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Th1細(xì)胞亞群的制備方法及其在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):1296953閱讀:247來源:國(guó)知局
Th1細(xì)胞亞群的制備方法及其在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群和Th1細(xì)胞亞群的制備試劑盒和制備方法,以及利用上述方法制得的Th1細(xì)胞亞群在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用,屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用CD4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培養(yǎng)瓶皿制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群,采用兩種細(xì)胞因子組合制備Th1細(xì)胞亞群。利用本發(fā)明提供的試劑盒和方法,能在單個(gè)核細(xì)胞中獲得更高比例的CD4+T細(xì)胞,獲得的Th1細(xì)胞亞群具有很強(qiáng)的免疫活性,能大量分泌細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素、IFN-γ和TNF-α,具有顯著的抗腫瘤活性。
【專利說明】Thi細(xì)胞亞群的制備方法及其在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】,具體地,涉及一種Thl細(xì)胞亞群的制備方法及其在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2008年,全球因惡性腫瘤而死亡的人數(shù)達(dá)760萬(約占所有死亡人數(shù)的13% ),預(yù)計(jì)2030年全球因惡性腫瘤而死亡的人數(shù)將超過1310萬。數(shù)據(jù)顯示,全世界20%的新發(fā)惡性腫瘤病人在中國(guó),24%的惡性腫瘤死亡病人在中國(guó)。盡管近年來手術(shù)、放療、化療以及其他治療技術(shù)來不斷發(fā)展,但是惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或者耐藥等問題一直沒有得到根本解決。隨著腫瘤學(xué)和免疫學(xué)的不斷進(jìn)步,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)理研究的不斷加深,腫瘤的免疫治療越來越受到各國(guó)醫(yī)學(xué)界的重視。單克隆抗體藥物、DC疫苗藥物、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制藥物等新型抗腫瘤藥物不斷涌現(xiàn),自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)在腫瘤的綜合治療中也逐漸發(fā)揮著作用,并取得了矚目的成績(jī)。
[0003]自體免疫細(xì)胞治療技術(shù)分為特異性免疫細(xì)胞治療,如樹突狀細(xì)胞(DC)、腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞(TIL)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)等;和非特異性免疫細(xì)胞治療,如細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)等。研究表明,在國(guó)內(nèi)進(jìn)行的24項(xiàng)涉及腫瘤CIK治療的臨床研究中,總體有效率達(dá)到51.7%。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)的Rosenberg應(yīng)用TIL細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤,獲得了 58%的客觀有效率。2010年4月,美國(guó)食品與藥品監(jiān)督局(FDA)正式批準(zhǔn)了首個(gè)用于治療惡性腫瘤的DC疫苗-Pixwenge,該疫苗治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者,延長(zhǎng)中位生存期約4.1個(gè)月,提高3年生存率約8.7 %。這些自體免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用,極大的改善了惡性腫瘤患者生存質(zhì)量,延長(zhǎng)了生存期。
[0004]Provenge是用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)組成的融合蛋白負(fù)載惡性腫瘤患者自體富集的血液DC細(xì)胞制備而成。該疫苗不僅可以通過MHCI限制性方式將腫瘤抗原信息傳遞給CTL,還可以通過MHC II限制性方式將腫瘤抗原信息傳遞給Thl細(xì)胞。Thl細(xì)胞可通過Fas / FasL機(jī)制直接殺傷腫瘤細(xì)胞,還可通過釋放IFN- Y等細(xì)胞因子,改善腫瘤微環(huán)境,下調(diào)Treg細(xì)胞表達(dá),進(jìn)一步刺激CTL,促進(jìn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷反應(yīng)。Thl細(xì)胞在腫瘤的免疫治療,尤其是腫瘤DC疫苗治療中的作用,越來越得到重視。
[0005]T輔助細(xì)胞(Th)以細(xì)胞表面標(biāo)記⑶3、⑶4+和TCRa β為特征,即⑶4+Τ細(xì)胞。據(jù)其分泌的細(xì)胞因子的不同可分為ThO、Thl、Th2和Th3四個(gè)亞型。Thl、Th2和Th3細(xì)胞均由前體細(xì)胞ThO分化而來。未接觸抗原的T細(xì)胞被稱為Th細(xì)胞前體(Th cell precursor),他們通過接觸天然免疫細(xì)胞攝取的抗原而分化成一種不確定的狀態(tài),稱為ThO細(xì)胞。ThO細(xì)胞既分泌Thl型細(xì)胞因子IL-2和IFN-Y,又分泌Th2型細(xì)胞因子IL-4,可在不同信號(hào)的刺激下分化為Thl或Th2細(xì) 胞。Thl和Th2細(xì)胞除分泌不同的細(xì)胞因子,發(fā)揮不同的免疫作用外,他們各自細(xì)胞的表面受體也有許多的不同。IL-12、IFN- Y , IL-2等I型細(xì)胞因子促使ThO向Thl分化,并抑制Th2細(xì)胞分化;而IL-4、IL-10、IL_5、IL-6等II型細(xì)胞因子則促使ThO向Th2分化,同時(shí)也抑制Thl細(xì)胞增殖。TGF-β亦能抑制Thl細(xì)胞的分化生長(zhǎng)。
[0006]Thl細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫且對(duì)于免疫介導(dǎo)的腫瘤根除極為關(guān)鍵;而Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫。研究表明,細(xì)胞因子作用于細(xì)胞表面受體,可引起Th細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(STF)活化,從而發(fā)揮其對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用,這一過程主要與JAK / STAT家族有關(guān)。如JAK2 / STAT4被IL-12選擇性激活,從而啟動(dòng)Thl型細(xì)胞因子IFN- Y的表達(dá);IL_4選擇性激活JAKl / STAT6,使ThO向Th2方向極化。另一個(gè)調(diào)節(jié)Thl細(xì)胞分化的細(xì)胞因子是IFN- Y。IFN- Y除了作為Thl效應(yīng)細(xì)胞的標(biāo)志外,它本身在維持Thl表型穩(wěn)定性方面也有重要作用。分化的Thl細(xì)胞正常情況下不能轉(zhuǎn)型而產(chǎn)生Th2型細(xì)胞因子,而IFN-Y缺陷鼠的Thl細(xì)胞在Th2極化條件下仍保持產(chǎn)生IL-4的能力。最近的研究提供了 IFN-Y的作用機(jī)制=IFN-Y誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá),而后者反過來誘導(dǎo)IFN-Y位點(diǎn)DNasel表達(dá),使IFN-Y等位基因染色體重組進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)FN-Y基因,形成一個(gè)正反饋環(huán)路。IL-18與IL-12有協(xié)同作用,部分是因?yàn)樵黾覫L-12對(duì)Thl分化的效能,部分是通過增加已分化的Thl細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-12和IL-18聯(lián)合缺失鼠與缺失二者之一的鼠相比有著更為嚴(yán)重的IFN- Y缺乏。有資料表明,IL-12能通過STAT4信號(hào)傳導(dǎo)通路,增強(qiáng)Thl細(xì)胞的增殖和活化。美國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn),IL-7和IL-15可通過介導(dǎo)TCR的敏感性,促進(jìn)Thl細(xì)胞的增殖與活化。這些研究,為本發(fā)明提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
[0007]惡性腫瘤患者的腫瘤微環(huán)境錯(cuò)綜復(fù)雜,比如腫瘤局部高表達(dá)IL-10、TGF-β、VEGF、IL-6等免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子,或者通過STAT3信號(hào)傳導(dǎo)通路激活Treg細(xì)胞,或者通過MDSC的免疫抑制作用, 嚴(yán)重干擾體內(nèi)免疫細(xì)胞治療的臨床療效,甚至導(dǎo)致治療失效。體外培養(yǎng)的效應(yīng)性淋巴細(xì)胞,如CIK、NK、CTL、TIL、DC等細(xì)胞,能克服體內(nèi)種種不利因素,提高其增殖能力和殺傷能力、或提高其抗原遞呈功能等。但是這些細(xì)胞亞群中的Thl細(xì)胞的含量均很低,Thl細(xì)胞并未發(fā)揮應(yīng)有的臨床效果。
[0008]盡管Thl細(xì)胞在腫瘤的免疫治療中起著重要的作用,但是對(duì)于Thl的制備,國(guó)內(nèi)外相關(guān)的研究并不多。國(guó)內(nèi)有學(xué)者利用胸腺5肽等免疫調(diào)節(jié)劑輸入人體,可增加外周血中Thl / Th2的比值。國(guó)外Thl樣細(xì)胞的制備,主要是提取外周血單個(gè)核細(xì)胞,然后利用免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)對(duì)⑶4+細(xì)胞進(jìn)行陽性篩選后,利用⑶3 /⑶28ClinEx Vivo DynalBeads (—種CD3、CD28單克隆抗體結(jié)合的免疫磁珠)進(jìn)行Thl細(xì)胞培養(yǎng),所得的Thl細(xì)胞百分比高,并且能分泌顆粒酶B和穿孔素等對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷。然而,這種培養(yǎng)方案所用來進(jìn)行CD4+細(xì)胞篩選的免疫磁珠細(xì)胞分選操作步驟繁瑣,增加了培養(yǎng)過程中污染的可能性;免疫磁珠雖然可以自動(dòng)分解,卻不可避免的會(huì)有部分免疫磁珠進(jìn)入人體,有激發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)的可能。另外,利用⑶3 /⑶28ClinEx Vivo Dynal Beads進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),Thl占細(xì)胞總數(shù)的百分比很高,CTL數(shù)目卻非常少,Thl細(xì)胞的直接殺傷腫瘤細(xì)胞能力要低于CTL細(xì)胞,Thl的促CTL特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的能力也得不到充分利用。而且免疫磁珠產(chǎn)品費(fèi)用昂貴,會(huì)極大的阻礙Thl細(xì)胞臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為解決上述問題,本發(fā)明提出了一種用于制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的試劑盒和以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法,用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的試劑盒和用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法,以及制備得到的Thl細(xì)胞亞群在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明涉及一種用于制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的試劑盒,所述的試劑盒含有如下成分:
[0011]⑶4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培養(yǎng)瓶皿。
[0012]其中,
[0013]所述的⑶4單克隆抗體為含⑶4單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液;
[0014]所述的0)4單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
[0015]本發(fā)明還涉及一種以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法,所述的方法包括如下步驟:
[0016](I)用⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿;所述的培養(yǎng)瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成;
[0017](2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個(gè)核細(xì)胞;
[0018](3)用培養(yǎng)基將步驟⑵獲得的單個(gè)核細(xì)胞吹打混勻,按2~5X IO6 / mL的濃度種植于步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養(yǎng)瓶皿中,5% C02、37°C條件下孵育2~6個(gè)小時(shí),即獲得以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群。
[0019]其中,
[0020]步驟(1)中,所述的用⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿的方法為:將含1-10 μ g / mL的CD4單克隆抗體的包被液,加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培養(yǎng)瓶皿中,將培養(yǎng)瓶皿用錫箔紙包住以避光,平放,4°C孵育過夜;
[0021]步驟(2)中,所述的外周血為采自正常人或腫瘤患者的外周血,或者臍帶血,正常人或者腫瘤患者骨髓;
[0022]步驟(3)中,所述的培養(yǎng)基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
[0023]本發(fā)明還涉及一種用于將以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的試劑盒,所述的試劑盒含有如下成分:
[0024]I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb以及如下任意一種細(xì)胞因子
組合:
[0025]第I種細(xì)胞因子組合:
[0026]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ;
[0027]第2種細(xì)胞因子組合:
[0028]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2。
[0029]本發(fā)明還涉及一種用于將以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法,所述的方法包括如下步驟:
[0030](I)用含有I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb的包被液包被培
養(yǎng)瓶皿,4°C避光孵育過夜;
[0031](2)將以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群用含500~3000U / mL IFN- Y的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成I~5X IO6 / mL的細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)入步驟⑴中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養(yǎng)瓶皿中,5% C02、37°C條件下孵育過夜,得到以激活的⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群;
[0032](3)收集步驟⑵中獲得的以激活的CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群,使用含有下述任一種細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)成I~3X IO6 / mL的細(xì)胞懸液,種植到培養(yǎng)瓶皿中:
[0033]第I種細(xì)胞因子組合如下:
[0034]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ;
[0035]第2種細(xì)胞因子組合如下:
[0036]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ;
[0037]每2~3天,加入和之前使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基,維持細(xì)胞密度在I~
2X IO6 / mL ;第14天即得到所述的Thl細(xì)胞亞群。
[0038]其中,
[0039]步驟(2)中所述的以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群優(yōu)選采用上述的以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法獲得;
[0040]步驟(2)和步驟(3)中所述的培養(yǎng)基為GT-T551 / AIM V / X-VIV0培養(yǎng)基。
[0041]利用上述方法制備得到的Thl細(xì)胞亞群在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042]本發(fā)明的有益效果為:
[0043]利用本發(fā)明提供的用于制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的試劑盒和以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法能在貼壁單個(gè)核細(xì)胞中獲得更高比例的CD4+T細(xì)胞,從而有利于減少雜質(zhì)細(xì)胞對(duì)其轉(zhuǎn)化為Thl細(xì)胞亞群的影響;利用本發(fā)明提供的用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的試劑盒和用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法能獲得的Thl細(xì)胞亞群具有很強(qiáng)的免疫活性,能大量分泌細(xì)胞顆粒酶B、穿孔素、IFN- Y和TNF- α,具有顯著的抗腫瘤活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是本發(fā)明實(shí)施例2中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)的貼壁單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T淋巴細(xì)胞所占百分比;其中,圖1A表示用CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法獲得的貼壁的單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞占比;圖1B為用普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T淋巴細(xì)胞占比;
[0045]圖2是本發(fā)明實(shí)施例3中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)的CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法結(jié)合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養(yǎng)瓶皿法以及兩種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群的情況;圖2A表示用第I種細(xì)胞因子組合的結(jié)果;圖2B為用第2種細(xì)胞因子組合的結(jié)果;
[0046]圖3是本發(fā)明實(shí)施例4中,免疫印跡法檢測(cè)得到的Thl細(xì)胞亞群中Thl細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素表達(dá)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0047]下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:[0048]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明,均為常規(guī)方法。
[0049]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等,如無特殊說明,均可從商業(yè)途徑得到。
[0050]實(shí)施例1:⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法制備以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群
[0051](1)將含1-10 μ g / mL的⑶4單克隆抗體的包被液,加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培養(yǎng)瓶皿中,將培養(yǎng)瓶皿用錫箔紙包住以避光,平放,4°C孵育過夜;其中,使用的CD4單克隆抗體類型可為IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種;
[0052](2)第I天,無菌條件下抽取健康人或腫瘤患者外周血,或取采血初步分離(即單采)得到的正常人或腫瘤患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞,或采集臍帶血,或采集骨髓,轉(zhuǎn)入50mL離心管中,加入等體積生理鹽水稀釋,獲得經(jīng)稀釋的樣品;再按經(jīng)稀釋的樣品與淋巴細(xì)胞分離液的體積比2:1或1:1的比例,將經(jīng)稀釋的樣品轉(zhuǎn)至淋巴細(xì)胞分離液上方,慢升慢降(升I降O),2000轉(zhuǎn)/分離心20-30分鐘;然后小心吸取白膜層,用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌兩次,即得到單個(gè)核細(xì)胞;
[0053](3)用培養(yǎng)基GT-T551 / AIMV / X-VIV0將步驟⑵獲得的單個(gè)核細(xì)胞吹打混勻,按2~5X106 / mL的密度種植于步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養(yǎng)瓶皿中,5% C02、37 °C條件下孵育2~6個(gè)小時(shí);然后吸棄上清,用生理鹽水、D-Hanks液或PBS輕柔沖洗培養(yǎng)瓶皿壁3次 ,吸棄上清;
[0054](4)使用0.25%胰酶消化細(xì)胞,然后收集細(xì)胞,用生理鹽水、D-Hanks液或PBS洗滌細(xì)胞3次,收集沉淀細(xì)胞,即為以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群;或者采用細(xì)胞刮等進(jìn)行細(xì)胞收集也可。
[0055]其中,本實(shí)施例采用的培養(yǎng)基GT-T551購自TAKARA,AM V購自LIFE,X-VIVO購自LONZA0
[0056]上述利用⑶4單克隆抗體包被聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的培養(yǎng)瓶皿所獲得的CD4+T細(xì)胞的純度與普通單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的CD4+T細(xì)胞相比的優(yōu)點(diǎn)將通過實(shí)施例2來進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0057]實(shí)施例2:利用實(shí)施例1所述的CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法能在單個(gè)核細(xì)胞中獲得更高比例的CD4+T細(xì)胞
[0058](1)將按照實(shí)施例1步驟(2)所述的方法制備得到的單個(gè)核細(xì)胞分成如下兩組:
[0059]第I組:⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法:
[0060]將單個(gè)核細(xì)胞按2~5X 1O6 / mL的密度種植于按照實(shí)施例1步驟⑴所述的方法制備的用CD4單克隆抗體包被的聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培養(yǎng)瓶皿中;5% CO2、37°C條件下孵育2~6小時(shí)后,吸棄上清,用生理鹽水、D-Hanks液或PBS沖洗瓶皿壁,獲得以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群;
[0061]第2組:普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法:
[0062]直接收集按照實(shí)施例1步驟(2)所述的方法制備得到的單個(gè)核細(xì)胞;
[0063](2)分別將步驟(1)獲得的兩組細(xì)胞用⑶4-FITC標(biāo)記,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(結(jié)果見圖1)。
[0064]從圖1可知,第I組⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法獲得的貼壁細(xì)胞中⑶4+T細(xì)胞百分比約為57.6% ±7.3% (如圖1A所示),而第2組的該比例為32.4% ±8.4% (如圖1B所示);[0065]因此,利用實(shí)施例1所述的CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法,與普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法相比獲得的單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T淋巴細(xì)胞百分比更高。
[0066]本實(shí)施例中CD4-FITC抗體購自BD Bioscience。
[0067]實(shí)施例3:
[0068](1)用含有I~10 μ g / mL CD3mAb和I~10 μ g / mL CD28mAb的包被液包被培
養(yǎng)瓶皿,4°C避光孵育過夜;
[0069](2)將按照實(shí)施例1中的方法制備得到的以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群用含500~3000U / mL IFN-Y 的 GT-T551 / AIM V / X-VIV0 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成 I ~5X106 / mL 的細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)入步驟(1)中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養(yǎng)瓶皿中,5% C02、37°C條件下孵育過夜,得到以激活的CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群;
[0070](3)收集步驟(2)中獲得的以激活的CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群,使用含有下述任一種細(xì)胞因子組合的、含1%~5%自體血漿或AB血漿的GT-T551 / AIM V / X-VIVO培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)成I~3X106 / mL的細(xì)胞懸液,種植到培養(yǎng)瓶皿中:
[0071]第I種細(xì)胞因子組合如下:
[0072]10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2 ;
[0073]第2種細(xì)胞因子組合如下:
[0074]10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ;
[0075]每2~3天,加入和之前使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基,維持細(xì)胞密度在I~2X IO6 / mL ;第14天,即獲得Thl細(xì)胞亞群;分別收集用上述兩種不同的細(xì)胞因子組合刺激培養(yǎng)后獲得的Thl細(xì)胞亞群,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行如下檢測(cè):
[0076]分別使用CD3-FITC、CD8-PE、y -1FN-CYS, IL-4-CYS 或 CD25-PE 和 CD127-FITC 對(duì)上述兩組細(xì)胞進(jìn)行染色,然后分別用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見圖2。
[0077]由圖2A1、2A2和圖2B1、2B2可知:采用第I種細(xì)胞因子組合(10~IOOng / mLIL-7U0 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)能獲得Thl細(xì)胞百分比85%以上的Thl細(xì)胞亞群;采用第2種細(xì)胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2)能獲得Thl細(xì)胞百分比60%以上的Thl細(xì)胞亞群;
[0078]由圖2A3和圖2B3可知:采用第I種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中,Th2細(xì)胞所占百分比在1%以下;采用第2種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中,Th2細(xì)胞所占百分比在3%以下;
[0079]由圖2A4和圖2B4可知:采用第I種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中,Treg細(xì)胞所占百分比為O ;采用第2種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中,Treg細(xì)胞所占百分比在I 以下;
[0080]綜上,圖2說明了:利用實(shí)施例1所述的⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法結(jié)合本實(shí)施例的⑶3mAb和⑶28mAb包被培養(yǎng)瓶皿法以及第I種細(xì)胞因子組合(10~IOOng / mLIL-7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~100ng/mL IL-12,500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細(xì)胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL-18,500 ~ 1000U / mL IL-2)刺激法,能獲得 Thl 細(xì)胞占比很高、Th2和Treg雜質(zhì)細(xì)胞占比極低的Thl細(xì)胞亞群,且使用第I種細(xì)胞因子組合時(shí),Thl細(xì)胞占比更高。
[0081]其中,IL-7、IL-15、IL-18、IL-12和 IFN-Y 購自 PEPROTECH ;IL_2 購自濟(jì)南泉港;⑶3單克隆抗體和⑶28單克隆抗體購自Ebioscience。
[0082]實(shí)施例4 =Thl細(xì)胞亞群中Thl細(xì)胞顆粒酶B和穿孔素免疫印跡檢測(cè)
[0083](I)收集實(shí)施例3步驟(3)中第14天收集的經(jīng)兩種不同的細(xì)胞因子組合刺激培養(yǎng)后獲得的Thl細(xì)胞亞群,用帶有CD4標(biāo)簽的免疫磁珠分選得到Thl細(xì)胞;
[0084]同時(shí),用帶有⑶4標(biāo)簽的免疫磁珠分選使用實(shí)施例2步驟(1)第2組實(shí)驗(yàn)所述的普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的細(xì)胞中的Thl細(xì)胞;
[0085]免疫印跡法檢測(cè)上述兩組Thl細(xì)胞的顆粒酶B和穿孔素表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果見圖3。
[0086]圖3中,第11組為采用實(shí)施例3步驟(3)中的第I種細(xì)胞因子組合后獲得的Thl細(xì)胞的顆粒酶B和穿孔素表達(dá)情況結(jié)果圖;第12組為采用實(shí)施例3步驟(3)中的第2種細(xì)胞因子組合后獲得的Thl細(xì)胞的顆粒酶B和穿孔素表達(dá)情況的結(jié)果圖;第21組為采用實(shí)施例2步驟(1)第2組實(shí)驗(yàn)所述的普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的細(xì)胞中的Thl細(xì)胞的顆粒酶B和穿孔素表達(dá)情況的結(jié)果圖。
[0087]結(jié)果顯示,第11組和第12組的Thl細(xì)胞,可以表達(dá)顆粒酶B和穿孔素,且第11組比第12組的顆粒酶B和穿孔素的表達(dá)量均更高;而第21組基本不表達(dá)顆粒酶B和穿孔素。
[0088]因此,使用本發(fā)明提供的⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法結(jié)合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養(yǎng)瓶皿法以及第I種細(xì)胞因子組合(10~IOOng / mL IL-7、10~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL_18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細(xì)胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL-18、500~1000U / mL IL-2)獲得的Thl細(xì)胞亞群中的Thl細(xì)胞具有更高的活性,同時(shí),使用第I種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中的Thl細(xì)胞活性更高。
[0089]實(shí)施例5:Thl細(xì)胞亞群中Thl細(xì)胞的IFN- Y和TNF- α表達(dá)檢測(cè)
[0090](I)收集實(shí)施例3步驟(3)中第14天收集的經(jīng)兩種不同的細(xì)胞因子組合刺激培養(yǎng)后獲得的Thl細(xì)胞亞群,用帶有CD4標(biāo)簽的免疫磁珠分選得到Thl細(xì)胞;
[0091]同時(shí),用帶有⑶4標(biāo)簽的免疫磁珠分選使用實(shí)施例2步驟⑴第2組實(shí)驗(yàn)所述的普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的細(xì)胞中的Thl細(xì)胞;
[0092]Elisa法檢測(cè)上述兩組Thl細(xì)胞的IFN- Y和TNF- α表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0093]表1中,第11組為采用實(shí)施例3步驟(3)中的第I種細(xì)胞因子組合后獲得的Thl細(xì)胞的IFN- Y和TNF- α表達(dá)情況;第12組為采用實(shí)施例3步驟(3)中的第2種細(xì)胞因子組合后獲得的Thl細(xì)胞的IFN- Y和TNF- α表達(dá)情況;第21組為采用實(shí)施例2步驟(1)第2組實(shí)驗(yàn)所述的普通的單個(gè)核細(xì)胞提取法獲得的細(xì)胞中的Thl細(xì)胞的IFN-Y和TNF-α表達(dá)情況。
[0094]結(jié)果顯示,第11組和第12組的Thl細(xì)胞,表達(dá)的IFN-Y和TNF-α顯著高于第21組的Thl細(xì)胞,且第11組比第12組的IFN-Y和TNF-α的表達(dá)量均更高。
[0095]因此,使用本發(fā)明提供的⑶4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿法結(jié)合⑶3mAb和⑶28mAb包被培養(yǎng)瓶皿法以及第I種細(xì)胞因子組合(10~IOOng / mL IL-7、10~IOOng / mL IL-15、10 ~IOOng / mL IL-18、10 ~IOOng / mL IL_12、500 ~1000U / mL IL-2)或第 2 種細(xì)胞因子組合(10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~100ng/mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2)獲得的Thl細(xì)胞亞群中的Thl細(xì)胞具有更高的活性,同時(shí),使用第I種細(xì)胞因子組合獲得的Thl細(xì)胞亞群中的Thl細(xì)胞活性更高。
[0096]表1
[0097]
【權(quán)利要求】
1.一種用于制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒含有如下成分: CD4單克隆抗體和由聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯材料制成的培養(yǎng)瓶皿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于制備以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的試劑盒,其特征在于,所述的⑶4單克隆抗體為含⑶4單克隆抗體1-10 μ g / mL的包被液;所述的⑶4單克隆抗體選自IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一種類型。
3.—種以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法,其特征在于,包括如下步驟: (1)用CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿;所述的培養(yǎng)瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成; (2)從外周血、臍帶血或骨髓中獲取單個(gè)核細(xì)胞; (3)用培養(yǎng)基將步驟(2)獲得的單個(gè)核細(xì)胞吹打混勻,按2~5XIO6 / mL的濃度種植于步驟(1)用⑶4單克隆抗體包被好的培養(yǎng)瓶皿中,5% C02、37°C條件下孵育2-6個(gè)小時(shí),即獲得以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法,其特征在于,步驟(I)中,所述的用CD4單克隆抗體包被培養(yǎng)瓶皿的方法為:將含l-ΙΟμ g/mL的CD4單克隆抗體的包被液,加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培養(yǎng)瓶皿中,將培養(yǎng)瓶皿用錫箔紙包住以避光,平放,4 °C孵育過夜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法,其特征在于,步驟(2)中,所述的外周血為采自正常人或腫瘤患者的外周血,或者臍帶血,正常人或者腫瘤患者骨髓;步驟(3)中,所述的培養(yǎng)基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO0
6.一種用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒含有如下成分: 1~10μ g / mL Q)3mAb和I~10 μ g / mL Q)28mAb以及如下任意一種細(xì)胞因子組合: 第I種細(xì)胞因子組合: .10 ~IOOng/mL IL-7、10 ~IOOng / mL IL-15、10 ~100ng / mL IL-18、10 ~100ng /mL 1L-12、500 ~1000U / mL IL-2 ; 第2種細(xì)胞因子組合:
.10 ~IOOng / mL IL_7、10 ~IOOng / mL IL_15、10 ~IOOng / mL IL_18、500 ~.1000U / mL IL-2。
7.一種用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法,其特征在于,包括如下步驟: (1)用含有1~10μ g / mL⑶3mAb和1~10 μ g / mL⑶28mAb的包被液包被培養(yǎng)瓶皿,4°C避光孵育過夜; (2)將以⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群用含500~3000U/ mL IFN- Y的培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成I~.5 X IO6 / mL的細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)入步驟(1)中用⑶3mAb和⑶28mAb過夜包被的培養(yǎng)瓶皿中,.5% C02、37°C條件下孵育過夜,得到以激活的⑶4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群; (3)收集步驟(2)中獲得的以激活的CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群,使用含有下述任一種細(xì)胞因子組合的培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)成I~3X106 / mL的細(xì)胞懸液,種植到培養(yǎng)瓶皿中:第1種細(xì)胞因子組合如下: . 10 ~100ng/mL IL-7、10 ~100ng / mL IL-15、10 ~100ng / mL IL-18、10 ~100ng /mL IL-12、500 ~1000U / mL IL-2 ; 第2種細(xì)胞因子組合如下: .10 ~100ng / mL IL_7、10 ~100ng / mL IL_15、10 ~100ng / mL IL_18、500 ~1000U / mL IL-2 ; 每2~3天,加入和之前使用的培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基,維持細(xì)胞密度在1~2 X IO6 /mL ;第14天即得到所述的Thl細(xì)胞亞群。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法,其特征在于,步驟(2)中所述的以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群采用權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群的制備方法制備得到。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于將以CD4+T細(xì)胞為主的細(xì)胞群制備成Thl細(xì)胞亞群的方法,其特征在于,步驟(2)和步驟(3)中所述的培養(yǎng)基為GT-T551 / AIM V / X-VIVO培養(yǎng)基。
10.利用權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)所述的方法制備得到的Thl細(xì)胞亞群在制備抗腫瘤細(xì)胞制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103911341SQ201410036359
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月26日
【發(fā)明者】羅昀, 曾鋼, 張立媛, 王敏杰 申請(qǐng)人:山東迪博生物技術(shù)有限公司
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