桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用。該桑黃提取物的制備方法如下:（1）桑黃子實體粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，合并三次提取液得總提取液；（2）總提取液回收乙醇后，濃縮至適量，加蒸餾水制成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃??；（3）將乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，即得桑黃提取物。本發(fā)明從桑黃子實體中分離提取得到的桑黃提取物，能夠有效地用于制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌的藥物，且提取工藝簡單易行，操作方便，能夠有效提取多種有效成分，提取效率高，產品質量穩(wěn)定，對桑黃資源的綜合利用和產業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【專利說明】桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用，屬于醫(yī)藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]肝癌、子宮頸癌、乳腺癌是目前比較常見的三種惡性腫瘤，不僅嚴重影響患者的生活質量，而且給家庭和社會帶來沉重的經濟和精神負擔，也是困擾全球的重大社會問題，癌癥的治療和預防始終是全球范圍類最為迫切的問題之一。目前，化學藥物治療是抗擊腫瘤的主要手段，雖然有較好的療效，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反應，使患者難以堅持治療，并且化療藥物在治療過程中出現(xiàn)的耐藥性已成為目前臨床治療中的難題之一。近年來，全球抗腫瘤藥物市場呈快速增長態(tài)勢，據美國FDA統(tǒng)計數據，全球抗癌藥物市場銷售總額由2004年的240億美元，激增至2007年的396億美元。雖然全球每年都不斷有新型抗腫瘤藥物問世，但至今人類仍然沒有一種有效的手段戰(zhàn)勝癌癥，同時不斷發(fā)現(xiàn)新的癌癥種類，以及腫瘤抗/耐藥性的產生和增強，使得對發(fā)現(xiàn)新型有效抗癌藥物的需要顯得尤為迫切?？v觀全球1981至2002年期間所開發(fā)的抗癌藥物，約60%直接或間接來自于天然產物，充分表明自然界是人類獲取抗腫瘤藥物的最重要的源泉。我國中藥資源豐富，從傳統(tǒng)的藥用資源中篩選尋找抗癌天然活性部位是完全可行的。
[0003]桑黃，基原為多孔菌科針層孔菌的子實體，拉丁學名:phellinus igniarius(L.exFr.)QUel。又名:火木層孔菌，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形。現(xiàn)代研究證實桑黃含有黃酮、多糖等有效成分，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤等多方面的藥理活性，因此，從桑黃中尋找高活性的抗腫瘤活性部位是可行的。

【發(fā)明內容】
·
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0006]桑黃提取物在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0007]桑黃提取物在制備治療子宮頸癌藥物中的應用。
[0008]桑黃提取物在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
[0009]所述的藥物劑型可以是片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、口服液、糖漿、凍干粉針、水針等劑型。
[0010]所述的桑黃提取物的制備方法如下:
[0011 ] (I)桑黃子實體粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小時，提取溫度為75-85°C，合并三次提取液得總提取液；
[0012](2)總提取液回收乙醇后，濃縮至適量，加蒸餾水制成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃??；
[0013](3)將乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，即得桑黃提取物。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
[0015]本發(fā)明從桑黃子實體中分離提取得到的桑黃提取物，能夠有效地用于制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌的藥物，且提取工藝簡單易行，操作方便，能夠有效提取多種有效成分，提取效率高，產品質量穩(wěn)定，對桑黃資源的綜合利用和產業(yè)化發(fā)展具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為桑黃提取物對肝癌!fepG2細胞體外增殖抑制活性顯微圖；其中，a、對照組，b、陽性藥物組，C、實驗組(200 μ g/ml)。
[0017]圖2為桑黃提取物對宮頸癌HeLa體外增殖抑制活性顯微圖；其中，a、對照組，b、陽性藥物組，C、實驗組(200 μ g/ml)。
[0018]圖3為桑黃提取物對乳腺癌MCF-7體外增殖抑制活性顯微圖；其中，a、對照組，b、陽性藥物組，C、實驗組(150 μ g/ml), d、實驗組(200 μ g/ml)。
[0019]圖4為桑黃提取物對肝癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影響分析圖；其中，*P〈0.05，**Ρ〈0.01vs.模型組；#Ρ〈0.05, ##P<0.01vs.正常組。
[0020]圖5為桑黃提取物對肝癌荷瘤裸鼠NK細胞殺傷活性的影響分析圖；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.0 1vs.模型組。
[0021]圖6為桑黃提取物對肝癌荷瘤裸鼠ConA誘導脾淋巴細胞增殖反應的影響；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型組;##P<0.01vs.正常組。
[0022]圖7為桑黃提取物對宮頸癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影響分析圖；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型組；#Ρ〈0.05, ##P<0.01vs.正常組。
[0023]圖8為桑黃提取物對宮頸癌荷瘤裸鼠NK細胞殺傷活性的影響分析圖；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型組。
[0024]圖9為桑黃提取物對宮頸癌荷瘤裸鼠ConA誘導脾淋巴細胞增殖反應的影響分析圖；其中，*p<0.05，**P<0.01vs.模型組;##P<0.01vs.正常組。
[0025]圖10為桑黃提取物對乳腺癌荷瘤裸鼠血清中NO含量的影響分析圖；其中，*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01vs.模型組；#P<0.05，##P<0.01vs.正常組。
[0026]圖11為桑黃提取物對乳腺癌荷瘤裸鼠NK細胞殺傷活性的影響分析圖；其中，*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01vs.模型組。
[0027]圖12為桑黃提取物對乳腺癌荷瘤裸鼠ConA誘導脾淋巴細胞增殖反應的影響分析圖；其中，*P<0.05，**P<0.01vs.模型組;##P<0.01vs.正常組。
【具體實施方式】
[0028]下面舉出實施例對本發(fā)明的制備方法進行說明，但本發(fā)明的制備方法并不限于此。
[0029]實施例
[0030]一種桑黃提取物的制備方法，包括以下步驟:
[0031](I)取桑黃子實體10kg，粉碎，用95%乙醇回流提取三次(6倍量、5倍量、4倍量)，每次提取2小時，提取溫度為80°C，合并三次提取液得總提取液；
[0032](2)總提取液回收乙醇后，濃縮至1.5g生藥/ml，加蒸餾水制成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取；
[0033](3)將得到的乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，回收溶劑，濃縮至干，即得桑黃提取物462g。
[0034]下面通過試驗證明本發(fā)明的桑黃提取物的抗腫瘤活性。
[0035]細胞毒實驗:
[0036]一、實驗材料:
[0037]1、細胞株
[0038]肝癌細胞株H印G2 ;宮頸癌細胞株HeLa ;乳腺癌細胞株MCF-7 ;安徽醫(yī)科大學藥學院提供。
[0039]2、藥物與試劑
[0040]桑黃乙醇提取物，乙酸乙酯提取物，正丁醇提取物；
[0041]DMEM培養(yǎng)粉:購自美國Gibco公司；
[0042]小牛血清，胎牛血清:購自杭州四季青生物材料研究所。置于_20°C冰箱保存，4°C冰箱過夜融化，在56°C水浴30min滅活后使用；
[0043]氟尿嘧啶:購自齊魯制藥有限公司；
[0044]青霉素:購自哈藥集團制藥總廠；
[0045]鏈霉素:購自深圳華南南方制藥有限公司；
[0046]二甲基亞諷(DMSO):購自Sigma公司；
[0047]噻唑藍(MTT):購自Sigma公司；
[0048]50mm2細胞培養(yǎng)瓶，96孔板:購自康寧公司
[0049]3、主要溶液配制
[0050]DMEM細胞培養(yǎng)液:DMEM粉末一包，丙酮酸鈉0.Hg,谷氨酰胺0.58g，碳酸氫鈉
2.0g，加入三蒸水定容至1000ml，0.22μπι過濾除菌，分裝后置于-20°C保存?zhèn)溆?。臨用前37°C水浴融化，后加入105IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10%小牛血清(10%胎牛血清用于培養(yǎng)乳腺癌細胞)。
[0051]磷酸鹽緩沖液(PBS):8.0g NaCl, 0.2g KCl, 2.9g Na2HPO412H20,0.2g KH2PO4 ；
[0052]溶解于適量三蒸水，調節(jié)PH值至7.2，定容至1L，過濾分裝，高壓滅菌后，_20°C保
存?zhèn)溆谩?br> [0053]MTT溶液:MTT粉劑溶于PH為7.4的PBS溶液中，濃度5mg/ml，避光、超聲助溶，過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用，4°C保存。
[0054]4、儀器與設備
[0055]40C，_20°C低溫冰箱:日本三洋公司；
[0056]MDF-U40865型_80°C超低溫冰箱:日本三洋公司；
[0057]SB25-12DTD型超聲波清洗機:寧波新芝公司； [0058]DHG-9243BS-1II型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海新苗；
[0059]DK-8D三孔電熱恒溫水槽:合肥科隆公司；
[0060]3-16K型冷凍離心機:Sigma公司；[0061]TGL高速冷凍離心機:長沙湘智離心儀器有限公司；
[0062]2306-Z型CO2培養(yǎng)箱:美國Shellab公司；
[0063]立式壓力蒸汽滅菌器:
[0064]Sff-CJ-1F型凈化工作臺:蘇州凈化公司產品；
[0065]Rios83olPE超純水機:美國密理博公司產品；
[0066]MULISKAN MK3 酶標儀:Thermo forma 儀器有限公司；
[0067]移液器:法國PIPETMA公司；
[0068]XD-202倒置顯微鏡:合肥科?。?br> [0069]二、實驗方法
[0070]2.1細胞培養(yǎng)
[0071]本實驗所用的肝癌細胞！fepG2，宮頸癌細Hela，乳腺癌細胞MCF-7。均為貼壁生長的細胞株，除了乳腺癌細胞用含10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，其余兩種細胞株用含有10%的小牛血清DMEM培養(yǎng)液，并加入青霉素10IU/mL和鏈霉素100 μ g/mL的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37°C，5%的CO2培養(yǎng)箱，每2天更換培養(yǎng)液一次，細胞長滿培養(yǎng)瓶時消化傳代，(細胞種類不同，傳代比例不同)，取處于對數生長期的細胞進行實驗。
[0072]2.2MTT法檢測細胞增殖情況
·[0073]活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜(Formazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在492nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值A，來判斷活細胞數量，A值越大，細胞活性越強。
[0074]肝癌，宮頸癌，乳腺癌細胞以5X IO5個/ml的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種量為100 μ Lo待細胞貼壁后，分為空白對照組，溶劑對照組(1%DMS0)，陽性對照5-FU組，每組設5個復孔組，每孔總體積為200 μ L,分別于48h、72h后，棄去孔內液體，用PBS清洗2便，之后加入180 μ L無血清培養(yǎng)液，并加入MTT (濃度為5mg/mL) 20 μ L，繼續(xù)在培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入150yL的DMS0，震蕩搖勻，使甲瓚顆粒充分溶解。于酶聯(lián)免疫檢測儀上，以波長492nm，試劑對照組調零，測吸光度(A492)值，重復3次，取其平均值。用SPSS17.0計算細胞IC50值，按照下列公式計算細胞生長抑制率:
[0075]細胞生長抑制率=〔(對照組平均A492值-空白組平均A492值)-實驗組平均A492值-空白組平均A492值)/對照組平均A492值-空白組平均A492值〕X 100%。
[0076]三、實驗結果
[0077]表1桑黃提取物對肝癌HepG2細胞的抑制作用
[0078]
【權利要求】
1.桑黃提取物在制備治療肝癌藥物中的應用。
2.桑黃提取物在制備治療子宮頸癌藥物中的應用。
3.桑黃提取物在制備治療乳腺癌藥物中的應用。
4.根據權利要求1或2或3所述的桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用，其特征在于，所述的藥物劑型可以是片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、口服液、糖漿、凍干粉針、水針等劑型。
5.根據權利要求1或2或3所述的桑黃提取物在制備治療肝癌、子宮頸癌、乳腺癌藥物中的應用，其特征在于，所述的桑黃提取物的制備方法如下: (O桑黃子實體粉碎后，用95%乙醇回流提取三次，每次提取2-3小時，提取溫度為75-85°C，合并三次提取液得總提取液； (2)總提取液回收乙醇后，濃縮至適量，加蒸餾水制成懸浮液，再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃??； (3)將乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾，`回收溶`劑，濃縮至干，即得桑黃提取物。
【文檔編號】A61K36/06GK103860602SQ201410023184
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2014年1月17日
【發(fā)明者】李寧, 陳剛, 賈鵬鵬, 王開金, 余春富 申請人:六安市丹皇生物科技有限責任公司, 安徽醫(yī)科大學