一種牙齒蓋髓劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及組織再生材料研發(fā)領(lǐng)域，公開了一種牙齒蓋髓劑及其制備方法，所述牙齒蓋髓劑為rhBMP2-PLGA緩釋微球；其制備方法，包括以下步驟：將先rhBMP2溶液加入到PLGA二氯甲烷溶液中，冰浴條件下超聲乳化形成均勻的初乳，并用高速勻質(zhì)機(jī)在10000r/min條件下進(jìn)行攪拌；抽取攪拌后的初乳勻速注于PVA溶液中，均勻分散形成復(fù)乳；磁力攪拌，使二氯甲烷揮發(fā)完全后離心，收集沉淀物；去離子水反復(fù)洗滌后冷凍干燥,得rhBMP2-PLGA緩釋微球，4℃保存。本發(fā)明的rhBMP2-PLGA緩釋微球具有緩釋長效作用，保護(hù)基因重組人骨形成蛋白2的相關(guān)因子的活性，形成新的牙本質(zhì)，以達(dá)到保護(hù)活髓的目的。
【專利說明】一種牙齒蓋髓劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及及組織再生材料研發(fā)領(lǐng)域，特別涉及一種牙齒蓋髓劑及其制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]牙髓疾病治療中活髓保存治療是最符合生物學(xué)觀點(diǎn)的方法，在其治療中蓋髓劑的作用至關(guān)重要。在目前所用的眾多蓋髓材料中，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone MorphogeneticProtein, BMP)是一直普遍關(guān)注的材料之一。有報道認(rèn)為BMP用做蓋髓治療，短時期內(nèi)便可形成大量修復(fù)性牙本質(zhì)封閉露髓孔，有利于牙髓的恢復(fù)。但是，當(dāng)BMP單獨(dú)在體內(nèi)應(yīng)用時，很快就會被稀釋或是被蛋白酶破壞，對牙髓細(xì)胞的作用時間短，不能有效的發(fā)揮其應(yīng)有的生物性能；而且不能為牙本質(zhì)形成提供支架，使其在臨床應(yīng)用中受到很大的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種牙齒蓋髓劑及其制備方法，以rhBMP2_PLGA緩釋微球材料作為牙齒蓋髓劑，可以解決BMP在應(yīng)用時的不足，既能起到緩釋作用；又可以保護(hù)基因重組人骨形成蛋白 2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))的相關(guān)因子的活性，達(dá)到保護(hù)活髓的目的。
[0004]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)。
[0005]一種牙齒蓋髓 劑，其特征在于，所述牙齒蓋髓劑為rhBMP2_PLGA緩釋微球。
[0006]上述牙齒蓋髓劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將先rhBMP2溶液加入到PLGA 二氯甲烷溶液中，冰浴條件下超聲乳化形成均勻的初乳，并用高速勻質(zhì)機(jī)在lOOOOr/min條件下進(jìn)行攪拌；抽取攪拌后的初乳勻速注于PVA溶液中，均勻分散形成復(fù)乳；磁力攪拌，使二氯甲烷揮發(fā)完全后離心，收集沉淀物；去離子水反復(fù)洗滌后冷凍干燥，得作為牙齒蓋髓劑的rhBMP2-PLGA緩釋微球，4°C保存。
[0007]上述技術(shù)方案中，優(yōu)選地，rhBMP2溶液的質(zhì)量-體積濃度為0.1% (mg/ml), PLGA二氯甲烷溶液的質(zhì)量-體積濃度為2.5% (mg/ml), PVA溶液的質(zhì)量-體積濃度為1% (mg/ml)，其中rhBMP2溶液、PLGA 二氯甲烷溶液、PVA溶液的體積比為1:10:100。
[0008]本發(fā)明以rhBMP2_PLGA緩釋微球作為牙齒蓋髓劑，基因重組人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))為主體，以聚乳酸-輕基乙酸共聚物〔poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA)為支架,解決了 rhBMP-2 在體內(nèi)被快速稀釋和被蛋白酶破壞的技術(shù)問題，具有緩釋長效作用，保護(hù)基因重組人骨形成蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2))的相關(guān)因子的活性，形成新的牙本質(zhì)，以達(dá)到保護(hù)活髓的目的。
[0009]此外，PLGA生物相容性較好、可生物降解、無毒性；而且其本身及其降解產(chǎn)物均對多肽類、蛋白等無明顯的不良反應(yīng)，安全可靠，并得到美國FDA的批準(zhǔn)用于臨床。
【專利附圖】

【附圖說明】[0010]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0011]圖1為rhBMP2-PLGA緩釋微球掃描電鏡照片圖。
[0012]圖2為rhBMP2_PLGA緩釋微球粒徑分布圖。
[0013]圖3為rhBMP2_PLGA緩釋微球的體外釋放折線圖。
[0014]圖4為空白對照組實驗結(jié)果圖，圖中無硬組織形成。
[0015]圖5為rhBMP2組實驗結(jié)果圖，圖中有牙本質(zhì)鈣化橋，但相對較少。
[0016]圖6為rhBMP2_PLGA緩釋微球組實驗結(jié)果圖，圖中有牙本質(zhì)生成，形成完整的鈣化橋。
[0017]圖7為膠原組實驗結(jié)果圖，圖中可以觀察到完整的牙本質(zhì)橋形成；
[0018]圖8為抗生素組實驗結(jié)果圖，圖中有鈣化的硬組織生成，但無完整的牙本質(zhì)鈣化橋。
[0019]圖9為抗生素和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組實驗結(jié)果圖，圖中可以觀察到有完整的牙本質(zhì)鈣化橋。
[0020]圖10為膠原和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組實驗結(jié)果圖，圖中可以觀察到有完整的牙本質(zhì)鈣化橋生成，且髓腔內(nèi)無鈣化。
[0021]圖11為各組動物實驗牙本質(zhì)橋厚度的柱狀圖。`【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明中，PLGA、PVA購買于SIGMA公司；rhBMP2購于上海瑞邦生物材料有限公司；rhBMP2ELISA檢測試劑盒購于武漢博士德公司。采用(水包油、油包水)W/0/W復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備rhBMP2-PLGA緩釋微球。
[0023]1、實驗方法
[0024](I)實驗制備:
[0025]將200ul含0.1% (mg/ml)質(zhì)量-體積濃度的rhBMP2溶液(內(nèi)水相，設(shè)為Wl)加入到2ml含有2.5% (mg/ml)質(zhì)量-體積濃度的PLGA 二氯甲烷溶液(油相，設(shè)為O)中，冰浴條件下超聲乳化形成均勻的初乳(W1/0)，立即用高速勻質(zhì)機(jī)在10000r/min條件下進(jìn)行攪拌；用針筒抽取攪拌后的初乳緩慢勻速注于到20ml含1% (mg/ml)質(zhì)量-體積濃度的PVA溶液(外水相，設(shè)為W2)中，均勻分散2min形成Wl / O / W2的復(fù)乳；磁力攪拌3~4h，使得二氯甲烷揮發(fā)完全后，15000r/min離心5min，收集沉淀物；去離子水反復(fù)洗5次，冷凍干燥48h，得rhBMP2-PLGA緩釋微球，4°C保存。
[0026](2)形態(tài)觀察:
[0027]取適量rhBMP2_PLGA緩釋微球均勻分散在貼有雙面膠的金屬板上，噴金后以掃面電鏡(SEM)觀察其表面形態(tài)。
[0028]( 3 )微球粒徑和分布測定:
[0029]取適量rhBMP2_PLGA緩釋微球分散于超純水中，超聲振蕩分散均勻后，在激光粒度分析儀(馬爾文Nano ZS-90)中測定其分布和粒徑。
[0030](4)測定包封率和載藥量:
[0031]精密稱取rhBMP2-PLGA 緩釋微球 20mg，加入 2mL0.lmol/L NaOH(含 0.5%SDS)溶液中，于37°C恒溫水浴振蕩孵育24h，使微球完全溶解；用0.lmol/LHCl中和至pH值為7.0后，12000r/min離心5min，取上清液，用ELISA測定載藥微球中rhBMP2的含量，具體操作按照試劑盒上的說明進(jìn)行。并分別按下列公式計算包封率和載藥量:
[0032]微球包封率(％)=(微球中的含藥量/投藥量)X 100%
[0033]微球載藥量(％)=(微球中的含藥量/微球質(zhì)量)X 100%
[0034]( 5 )計算釋放量:
[0035]準(zhǔn)確量取rhBMP2-PLGA緩釋微球IOmg溶于5ml pH7.4的PBS緩沖液(20mmol)為釋放介質(zhì)，37°C下振蕩，分別于l、3、7、14、28d時分別取出上清液200ul并補(bǔ)充新鮮等量的釋放介質(zhì)。上清液通過rhBMP2ELISA測定rhBMP2的濃度，并計算釋放量。
[0036](6)動物實驗:
[0037]選用2只健康成年比格犬(購于西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司)，SPF級(安全健康級別)，體重分別為10.8kg、ll.2kg，年齡12-14個月，均為雄性，牙列完整且牙體牙周組織健康，全身無疾病，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)I~2周，待性情穩(wěn)定后用于實驗。
[0038]每只犬選取上下兩側(cè)前白齒、 門齒，共42顆牙齒，將42顆牙按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成7組:rhBMP2組，rhBMP2-PLGA緩釋微球，膠原，牙科抗生素，牙科抗生素+rhBMP2-PLGA緩釋微球，膠原+ rhBMP2-PLGA緩釋微球，空白對照組；每組6顆牙。實驗后均飼養(yǎng)3個月后處死動物。
[0039]蓋髓手術(shù)前12h開始禁食。術(shù)前30分鐘用速眠新注射液按0.lml/Kg的劑量行術(shù)前肌肉注射麻醉，術(shù)中根據(jù)麻醉情況適當(dāng)追加注射質(zhì)量-體積濃度為3%的戊巴比妥鈉，以維持麻醉效果。麻醉后將實驗犬仰臥固定于手術(shù)臺上，用摩爾濃度為3%過氧化氫液沖洗口腔，并用質(zhì)量-體積濃度為1%碘酊和體積濃度為75%的酒精對口腔及實驗牙進(jìn)行消毒。在實驗牙的咬合面用高速渦輪手機(jī)小球鉆露髓直徑1mm，用IOml質(zhì)量-體積濃度為2.5%的次氯酸鈉輕柔沖洗，再用2ml質(zhì)量-體積濃度為1796EDTA (中文名稱:乙二胺四乙酸)沖洗，沖洗完畢后止血、干燥，將蓋髓劑置于露髓處，放入大小基本相同的明膠海綿，玻璃離子充填。具體操作步驟如下:
[0040]空白對照組:直接放置明膠海綿，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0041]rhBMP2組:將rhBMP2浸于明膠海綿后直接置于牙髓斷面，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0042]rhBMP2-PLGA緩釋微球組:將rhBMP2_PLGA緩釋微球直接置于牙髓斷面，放置明膠海綿，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0043]膠原組:用明膠海綿蘸取適量的膠原置于牙髓斷面，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0044]抗生素組:將兩種制劑混合均勻，并用明膠海綿浸取適量置于牙髓斷面上，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0045]抗生素和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組:將浸有適量抗生素的明膠海綿蘸取適量的rhBMP2-PLGA緩釋微球的白色粉末(冷凍干燥后)，置于牙髓斷面上，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0046]膠原和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組:將浸有適量膠原的明膠海綿蘸取適量的rhBMP2-PLGA緩釋微球白色粉末，置于牙髓斷面上，玻璃離子充填，并涂布凡士林隔濕。
[0047]本實驗例中，抗生素為甲硝噠唑，環(huán)丙沙星，二甲胺四環(huán)素，米諾環(huán)素的等質(zhì)量份混合物；并且整個手術(shù)過程均由同一人完成，術(shù)后前三天動物進(jìn)軟食，抗生素注射三天。術(shù)后定期觀察實驗犬的口腔內(nèi)充填物的情況和全身精神狀況。術(shù)后對實驗牙拍攝X線片。術(shù)后三個月后將動物處死取材，用MiCT0CT掃描觀察硬組織形成。
[0048]2、實驗結(jié)果
[0049](I)優(yōu)化工藝下制備的rhBMP2_PLGA緩釋微球凍干后呈白色粉末狀，無塌陷現(xiàn)象；rhBMP2-PLGA緩釋微球形態(tài)圓整均勻，表面光滑，無粘連如圖1。
[0050](2)rhBMP2-PLGA緩釋微球粒徑分布呈正態(tài)分布，如圖2所示，其分布范圍集中，大部分微球粒徑分布在3um~4um之間。
[0051](3) rhBMP2-PLGA緩釋微球的包封率72.5%±4.17%，微球的載藥率為
0.38%±0.24%。體外釋放Id時載有rhBMP2的緩釋微球釋放量為19.36%±1.83%，表現(xiàn)為突釋性釋放，這主要是由于緩釋微球表面的藥物釋放所致，隨后釋放比較緩慢，但累計釋放量持續(xù)增加，到28d時達(dá)到52.76%±3.7%。如圖3所示。
[0052](4)動物實驗結(jié)果:沿著實驗牙唇舌向牙體長軸，MicroCT觀察并測量出新生牙本質(zhì)的厚度，并求出各組的平均值。
[0053]空白對照組:如圖4所示，沒有觀察到硬組織形成；
[0054]rhBMP2組:如圖5所示，可以觀察到有完整的牙本質(zhì)鈣化橋，但相對較少。
[0055]rhBMP2-PLGA緩釋微球組:如圖6所示，可以觀察到有完整的鈣化橋生成，髓腔無鈣化；
[0056]膠原組:如圖7所示，可以觀察到完整的牙本質(zhì)橋形成；
[0057]抗生素組:如圖8所示，可以觀察到有鈣化的硬組織生成，但無完整的牙本質(zhì)鈣化橋；
[0058]抗生素和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組:如圖9所示，可以觀察到有完整的牙本質(zhì)鈣化橋生成，且髓腔內(nèi)無鈣化；
[0059]膠原和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組:如圖10所示，可以觀察到有完整的牙本質(zhì)鈣化橋生成，且髓腔內(nèi)無鈣化。
[0060]如圖11所示，rhBMP2組與膠原組、rhBMP2_PLGA緩釋微球組、抗生素和rhBMP2-PLGA緩釋微球混合組、抗生素和rhBMP2_PLGA緩釋微球混合組之間具有有統(tǒng)計學(xué)差異(P〈0.05)。
[0061]3、實驗結(jié)論
[0062]本實驗通過使用無載體的rhBMP2與其他組的實驗結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，單純使用rhBMP2對誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成也有一定的效果，但其效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及使用了rhBMP2-PLGA緩釋微球的其他組，具體原因是牙髓組織中的有機(jī)物對rhBMP2的活性有所破壞導(dǎo)致。
[0063]本實驗結(jié)果表明rhBMP2-PLGArhBMP2-PLGA緩釋微球及復(fù)合牙科抗生素進(jìn)行蓋髓術(shù)后對牙髓細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用較其它組強(qiáng)，在相同時間內(nèi)形成的牙本質(zhì)橋較厚且完整，具有良好的蓋髓效果，為其用于臨床提供可行性。
[0064]本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)，或不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。特別需要指出的是，上述所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本`發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種牙齒蓋髓劑，其特征在于，所述牙齒蓋髓劑為rhBMP2-PLGA緩釋微球。
2.如權(quán)利要求1所述的牙齒蓋髓劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:將先rhBMP2溶液加入到PLGA 二氯甲烷溶液中，冰浴條件下超聲乳化形成均勻的初乳，并用高速勻質(zhì)機(jī)在10000r/min條件下進(jìn)行攪拌；抽取攪拌后的初乳勻速注于PVA溶液中,均勻分散形成復(fù)乳；磁力攪拌，使二氯甲烷揮發(fā)完全后離心，收集沉淀物；去離子水反復(fù)洗滌后冷凍干燥，得作為牙齒蓋髓劑的rhBMP2-PLGA緩釋微球，4°C保存。
3.如權(quán)利要求2所述的牙齒蓋髓劑的制備方法，其特征在于，rhBMP2溶液的質(zhì)量-體積濃度為0.1% (mg/ml), PLGA 二氯甲烷溶液的質(zhì)量-體積濃度為2.5% (mg/ml), PVA溶液的質(zhì)量-體積濃度為1% (mg/ml )，其中rhBMP2溶液、PLGA 二氯甲烷溶液、PVA溶液的體積比為 I:10:100o
【文檔編號】A61K6/02GK103767881SQ201410004894
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】張亞慶, 屈鐵軍, 柴雪, 王蕾, 何文喜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)