絲素蛋白復(fù)合生物材料支架及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種絲素蛋白復(fù)合生物材料支架及其制備方法。所述的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架包括細(xì)菌纖維素和絲素蛋白，通過(guò)細(xì)菌纖維素中的羥基與絲素蛋白的羧基或者氨基發(fā)生聚合而相互交聯(lián)在一起。所述制備方法是在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加絲素蛋白，然后接種木醋桿菌培養(yǎng)，得到絲素蛋白/細(xì)菌纖維素復(fù)合生物材料支架。本發(fā)明所述的方法操作方法簡(jiǎn)便，減少了人的勞動(dòng)量，使用的設(shè)備減少，降低了生產(chǎn)成本。所得的復(fù)合生物材料支架具有特殊的生物學(xué)功能，在生物礦化等生物材料方面具有優(yōu)良的生物學(xué)性能。可用于吸血棉、人工皮膚、隱形面膜等組織工程領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】絲素蛋白復(fù)合生物材料支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種絲素蛋白復(fù)合生物材料支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人民生活水平的提高，美容產(chǎn)品在人們的生活中占據(jù)了越來(lái)越重要的位置。利用面膜保養(yǎng)面部皮膚的美容方式日益成為人們?nèi)粘Ｉ畹囊徊糠帧?br> [0003]現(xiàn)在的面膜所用材質(zhì)由單一走向多樣化，包括面貼式面膜、膏泥狀面膜、乳霜型面膜等。在面貼式面膜的材質(zhì)中主要采用無(wú)紡布面膜、蠶絲面膜和生物纖維面膜。
[0004]無(wú)紡布面膜的基質(zhì)材質(zhì)是特定或隨機(jī)的纖維組成的無(wú)紡布。無(wú)紡布面膜敷感比較舒適，但透氣性一般。而且當(dāng)精華液少時(shí)面膜邊緣會(huì)翹起來(lái)，不服帖，需要躺下才能發(fā)揮其最大作用。因此這類(lèi)材質(zhì)的面膜與肌膚的親和力較差，僅僅只是具有精華液載體的功能，不具備仿生物智能的功效。
[0005]蠶絲面膜的主要材料是活性蠶絲蛋白。蠶絲蛋白是纖維狀蛋白質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)與構(gòu)成皮膚的膠原纖維相似，可天然地增強(qiáng)皮膚的彈性，所含的氨基酸為大量細(xì)胞裂變?cè)鲋乘仨殻M(jìn)而加快皮膚代謝，防止皺紋天生，晉升緊致，令肌膚更加柔滑細(xì)膩。而蠶絲絲素蛋白富含多種氨基酸和表皮生長(zhǎng)因子，提供肌膚所需的養(yǎng)分，保持肌膚代謝，修復(fù)受損的細(xì)胞，使肌膚逐漸恢復(fù)健康白凈。 同時(shí)蠶絲面膜具有輕、軟、薄、透氣性好，吸水性強(qiáng)，服帖性好等特點(diǎn)。因此它比無(wú)紡布材質(zhì)的面膜好。但因?yàn)樾Q絲面膜比較薄，其承載的精華液的量不是很大，容易造成部分精華液留在面膜袋內(nèi)造成浪費(fèi)，或者因吸載過(guò)多，在敷面膜的過(guò)程中部分精華液從這類(lèi)面膜邊緣流出。天然蠶絲持水量低，觸感粗糙。
[0006]生物纖維面膜是由木醋桿菌自然發(fā)酵制成的纖維體。具有類(lèi)似皮膚的功能，能透氧隔離細(xì)菌，能使用于燒燙傷的披覆物。木醋桿菌(Acetobacter xylinum)屬于好氧革蘭氏陰性菌，是產(chǎn)纖維素能力最好的菌株，它在正常的代謝條件下，可以分泌出細(xì)菌纖維素。但這類(lèi)面膜不具有蠶絲的天然美容功效，需要額外添加更多的精華液。
[0007]目前出現(xiàn)了生物纖維素復(fù)合膜，該類(lèi)面膜通常采用如下制備方法:首先將保存在斜面培養(yǎng)基上的木醋桿菌制成搖瓶種子，通過(guò)靜態(tài)培養(yǎng)后獲得纖維素。再將培養(yǎng)好的纖維素分離純化，然后與天然多糖或蛋白質(zhì)等混合，制成生物纖維素復(fù)合膜?，F(xiàn)在制備復(fù)合膜是需要經(jīng)過(guò)兩步工藝，即先通過(guò)培養(yǎng)獲得纖維素膜，然后再將純化后的纖維素膜與蛋白質(zhì)等混合。這樣的兩步法使得生產(chǎn)工藝復(fù)雜，需要更多的機(jī)器設(shè)備和人力投入，產(chǎn)品成本高。另外在纖維素膜和蛋白質(zhì)的混合過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)混合不均勻的現(xiàn)象，所得復(fù)合膜中纖維素和蛋白質(zhì)并沒(méi)有有效地互相交織在一起，會(huì)出現(xiàn)纖維素主要集中在復(fù)合膜的一個(gè)區(qū)域，而蛋白主要集中在另一個(gè)區(qū)域，這就不能實(shí)現(xiàn)復(fù)合膜的功效。
[0008]現(xiàn)在也出現(xiàn)了具有生物學(xué)功能的人造復(fù)合生物材料來(lái)替代某些生物材料，例如人工皮膚、血管、角膜等，但現(xiàn)有的復(fù)合生物材料的使用效果都不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種絲素蛋白復(fù)合生物材料支架，包括細(xì)菌纖維素和絲素蛋白，所述的細(xì)菌纖維素和絲素蛋白通過(guò)細(xì)菌纖維素中的羥基與絲素蛋白的羧基或者氨基發(fā)生聚合而相互交聯(lián)在一起。
[0010]進(jìn)一步地，所述的細(xì)菌纖維素來(lái)自以下所列菌之一或它們的混合菌:木醋桿菌、葡糖酸醋桿菌屬、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、固氮菌屬、氣桿菌屬或產(chǎn)堿菌屬。
[0011]進(jìn)一步地，絲素蛋白占復(fù)合材料的50%(w/w)以上。
[0012]本發(fā)明還提供了一種絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的制備方法，包括:將能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的菌接種在含有絲素蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中，共同培養(yǎng)后獲得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。
[0013]進(jìn)一步地，發(fā)酵培養(yǎng)基以500ml計(jì)，包含選自以下之一:含4g_8g絲素蛋白的透析溶液，或經(jīng)噴霧干燥獲得的絲素蛋白粉末顆粒，或者絲素凝膠干燥后物理粉碎的粉末。
[0014]進(jìn)一步地，所述的絲素蛋白的制備方法包括取一定量的蠶繭，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小時(shí)，脫膠絲，重復(fù)上述操作一次，脫膠絲風(fēng)干即得絲素蛋白纖維，然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩爾比)的溶液中溶解，80°C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解，絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得的絲素蛋白在制備發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)采用高溫滅菌的方式。
[0015]進(jìn)一步地，所述的絲素蛋白的制備方法包括取一定量的蠶繭，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，1OO0C，30分鐘，然后60V水冼6次脫去絲膠，脫膠絲風(fēng)干即得絲素蛋白纖維，然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇冰=2:1:8 (摩爾比)的溶液中溶解，65°C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解，絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得的絲素蛋白在制備發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)采用輻射滅菌的方式。
[0016]進(jìn)一步地,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基選自以下之一:(I)按500ml計(jì)算,30.0g-60.0g的蔗糖，5.0g-l0.0g 的蛋白胨，0.5g-2.0g 的檸檬酸，0.5g-2.0g 的 Na2HPO4.12H20,1.0g-2.5g的KH2PO4,0.05g-l.5g的MgSO4.7H20和絲素蛋白，其中所述的絲素蛋白選自絲素蛋白的透析溶液或經(jīng)噴霧干燥獲得的絲素蛋白粉末顆粒4g-8g的絲素蛋白，其余為去離子水；或(2)按 500ml 計(jì)算,5.0g-13.0g 的果糖，1.0g-4.0g 的蛋白胨,0.lg-0.4g 的朽1 檬酸,0.lg-0.4g的 Na2HPO4.12H20,0.5g-0.8g 的 KH2PO4,0, lg-0.5g 的 MgSO4.7H20,4g_8g 的絲素蛋白，其余為去離子水；或(3)按500ml計(jì)算，20g-30g的葡萄糖，2g_5g的蛋白胨,0.2g-0.6g的梓檬酸，0.2g-0.6g 的 Na2HPO4.12H20，1.0g-1.8g 的 KH2PO4,0.5g-0.8g 的 MgSO4.7H20，4g_8g 的絲素蛋白，其余為去離子水。
[0017]進(jìn)一步地，在將木醋桿菌接種到含有絲素蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)前，先將木醋桿菌接種在斜面培養(yǎng)基中活化，取活化后的菌種接種于種子培養(yǎng)基中。
[0018]進(jìn)一步地，純化絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的步驟包括:取出培養(yǎng)所得的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架，去除膜表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，濾出水分后在蒸餾水中浸泡兩天，濾干蒸懼水浸泡過(guò)的復(fù)合生物材料支架的外周水分后移至足夠體積的0.1至4% (g/ml)NaOH溶液中，于60°C水浴中加熱I小時(shí)，水浴后將復(fù)合生物材料支架取出濾水后再次用蒸餾水浸泡清洗泡兩天，清洗后的復(fù)合生物材料支架中加入蒸餾水，并滴入2至3滴1%的醋酸溶液，復(fù)合生物材料支架再用蒸餾水清洗3-4次，獲得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。[0019]制備方法進(jìn)一步地包括以下步驟:
[0020]( 1)將木醋桿菌于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化，取活化后的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，放置在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得種子；
[0021](2)將步驟(1)培養(yǎng)所得的種子和液體培養(yǎng)基放入發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，然后在28-30°C下靜置培養(yǎng)7至15天，獲得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架初產(chǎn)物；
[0022](3)純化步驟(2)中的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架初產(chǎn)物的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。
[0023]優(yōu)選地，在發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先放入組織支架模型，使得在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，絲素蛋白復(fù)合生物材料就會(huì)附著在這些模型上。
[0024]進(jìn)一步地，所述的組織支架模型形狀為血管或角膜的形狀。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明是將能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的菌(例如木醋桿菌)添加在含有絲素蛋白培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)的，因此在培養(yǎng)木醋桿菌的過(guò)程中細(xì)胞分泌細(xì)菌纖維素與絲素蛋白發(fā)生原位聚合就形成復(fù)合生物材料支架。因此利用本發(fā)明制備絲素蛋白復(fù)合生物材料支架與現(xiàn)有方法制造的復(fù)合膜相比，本發(fā)明所述的方法操作方法簡(jiǎn)便，減少了人的勞動(dòng)量，使用的設(shè)備減少，生產(chǎn)成本降低。在培養(yǎng)基中添加絲素蛋白，使木醋桿菌與培養(yǎng)基中的絲素蛋白一起培養(yǎng)，木醋桿菌分泌的細(xì)菌纖維素纖維與天然的絲素蛋白通過(guò)化學(xué)反應(yīng)相互交聯(lián)在一起。所得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的含水量高，并且復(fù)合物是糖和蛋白的聚合物，因此具有特殊的生物功能，在生物礦化功能方面具有優(yōu)良的生物學(xué)性能。所得的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架是一種很好的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架，在組織工程方面的具有廣闊的應(yīng)用前景，比如做為吸血棉、人工皮膚等組織工程材料支架、隱形面膜材料等。本發(fā)明制備得到的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架是一種凝膠狀，其光滑，觸感好。本發(fā)明還根據(jù)不同的絲素蛋白制備工藝，在配制培養(yǎng)基時(shí)采用了不同的滅菌方式，保證了在培養(yǎng)過(guò)程中絲素蛋白和新生長(zhǎng)出來(lái)的木醋桿菌的菌絲體有更多的接觸面積，有效的通過(guò)化學(xué)反應(yīng)相互交織在一起，形成牢固的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1是實(shí)施例3所的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的電鏡圖。
[0027]圖2是實(shí)施例4所的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的電鏡圖。
[0028]圖3是實(shí)施例5所的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的電鏡圖。
[0029]圖4是實(shí)施例8所的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的電鏡圖。
[0030]圖5是實(shí)施例11所的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的電鏡圖。
[0031]圖6是在含有絲素蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中的pH變化曲線(xiàn)圖。
[0032]圖7各種類(lèi)型材料的紅外圖譜。
[0033]圖8是圖7在紅外波數(shù)800至1500的放大圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0035]實(shí)施例1制備絲素蛋白
[0036]方法一:取一定量的蠶繭，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小時(shí)，脫膠絲，即得絲素蛋白纖維。然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩爾比)的溶液中溶解，80°C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解。絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得含有絲素蛋白的透析溶液。
[0037]方法二:取一定量的蠶繭，在5%(g/ml)的NaCO3溶液中，100°C，30分鐘，然后60°C水洗6次，烘干脫膠絲，即得絲素蛋白纖維。然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩爾比)的溶液中溶解，65°C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解。絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得含有絲素蛋白的透析溶液。
[0038]所述的透析方法可以采用本實(shí)施例的方法，也可以采用其他的透析方法。本實(shí)施例所述的透析方法包括將絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中，放在4 V的去離子水中透析3天，且每天更換一次去離子水。透析結(jié)束后用兩層紗布過(guò)濾，所得濾液在6000r/min的條件下離心15min，取上清獲得絲素蛋白溶液，從而獲得含有絲素蛋白的透析溶液。
[0039]透析后所得絲素蛋白溶液稀釋至一定濃度后，通過(guò)噴霧干燥的方法獲得絲素蛋白顆粒。實(shí)施例2培養(yǎng)基的配制
[0040]a)斜面培養(yǎng)基，按配置100mL計(jì)，包括:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種絲素蛋白復(fù)合生物材料支架，包括細(xì)菌纖維素和絲素蛋白，其特征在于，所述的細(xì)菌纖維素和絲素蛋白通過(guò)細(xì)菌纖維素中的羥基與絲素蛋白的羧基或者氨基發(fā)生聚合而相互交聯(lián)在一起。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絲素蛋白復(fù)合生物支架，其特征在于，所述的細(xì)菌纖維素來(lái)自以下所列菌之一或它們的混合菌:木醋桿菌、葡糖酸醋桿菌屬、根瘤菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、無(wú)色桿菌屬、固氮菌屬、氣桿菌屬或產(chǎn)堿菌屬。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絲素蛋白復(fù)合生物支架，其特征在于，絲素蛋白占復(fù)合生物支架的50%(w/w)以上。
4.絲素蛋白復(fù)合生物材料支架的制備方法，包括:將能產(chǎn)生細(xì)菌纖維素的菌接種在含有絲素蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基中，共同培養(yǎng)后獲得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基以500ml計(jì)，包含選自以下之一:含4g-8g絲素蛋白的透析溶液、或經(jīng)噴霧干燥獲得的絲素蛋白粉末顆?；蛘呓z素凝膠干燥后物理粉碎的粉末。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的絲素蛋白的制備方法包括取一定量的蠶繭，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，沸水I小時(shí)，脫膠絲，重復(fù)上述操作一次，風(fēng)干即得絲素蛋白纖維，然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩爾比)的溶液中溶解，80°C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解，絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得的絲素蛋白在制備發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)采用高溫滅菌的方式。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的絲素蛋白的制備方法包括取一定量的蠶繭，在0.5% (g/ml)的NaCO3溶液中，100°C，30分鐘，然后60V水洗6次脫去絲膠，脫膠絲風(fēng)干即得絲素蛋白纖維，然后將絲素蛋白纖維在CaCl2:乙醇:水=2:1:8 (摩爾t匕)的溶液中溶解，65 °C水浴I小時(shí)，使絲素蛋白纖維完全溶解，絲素蛋白纖維溶解后裝入透析袋中透析，獲得的絲素蛋白在制備發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)采用輻射滅菌的方式。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基選自以下之一:(1)按 500ml 計(jì)算,30.0g-60.0g 的鹿糖,5.0g-l0.0g 的蛋白胨,0.5g-2.0g 的朽1 檬酸，0.5g-2.0g 的 Na2HPO4.12H20，1.0g-2.5g 的 KH2PO4,0.05g-l.5g 的MgS04*7H20和絲素蛋白，其中所述的絲素蛋白選自絲素蛋白的透析溶液或經(jīng)噴霧干燥獲得的絲素蛋白粉末顆粒4g-8g的絲素蛋白，其余為去離子水；或(2)按500ml計(jì)算,5.0g-13.0g的果糖，1.0g-4.0g的蛋白胨,0.lg-0.4g 的檸檬酸，0.lg-0.4g 的 Na2HP04*12H20，0.5g-0.8g 的KH2PO4,0, lg-0.5g 的MgSO4*7H20,4g-8g的絲素蛋白，其余為去離子水；或(3)按500ml計(jì)算，20g_30g的葡萄糖，2g-5g 的蛋白胨，0.2g-0.6g 的檸檬酸，0.2g-0.6g 的 Na2HPO4*12H20，1.0g-1.8g 的 KH2PO4,0.5g-0.8g的MgSO4*7H20，4g-8g的絲素蛋白，其余為去離子水。
9.根據(jù)權(quán)利要求4至8之一所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 將木醋桿菌于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行活化，取活化后的菌種接種于種子培養(yǎng)基中，放置在搖床上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得種子； 將步驟(1)培養(yǎng)所得的種子和液體培養(yǎng)基放入發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，然后在28-30°C下靜置培養(yǎng)7至15天，獲得絲素蛋白復(fù)合生物材料支架初產(chǎn)物； 純化步驟(2 )中的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架初產(chǎn)物的絲素蛋白復(fù)合生物材料支架。
10.根據(jù)權(quán)利要求4至8之一所述的制備方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先放入組織支架模型，使得在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，絲素蛋白復(fù)合生物材料就會(huì)附著在這些模型上。
【文檔編號(hào)】A61L27/20GK103893820SQ201410114764
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】朱正華, 董悅涵 申請(qǐng)人:浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院