硫代硫酸鹽加強乳桿菌的抗病原性效果的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及硫代硫酸鹽加強乳桿菌細菌的抗病原性效果的用途，對于107至1010個CFU的乳桿菌，所述硫代硫酸鹽為至少100mg的量。本發(fā)明還涉及包含與卷曲乳桿菌菌株組合的每克至少100mg硫代硫酸鹽的藥物組合物，及其在治療泌尿生殖器感染，諸如陰道病、念珠菌病和尿道感染中的用途。
【專利說明】硫代硫酸鹽加強乳桿菌的抗病原性效果的用途 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及包含與硫代硫酸鹽組合的乳桿菌的組合物，該硫代硫酸鹽加強所述乳 桿菌的抗病原性效果。
[0002] 在健康女性中，泌尿生殖器菌群包含幾乎50種不同的微生物物種。在這些微生物 中，95%的群體由各種乳桿菌菌株（又稱作"德德萊因氏桿菌（D0derlein's bacillus)"） 組成。這些乳桿菌通過多種機制有助于針對病原體提供保護，所述機制包括生成過氧化 氫，乳酸和細菌素，抑制病原體的粘附和擴散。特別地，這些乳桿菌通過從陰道粘膜中 存在的糖原生成乳酸而維持酸性pH。因此，陰道菌群的多種病原體，諸如陰道加德納氏 菌（Gardnerella vaginalis)、二路普雷沃氏菌（Prevotella bivia)、淋病奈瑟氏球菌 (Neisseria gonorrhoeae)、支原體（Mycoplasma)、動彎桿菌屬（Mobiluncus)和最重要地 白色念珠菌（Candida albicans)的生長受到抑制。
[0003] 因此，正常的陰道菌群主要由在粘膜表面上形成保護性生物膜的乳桿菌構成。特 別地，陰道中最常鑒定的乳桿菌是卷曲乳桿菌、詹氏乳桿菌（Lactobacillus jensenii)、陰 道乳桿菌（Lactobacillus vaginalis)、惰性乳桿菌（Lactobacillus inners)和加氏乳桿 菌（Lactobacillus gasseri)〇
[0004] 外陰陰道念珠菌?。╒ulvovaginal candidiasis)影響70 - 75%的女性，在其生 育年份期間至少一次受到影響，并且約40 - 50%會具有第二例事件。復發(fā)性外陰陰道念珠 菌病的發(fā)生率（定義為每年至少4例事件，包括通過真菌學檢查確認的2例）已經評估為 5-8%。此種良性疾病對患者的生命質量具有非常負面的影響，并且產生相當大的健康護 理花費。此類病理學由于此疾病的多因素發(fā)病機制而難以治療。
[0005] 使用口服或陰道抗真菌劑的傳統(tǒng)維持療法必須持續(xù)至少6個月，但是復發(fā)率仍然 較高，其中60 - 70%的女性在治療中斷后2個月中復發(fā)。此外，抗真菌劑具有常見的副作 用，并且其長期使用可以促進細菌性陰道炎的發(fā)生。
[0006] 細菌性陰道炎是由于正常陰道菌落的定性和定量失調所致，其可以導致乳桿菌的 實際上完全消失，導致厭氧性菌群受益，而且還導致細菌諸如陰道加德納氏菌和陰道阿托 波氏菌（Atopobium vaginae)的出現(xiàn)。細菌性陰道炎是具有10至15的頻率的最常見陰道 感染之一。女性中的此種良性病理學在妊娠期間可以是嚴重的，因為它可以引起早產、低出 生重量、和自發(fā)性流產。
[0007] 細菌性陰道炎和陰道微菌群的其它失調通常通過抗生素療法治療。此治療具有抗 生素治療的典型缺點，并且正在證明是效果越來越小的。此外，其目的為消除病原性菌群， 而且還破壞正常的有益菌群。
[0008] 發(fā)明背景
[0009] 已經描述了"有益的"乳桿菌的口服或陰道施用促進陰道健康。特別地，專利申請 TO 84/04675、W0 2000/035465、US 2002/0044926 和 WO 2006/045475 描述了乳酸細菌的口 服或陰道施用促進陰道健康并且預防外陰陰道念珠菌病的復發(fā)。
[0010] 專利申請WO 2010/004005報告了施用與含有異黃酮的植物提取物組合的益生 菌，以促進正常陰道菌群的形成。
[0011] 優(yōu)選的乳桿菌是鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)、卷曲乳桿菌和陰道 乳桿菌（Lactobacillus vaginalis)。專利 US 6,093,394、US 6, 468, 526 和 US 7,807,440， 及專利申請US 2010/0151026描述了特定卷曲乳桿菌菌株的施用。
[0012] 這些乳桿菌可以在凍干形式中或在溶液中施用，且任選地與其它活性劑組合施 用。實際上，雖然乳桿菌具有真正且公認的抗病原性效果，但是經常不足以使其能夠對抗感 染?？茖W界積極尋找其它活性劑或加強乳桿菌的抗病原性效果的藥劑。
[0013] 已經提出了與抗微生物劑組合施用乳桿菌，該細菌是微囊化的（EP 0 732 916 BI);在存在乳酸和大蒜提取物的情況下（EP 1 911 455 Al);在存在阿拉伯樹膠的情況下 (EP 2 211 640 Al);在存在雌激素和/或促孕激素的情況下（W0 2010/133314);或在存在 抗生素和不飽和酯化脂肪酸的情況下（W0 2011/066949)。
[0014] Nivoliez等（2012)的文章中呈現(xiàn)的結果指示用于制備益生性細菌的方法可以在 工業(yè)制備的乳桿菌的特征中發(fā)揮重要的作用。
[0015] 硫代硫酸鈉在許多含有乳桿菌的藥物和獸醫(yī)組合物，諸如組合物TR0PHIGIL、 PROBIOSx和ALLBIQk中作為賦形劑使用。此外，專利申請CN 20091145852描述了由 中國植物的提取物和硫代硫酸鈉組成的藥物。提出此種藥物特別用于治療淋病。
[0016] 在這些組合物中，硫代硫酸鈉用作賦形劑，而非用作活性劑。
[0017] 僅美國專利申請US 2011/0008467描述了僅包含藥用級硫代硫酸鈉的藥物組合 物。提出的治療應用如下：治療氰化物或鉑中毒、血管鈣化和皮膚病學疾病。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 乳桿菌的抗病原性效果真正存在，但是在大多數(shù)情況中強得不足以對抗感染（參 見圖2A)，因此經常必需另外使用其它活性成分，諸如抗生素或抗真菌劑。
[0020] 本發(fā)明提出了加強乳桿菌的抗病原性效果的手段。發(fā)明人實際上已經發(fā)現(xiàn)了硫代 硫酸鹽，特別是硫代硫酸鈉和乳桿菌的組合使得有可能加強這些乳桿菌的抗病原性效果， 對于包含IO 7至10 1(lCFU/g乳桿菌的粉末，在硫代硫酸鹽以至少IOOmg/克粉末的濃度存在 時。
[0021] 特別地，此"抗病原性"效果特征在于抑制陰道病原體諸如陰道加德納氏菌，二路 普雷沃氏菌，和特別是白色念珠菌的生長。
[0022] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含與卷曲乳桿菌組合的至少100mg/g硫代硫酸 鈉。
[0023] 發(fā)明詳述
[0024] 本發(fā)明涉及硫代硫酸鹽加強乳桿菌細菌的抗病原性效果的用途，對于包含IO7至 10 1(lCFU/g乳桿菌的粉末，所述硫代硫酸鹽為至少IOOmg/克粉末的量。
[0025] 定義
[0026] 術語"加強"意指給出更大的有效性，以提高活性成分的有益效果。特別地，加強 劑（本文為硫代硫酸鹽）自身不對病原體起作用，但是經由乳桿菌起作用，其加強所述乳桿 菌的抗病原性效果。
[0027] 術語"抗病原性效果"指就其生長可以受到乳桿菌存在抑制的各種病原體而言乳 桿菌的預防和治療作用。此效果經由各種機制表示：降低PH、生成過氧化氫（H 2O2),生成乳 酸和/或乙酸，生成和分泌細菌素、肽、有機酸和短鏈脂肪酸、和抑制病原體的粘附和擴充。 特別地，此抗病原性效果以對病原體生長的抑制速率，及以細菌素和具有抗微生物特性的 肽化合物的生成速率測量。
[0028] 術語"病原體"指可能在泌尿生殖道中沉積的所有病原體，且特別是陰道加德納氏 菌、二路普雷沃氏菌、淋病奈瑟氏球菌（Neisseria gonorrhoeae)、支原體（mycoplasmas)、 動彎桿菌屬（Mobiluncus)、白色念珠菌和光滑念珠菌（Candida glabrata)，及可能引起腸 感染的病原體，諸如例如腸桿菌科（Enterobacteriaceae)，包括大腸桿菌（Escherichia coli)、沙門氏菌屬（Salmonella)、葡萄球菌屬（Staphylococcus)、艱難梭菌（Clostridium difficile)和志賀氏菌屬（Shigella)。
[0029] 術語"乳桿菌"指乳桿菌屬的所有細菌，即不能移動，兼性厭氧，具有可變的形狀和 大小的革蘭氏陽性細菌。大多數(shù)乳桿菌將乳糖和其它單糖轉化成乳酸。乳桿菌定殖于陰道 和胃腸道中，并且是內源腸和陰道菌群的重要組成。
[0030] 本發(fā)明主要涉及構成陰道菌群的乳桿菌；然而，應當理解本發(fā)明可以用其他類 型的乳桿菌實施，諸如那些存在胃腸道中的乳桿菌（特別是嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus)、路氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri)、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius)、加氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri)、膝鼠乳桿菌（Lactobacillus casei) 和鼠李糖乳桿菌）。
[0031] 術語"集落形成單位"或"CFU"指本領域技術人員公認用于量化能夠建立菌落的 細菌的量度單位。
[0032] 術語"硫代硫酸鹽"指硫代硫酸根離子（S2O廣）。這是在水性介質中不穩(wěn)定的硫代 硫酸（H 2S2O3)的堿性形式。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，其生長受到硫代硫酸鹽和乳桿菌的組合抑制的病 原體屬于白色念珠菌、二路普雷沃氏菌、陰道加德納氏菌、支原體或動彎桿菌屬的家族。
[0034] 白色念珠菌是念珠菌屬的最重要且最知名的酵母物種。它主要對消化道和女性生 殖系統(tǒng)粘膜引起真菌感染（念珠菌病（candidiasis，candidosis))。
[0035] 二路普雷沃氏菌是一種厭氧性細菌，其主要引起陰道病和尿道感染。
[0036] 陰道加德納氏菌是一種具有多形桿菌（pleomorphic rod)或球桿菌形狀的細菌。 它通常存在于陰道?。ǚ翘禺愋躁幍姥祝┣闆r中，作為唯一的病原性細菌或與其它細菌組 合存在。它生成僅影響人細胞的穿孔毒素。它也可以在血液、尿液和咽中遇到。
[0037] 支原體指對抗生素家族，諸如青霉素或beta-內酰胺不敏感的超過100個細菌物 種的家族。特別地，生殖道支原體（Mycoplasma genitalium)造成生殖器（尿道炎、宮頸炎、 陰道炎、輸卵管炎）和不育問題。
[0038] 動彎桿菌屬是一種經常與細菌性陰道病中的陰道加德納氏菌一起找到的厭氧性 革蘭氏陽性細菌。
[0039] 術語"陰道病"指陰道的微生物菌群的失調。其特征在于乳桿菌消失和厭氧性細 菌諸如陰道加德納氏菌的繁殖。
[0040] 術語"念珠菌病"指由念珠菌屬（Candida)酵母引起的真菌感染。白色念珠菌（最 常見的物種）是口咽和消化道的常見菌群的一部分，并且也可以以少量存在于正常的陰道 菌群中。外陰陰道念珠菌病是相當常見的，并且可以易于幾次復發(fā)。
[0041] 術語"泌尿感染"指細菌對尿液的定殖，最常以泌尿感染的癥狀表示。最常關注 的細菌是大腸桿菌（75%的病例）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis)和克雷伯氏菌屬 (Klebsiella)，所有三種為腸桿菌科（Enterobacteriaceae)(革蘭氏陰性桿菌）。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明，陰道病和念珠菌病和尿道感染都不能認為是性傳播感染諸如淋病。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，硫代硫酸鹽選自硫代硫酸鈉或硫代硫酸鉀。優(yōu)選地，使用 硫代硫酸鈉。硫代硫酸鈉由鈉離子和硫代硫酸根離子組成。優(yōu)選地，使用的量是至少IOOmg/ g粉末，優(yōu)選每克粉末至少150mg，且更優(yōu)選至少200mg硫代硫酸鹽，此粉末包含IO7-IOltl個 乳桿菌細菌（CFU)。優(yōu)選地，終產物中的硫代硫酸鈉量會是約230mg/克包含IO 7-IOiciCFU乳 桿菌的粉末。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，對于包含每克IO8-IOiciCFU乳桿菌，且更優(yōu)選 IO9-IOiciCFU/克的粉末，硫代硫酸鹽以約230mg/克粉末的量使用。本領域技術人員，即凍干 方面的專家會能夠改變凍干前添加的硫代硫酸鹽量以獲得凍干后獲得的粉末中期望的量。 特別地，通過在凍干前將113g/升硫代硫酸鈉添加到細菌培養(yǎng)基獲得硫代硫酸鈉的此最終 量。然而，實施例顯示了在細菌培養(yǎng)基中僅添加 Ig/升硫代硫酸鹽使得有可能加強培養(yǎng)物 中的乳桿菌的效果。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的方面，乳桿菌是鼠李糖乳桿菌和/或卷曲乳桿菌。優(yōu)選 的菌株特別是菌株.Lcr35^和菌株BLL2005。
[0046] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含與卷曲乳桿菌菌株組合的每克粉末至少IOOmg 硫代硫酸鹽，優(yōu)選至少150mg，且更優(yōu)選至少200mg硫代硫酸鹽。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案， 每克組合物的乳桿菌量會是IO 7-IOiciCFU,更優(yōu)選108-109CFU/g。
[0047] 優(yōu)選地，卷曲乳桿菌菌株為凍干形式。菌株可以是組合物的唯一凍干成分，但是優(yōu) 選地，菌株在包含其他組分的培養(yǎng)基中凍干，所述其他組分會在凍干步驟之前或之后添加。 特別地，可以在凍干前添加硫代硫酸鈉，特別是以113g/升細菌培養(yǎng)基的量添加。硫代硫酸 鈉也可以以Ig/升、5g/升、IOg/升、20g/升、30g/升、50g/升或IOOg/升細菌培養(yǎng)基的量添 加。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的另一個具體的方面，藥物組合物進一步包含本領域技術人員公知的 保存基質和/或賦形劑，和任選地具有互補作用的其它活性成分。
[0049] 特別地，此組合物可以包含以下活性成分：激素（雌三醇、孕酮，等等）、消炎藥和 /或殺細菌劑和/或抗真菌劑。本領域技術人員會能夠確定哪些活性成分可以有利地與卷 曲乳桿菌菌株組合。根據(jù)本發(fā)明的一個具體的方面，此組合物還包含幾種乳桿菌菌株。
[0050] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含在培養(yǎng)基中存在硫代硫酸鹽，特別是硫代硫酸 鈉，特別是至少IOOg/升硫代硫酸鈉的情況中培養(yǎng)的乳桿菌菌株，優(yōu)選卷曲乳桿菌的培養(yǎng) 上清液。此培養(yǎng)上清液含有硫代硫酸鹽，但不含乳桿菌。它具有較強的抗病原性活性。
[0051] 如實施例中顯示，硫代硫酸鹽的存在加強細菌素（具有抗微生物特性的肽化合 物）的分泌。如此，可能的是不再含有乳桿菌的"培養(yǎng)上清液"含有由乳桿菌預先分泌的大 量細菌素。
[0052] 將這些藥物組合物配制用于陰道施用或口服施用。特別地，使用的劑量形式會是 膠囊、片劑、乳劑、液體或油性懸浮液、或任何其它合適的醫(yī)學裝置。
[0053] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含與卷曲乳桿菌菌株組合的每克粉末至少100mg， 優(yōu)選至少150mg，且更優(yōu)選至少200mg硫代硫酸鹽，該組合物用于治療泌尿生殖器感染，諸 如陰道病、念珠菌病和尿道感染。
[0054] 優(yōu)選地，此組合物會包含與IO8至10 9CFU/g卷曲乳桿菌菌株組合的約230mg硫代 硫酸鈉。
[0055] 可以根據(jù)建立適合于患者的藥物治療中一般考慮的標準，諸如例如患者的年齡或 重量，患者一般狀態(tài)的嚴重性（the gravity of the patient' s general state)、對治療 的耐受性和觀察到的副作用，確定根據(jù)本發(fā)明的化合物和組合物的最佳施用模式、劑量給 藥日程表和劑量形式。優(yōu)選地，會通過每天施用一個或兩個350mg膠囊治療泌尿生殖器感 染。
[0056] 本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含與IO7至10 ltlCFU乳桿菌菌株組合的每克粉末至 少100mg，優(yōu)選至少150mg，且更優(yōu)選至少200mg硫代硫酸鹽，所述藥物組合物用于通過加強 乳桿菌的抗病原性效果來治療泌尿生殖器感染諸如陰道病、念珠菌病和尿道感染。
[0057] 最后，本發(fā)明還涉及硫代硫酸鹽且特別是硫代硫酸鈉通過加強乳桿菌的抗病原性 效果來治療泌尿生殖器感染諸如陰道病、念珠菌病和尿道感染的新用途。
[0058] 硫代硫酸鹽可以與乳桿菌組合使用，如上文描述的，或者為了加強陰道腔中內源 存在的乳桿菌的抗病原性效果而單獨施用。
[0059] 附圖簡述
[0060] 圖1 :菌株卷曲乳桿菌BLL2005配制劑中的硫代硫酸鈉濃度對抑制病原性白色念 珠菌的影響。結果表示為TO和多個取樣點（T = 4h、24h和28h)時的計數(shù)之間的CFU數(shù)目 的十進制對數(shù)（Iogltl)降低。
[0061] 圖2 :沒有（圖2A)或具有（圖2B)硫代硫酸鈉的包含各種乳桿菌菌株的組合物， 用于抑制病原性白色念珠菌。結果表示為TO和多個取樣點（T = 4h、24h和28h)時的計數(shù) 之間的CFU數(shù)目的十進制對數(shù)（Iogltl)降低。
[0062] 圖3 :沒有（圖3A)或具有（圖3B)硫代硫酸鈉的包含菌株卷曲乳桿菌BLL2005的 組合物，用于抑制各種病原體。結果表示為TO和多個取樣點（T = 4h、24h和28h)時的計 數(shù)之間的CFU數(shù)目的十進制對數(shù)（Iogltl)降低。
[0063] 圖4 :單獨的硫代硫酸鈉對病原性白色念珠菌生長的影響。
[0064] 圖5 :具有或沒有卷曲乳桿菌存在的"配制劑A"對病原性白色念珠菌的影響。
[0065] 圖6 :與150mg硫代硫酸鹽（在終產物中凍干后）一起配制的菌株Lcr35 (鼠李糖 乳桿菌）和白色念珠菌的共培養(yǎng)。 實施例
[0066] 實施例1 :菌株卷曲乳桿菌BLL2005和各種濃度的硫代硫酸鈉的組合，用于抑制病 原性白色念珠菌
[0067] 在病原性菌株白色念珠菌UMIP48. 72(ATCC10231)和菌株卷曲乳桿菌BLL2005(與 各種濃度的硫代硫酸鈉一起配制）之間實施共溫育測試?；A配制劑對應于配制劑A(參 見下文），其中硫代硫酸鈉濃度是變化的。在凍干步驟前，在發(fā)酵結束時添加此成分。
[0068] 配制劑A包含以下組分：
[0069] ?培養(yǎng)基：116g/l 乳、15g/l 右旋糖、10g/l 自溶酵母、2ml/l Tween
[0070] ?凍干培養(yǎng)基：110g/l 乳、101. 5g/l FOS、9. 5ml/l 谷氨酸鹽、5. 25g/l 抗壞血酸、 113g/l硫代硫酸鈉
[0071] 測試下列配制劑（表1):
[0072]
【權利要求】
1. 硫代硫酸鹽加強乳桿菌細菌的抗病原性效果的用途，對于包含107至101(lCFU/g乳桿 菌的粉末，所述硫代硫酸鹽為至少IOOmg/克粉末的量。
2. 根據(jù)權利要求1的用途，其特征在于所述硫代硫酸鹽選自：硫代硫酸鈉或硫代硫酸 鉀。
3. 根據(jù)權利要求1或2的用途，其特征在于對于包含107-101(lCFU/g的粉末，以約 230mg/克粉末的量使用所述硫代硫酸鹽。
4. 根據(jù)權利要求1的用途，其特征在于所述乳桿菌是鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus)和 / 或卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus) 〇
5. 藥物組合物，其包含與卷曲乳桿菌菌株組合的每克至少IOOmg硫代硫酸鹽。
6. 藥物組合物，其包含在存在硫代硫酸鈉的情況下培養(yǎng)的乳桿菌菌株的培養(yǎng)上清液， 所述上清液不含乳桿菌。
7. 根據(jù)權利要求5或6的藥物組合物，其配制用于陰道或口服施用。
8. 根據(jù)權利要求5至7中任一項的組合物，其用于治療泌尿生殖器感染，諸如陰道病、 念珠菌病和尿道感染。
9. 藥物組合物，其包含與10 7至10 1(lCFU/g乳桿菌菌株組合的每克至少IOOmg硫代硫酸 鹽，該組合物用于通過加強乳桿菌的抗病原性效果來治療泌尿生殖器感染，諸如陰道病、念 珠菌病和尿道感染。
【文檔編號】A61K45/06GK104519892SQ201380039635
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年7月9日 優(yōu)先權日:2012年7月9日
【發(fā)明者】A.尼沃利茲 申請人:普羅比奧諾夫公司