加入IOOTCId50病毒液(100 μ I)和不同濃度藥物(100 μ I)于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藥物以50.0 μ M為起始濃度，連續(xù)2倍梯度稀釋6個梯度，每梯度設(shè)置兩個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后取各實(shí)驗(yàn)孔上清進(jìn)行神經(jīng)氨酸酶活性檢測。
[0047]3.黑色 96 孔微量板中加入 40 μ I 緩沖液(32.5mmol/L MES, pH6.5,4mmol/LCaCl2)配制的底物20umol/L MUNANA，再加入各實(shí)驗(yàn)孔培養(yǎng)上清20 μ 1，37°C避光孵育60min，加入反應(yīng)終止液(0.014 μ M NaOH, 83%乙醇)100 μ I/孔，多功能檢測儀上測定熒光值(激發(fā)光波長355nm,發(fā)射光波長465nm)。
[0048]4.計(jì)算各檢測孔中神經(jīng)氨酸酶被抑制率。
[0049]抑制率(％) =100-(樣品孔-空白對照)/ (酶活對照-空白對照)*100%
[0050]結(jié)果顯示:鹽酸芐達(dá)明在藥物濃度范圍內(nèi)明顯抑制了各種流感病毒毒株的復(fù)制，并且均呈劑量依賴關(guān)系(見圖3)。其對甲型流感病毒H6N6、甲型流感病毒H7N8和乙型流感病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為27.9 μ M、8.2 μ M和10.3 μ Μ,對應(yīng)的選擇指數(shù)分別為3.0、10.3和8.2。表明鹽酸芐達(dá)明是一種廣譜的抗流感病毒藥物。
【權(quán)利要求】
1.鹽酸芐達(dá)明在制備治療或預(yù)防流感病毒感染藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的流感病毒為甲型流感病毒或乙型流感病毒。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物是以鹽酸芐達(dá)明或其各種鹽形式作為藥物活性成分。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為口服給藥劑型、注射給藥劑型、粘膜給藥劑型或經(jīng)皮給藥劑型。
5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為任何一種藥學(xué)上可接受的劑型。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液或注射液。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物為緩釋制劑、控釋制劑或納米制劑。
【文檔編號】A61P31/16GK103893171SQ201410159222
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月19日
【發(fā)明者】吳建國, 陳緒林, 鄔開朗, 劉映樂, 潭秋萍, 劉芳 申請人:武漢勝達(dá)康生物科技有限公司