金蟬花活性部位及其在制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及金蟬花活性部位及其在制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物中的應(yīng)用。該活性部位為金蟬花水提物的正丁醇部位；按照下述方法獲得：金蟬花粉碎后用水回流提取，提取液減壓濃縮后加無水乙醇，過夜沉淀；離心、濃縮；濃縮液用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分級萃取，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位；其中正丁醇部位可明顯抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞的衰老損傷，阻止細胞LDH釋放，提高細胞的存活率，能降低細胞內(nèi)的氧自由基水平，提高谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，并且在清除DPPH·和超氧陰離子(O2·-)自由基實驗中表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性。
【專利說明】金蟬花活性部位及其在制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及從中藥材金蟬花中制備具有神經(jīng)保護和抗衰老活性的部位及在制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國人口老齡化加劇，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率日益增高，衰老與神經(jīng)退行性疾病的研究已成為神經(jīng)科學(xué)的熱點。人體的衰老，往往會導(dǎo)致加快神經(jīng)細胞數(shù)目的減少，從而產(chǎn)生一些以阿爾茨海默病(Alzheimer’ s Disease，AD)為代表的神經(jīng)退行性疾病。目前，神經(jīng)退行性疾病，病因不明，而且尚無有效的治療措施，僅有少數(shù)幾個藥物可用于治療神經(jīng)退行性疾病。
[0003]金蝶花為麥角菌科真菌大蝶草(Cordyceps cicadae Shing)及其寄主山蝶(Cicada flammata Dist)若蟲形成的干燥復(fù)合體,其性味甘寒,與冬蟲夏草的無性型同屬，功效相近。甄權(quán)所著《藥性論》云:“其蛻殼，頭上有一角，如冠狀，謂之蟬花，最佳。味甘寒，無毒。主小兒天吊,驚癇瘈,夜啼心悸。《證類本草》蟬花能解痙、散風(fēng)熱”?！侗静輬D經(jīng)》曾有記載:“今蜀中有一種蟬，其蛻殼上有一角，如花冠狀，謂之蟬花。西人有赍至都下者，醫(yī)工云，入藥最奇”?！侗静菥V目》中亦記載:“蟬花可治療驚癇，夜啼心悸，功同蟬蛻”。現(xiàn)代藥理研究表明，金蟬花為傳統(tǒng)的補益中藥，具有明顯的抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、改善腎功能、抗腫瘤等藥理活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，金蟬花中主要含有多糖、腺苷、蟲草酸、氨基酸、多球殼菌素、麥角甾醇等多種化學(xué)成分。
[0004]蟬花水煎劑能明顯延長實驗小鼠的游泳時間，明顯提高常壓缺氧狀態(tài)下的存活時間及在高溫下的存活時間，`表明蟬花水煎劑有抗應(yīng)激、抗疲勞的作用；機體處在不良環(huán)境下，蟬花水煎劑能促進內(nèi)環(huán)境保持相對穩(wěn)定，從而增強了機體對有害刺激的抵抗力。蟬花水煎劑高劑量組對雄性果蠅能顯著地延長壽命，表明其有一定的抗衰老作用(王硯，等.蟬花藥理作用的初步探討[J].浙江中醫(yī)雜志，2001，36(5):219-220)。
[0005]鑒于蟬花和名貴中藥冬蟲夏草的無性型同屬真菌(蟲草屬)，且蟬擬青霉有免疫等多種藥理作用，并具有毒性小、易培養(yǎng)等優(yōu)點，有希望作為冬蟲夏草的代用品，但對其相應(yīng)的活性功能成分尚未十分明確，大多的藥理實驗僅停留在原藥材或粗提物的基礎(chǔ)上，尚無金蟬花提取物進一步精制至活性部位并用于制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物的報道。
[0006]為了測試和評估本發(fā)明金蟬花活性部位的神經(jīng)保護和抗衰老方面的應(yīng)用潛力，已使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法測試藥材各部位的生物活性。這些已知的測試方法包括谷氨酸損傷神經(jīng)細胞PCl2衰老模型，抗氧化模型等。結(jié)果表明選定的金蟬花水提物的正丁醇活性部位具有較好的神經(jīng)保護和抗衰老的活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供金蟬花具有神經(jīng)保護和抗衰老活性應(yīng)用潛力的有效部位。[0008]金蟬花提取物的各部位經(jīng)過反復(fù)多次的神經(jīng)保護和抗衰老活性篩選，確認金蟬花水提物的正丁醇萃取部位具有可明顯抑制谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞的衰老損傷，阻止細胞LDH釋放，提高細胞的存活率，能降低細胞內(nèi)的氧自由基水平，提高谷胱甘肽還原酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，顯示出良好的神經(jīng)保護和抗衰老活性，并且在清除DPPH.和超氧陰離子(02‘_)自由基實驗中表現(xiàn)出較好的體外抗氧化活性，表明金蟬花的正丁醇萃取部位具有良好的抗氧化作用，具有抗衰老的潛力。
[0009]因此，本發(fā)明的第一個方面涉及提供金蟬花水提物的正丁醇萃取部位及其制備方法:金蟬花水提物的正丁醇萃取部位制備方法，按照下述步驟進行:干燥金蟬花藥材，粉碎過藥典2號篩，粉末在90°C下用水回流提取兩次，每次2小時，提取液減壓濃縮后，加無水乙醇,4?一 25?下過夜沉淀；3000r/min離心10 — 30min ;濃縮上清液至原體積的1/40 —1/10 ;將濃縮液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用0.5~1.5倍石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分級萃取，共萃取3~5次，合并，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位(JCHrfura)，水部位。
[0010]本發(fā)明第二個方面涉及對所述金蟬花水提物的正丁醇萃取部位用于制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物的用途。
[0011]為了檢測本發(fā)明所得的神經(jīng)保護和抗衰老活性組分的性能，將本發(fā)明所得的神經(jīng)保護和抗衰老活性組分按照配制成50~200 μ g/ml藥液，用于大鼠腎上腺嗜鉻細胞的PC12細胞處理，分別觀察樣品在不同劑量下對谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞衰老的保護作用。結(jié)果表明金蟬花水提物的正丁醇萃取部位具有顯著的神經(jīng)保護和抗衰老活性，可用于制備治療神經(jīng)退行性疾病等疾病的輔助藥物；同時在體外模型中具有顯著的抗氧化活性，表明金蟬花活性部位在制備抗衰老藥物方面 具有良好的潛力。
[0012]本發(fā)明第三個方面涉及提供金蟬花活性部位與藥學(xué)上可接受的輔料組成的藥物組合物。
[0013]金蟬花活性部位可單獨或幾種部位組合，再進一步與輔料組合，劑型包括:片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、混懸劑、滴丸、口服液體制劑等。
[0014]本發(fā)明所述的載體或賦形劑包括藥劑學(xué)常規(guī)應(yīng)用的載體和賦形劑，例如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑等。
[0015]下面的實施例和藥理活性實驗是對本發(fā)明的進一步詳細說明，以下所列舉的實施例不以任何方式構(gòu)成限制。
【具體實施方式】
[0016]實施例1金蟬花水提物的正丁醇萃取部位(JCHn_Buffl)的制備:
[0017]取粉碎過藥典2號篩干燥金蟬花粉末80g，在90°C下，用800mL水回流提取兩次，每次2小時，提取液減壓濃縮后，加4倍體積的無水乙醇，置4°C冰箱過夜沉淀；3000r/min離心15min ;濃縮上清液，將濃縮液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用等體積的石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分級萃取，共萃取3次，合并，減壓濃縮回收溶劑，分別得到石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位(JCHn__)，水部位；冷凍干燥得JCHn__l.92g。
[0018]實施例2JCHn_Buffl對谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細胞衰老的保護作用
[0019](I)MTT法、LDH法測定細胞活力:[0020]取對數(shù)生長期PC12細胞(由江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供)，以2 X IO4/孔接種于96孔培養(yǎng)板，200μ 1/L。在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)過夜后，將細胞分為對照組、模型組、藥物處理組。即對照組(不含Glu的完全培養(yǎng)基)；模型組(完全培養(yǎng)基+Glu);藥物處理組(完全培養(yǎng)基 +JCHn_Bura+Glu，濃度分別為 200 μ g/mL、100 μ g/mL、50 μ g/mL，用培養(yǎng)液稀釋。)JCHn__預(yù)處理Ih后加Glu孵育24h每組設(shè)4個平行孔。培養(yǎng)24h后，每孔加5g/L MTT20 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，小心吸取孔內(nèi)上清液，做LDH實驗。每孔加入DMSO 150 μ L，使結(jié)晶充分溶解，用酶聯(lián)免疫儀在波長570nm處讀取吸光度(OD)。取4孔OD值的均數(shù)按公式計算細胞存活率結(jié)果見表1。細胞存活率％=實驗組OD/對照組OD X 100%。數(shù)據(jù)表明，JCHn_BuQH具有保護Glu誘導(dǎo)PC12細胞的損傷作用。
[0021]收集培養(yǎng)液，按試劑盒說明書測定乳酸脫氫酶(LDH)(購買于南京建成生物工程研究所)的活性結(jié)果見表2。LDH的釋放抑制率按下式計算:LDH抑制率(%)= (LDHtsaa-LDH^藥組)/ (LDH模型組-LDH正常組)X 100%。數(shù)據(jù)表明，JCHn_BuQH能夠抑制Glu誘導(dǎo)PC12細胞LDH釋放。
[0022]表1MTT測定JCHn-Buffl對Glu誘導(dǎo)PC12細胞生存率的影響, η = 4)
[0023]
【權(quán)利要求】
1.一種金蟬花活性部位，具有神經(jīng)保護和抗衰老活性，為金蟬花水提物的正丁醇萃取有效部位；其特征在于所述金蟬花水提物的正丁醇萃取有效部位按照下述方法獲得:干燥金蟬花藥材，粉碎過藥典2號篩，粉末在90°C下用水回流提取兩次，每次2小時，提取液減壓濃縮后，加無水乙醇，4?一 25?下過夜沉淀；3000r/min離心10 — 30min ；濃縮上清液至原體積的1/40 — 1/10 ;將濃縮液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用0.5^1.5倍石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分級萃取，共萃取3飛次，合并，減壓濃縮回收溶劑，冷凍干燥分別得到石油醚部位，乙酸乙酯部位，正丁醇部位，水部位；其中正丁醇部位即為金蟬花水提物的正丁醇萃取有效部位。
2.權(quán)利要求1所述金蟬花活性部位在制備神經(jīng)保護和抗衰老藥物中的用途。
3.—種以金蟬花制備的神經(jīng)保護和抗衰老藥物，其特征在于該藥物含有治療有效量的權(quán)利要求1所述的金蟬花活性部位。
4.一種藥物制劑，其特征在于含有有效劑量的權(quán)利要求1金蟬花活性部位和一種或多種藥學(xué)上可接受的藥 物賦形劑，或可與金蟬花活性部位組方的其他藥物。
【文檔編號】A61P25/00GK103800384SQ201410046280
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年2月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月10日
【發(fā)明者】歐陽臻, 張魏琬麒, 趙明, 王吉標, 尚磊, 王璠, 汪愿 申請人:江蘇大學(xué)