抑癌基因atoh8及其編碼蛋白的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了抑癌基因ATOH8及其編碼蛋白的應用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的抑癌基因ATOH8，體內(nèi)和體外的功能性研究分析表明，其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，ATOH8能夠促進干細胞分化和降低癌癥干細胞對化療藥物的耐藥性，并且，沉默ATOH8的表達為誘導iPSCs形成提供了新的有效途徑。本發(fā)明為腫瘤疾病提供了新的診斷、治療方法和藥物篩選平臺。
【專利說明】抑癌基因AT0H8及其編碼蛋白的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種新的抑癌基因及其編碼蛋白的應用，特別涉及抑癌基因AT0H8及其編碼蛋白的應用。
【背景技術】
[0002]肝細胞癌是世界第五大癌癥，它每年影響上百萬人的生活。外科手術的方法對肝癌患者的長期存活帶來希望，但是只適用于少部分適應癥患者。肝癌通常在晚期被診斷，并已經(jīng)發(fā)生了轉移和擴散。對于大多數(shù)肝癌患者，存活率只有大約6個月左右。對于非手術適應癥的患者，化療是主要的治療方法。而肝癌病人的化療平均生存率只有4個月。因此，開發(fā)更加可靠的生物標記物診斷方法，更加有效的治療和預后恢復的靶點藥物是被迫切需要的。
[0003]科學家已經(jīng)提供了很多確鑿的證據(jù)證實了腫瘤干細胞的存在及其重要性，腫瘤干細胞與正常干細胞有很多相似之處，具有眾多相同的表面標記物，且都具有自我更新和分化的能力。另外，腫瘤干細胞具有很強的致瘤性。對腫瘤干細胞特性的進一步了解將有助于開發(fā)更加有效的癌癥診斷/治療手段，故腫瘤醫(yī)生和科學家們致力于研究肝癌腫瘤干細胞的機理和解決其抗藥性。最近，香港大學關新元教授的團隊在世界上首度發(fā)現(xiàn)了以CD133作為標記物的肝癌干細胞。類似的報道也先后被其他科學家發(fā)現(xiàn)并報道，如⑶90和⑶24也被作為肝癌干細胞的表面標記物而被發(fā)現(xiàn)。即便如此，迄今對于腫瘤干細胞表面標記物的研究還知之甚少。
[0004]重編程已分化的體細胞成為多能干細胞在再生醫(yī)學領域的研究中具有重要的意義。2007年誘導多能干細胞(iPSC)的發(fā)現(xiàn)是人類疾病(包括肝臟的遺傳性疾病和肝癌)的研究過程中的革命性進展。iPSCs向肝細胞定向分化的方法也為腫瘤疾病提供了新的研究平臺和藥物篩選平臺。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的抑癌基因AT0H8 (atonal homolog8,無調(diào)性同源物質8)及其編碼蛋白的應用。本發(fā)明研究了 AT0H8在腫瘤組織特別是肝癌中的表達特點及其調(diào)控機制、研究AT0H8的新功能并提供AT0H8的新應用。
[0006]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用，及作為癌癥的輔助診斷和/或預后判斷的敏感性檢測新靶點的應用。
[0007]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備具有抑制腫瘤細胞的生長、抑制腫瘤細胞的遷移、抑制腫瘤細胞的成瘤性、和/或誘導腫瘤細胞凋亡的效果的制劑中的應用。
[0008]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在誘導癌癥非腫瘤干細胞重編程成為腫瘤干細胞中的應用。
[0009]優(yōu)選的，所述癌癥為肝癌。
[0010]AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備誘導多能干細胞中的應用。[0011]一種用于癌癥診斷和/或預后判斷的試劑盒，含有特異性擴增AT0H8基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗AT0H8蛋白的抗體。優(yōu)選的，所述癌癥為肝癌。
[0012]用于治療肝癌癌癥、抑制肝癌腫瘤細胞的生長、抑制肝癌腫瘤細胞的遷移、抑制肝癌腫瘤細胞的成瘤性、和/或誘導肝癌腫瘤細胞凋亡的藥物組合物，該藥物組合物含有:AT0H8基因和/或其編碼的蛋白，以及醫(yī)學上可接受的藥用輔料。
[0013]本發(fā)明的有益效果是: [0014]發(fā)明人在肝癌腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了一種新的抑癌基因AT0H8，在242例病人組織樣本中發(fā)現(xiàn)，AT0H8在肝癌病人中超過48%低表達，并且與原發(fā)性肝癌病人的生存率低和復發(fā)率高等問題顯著相關。體內(nèi)和體外的功能性研究分析表明，AT0H8能夠抑制肝癌細胞的生長、遷移和轉移。更令人興奮的是，AT0H8能夠促進肝癌細胞凋亡并增加肝癌細胞對化療藥物的敏感性。并且，AT0H8可抑制干細胞多能性基因和干細胞相關生物標記物的表達，這些多能性基因在人的胚胎干細胞保持其多能性的過程中具有重要的意義，并能夠誘導體細胞重編程成為誘導多能干細胞，進一步的研究證實，AT0H8在誘導多能干細胞中低表達。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AT0H8是干細胞相關基因的重要抑制物，在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，AT0H8能夠促進干細胞分化和降低癌癥干細胞對化療藥物的耐藥性，并且，沉默AT0H8的表達為誘導iPSCs形成提供了新的有效途徑，本發(fā)明為腫瘤疾病提供了新的診斷、治療方法和藥物篩選平臺。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1顯示RNA-Seq高通量測序分析AT0H8在肝癌病人癌旁組織及癌組織中的表達情況。
[0016]圖2顯示AT0H8在242例肝癌病人癌旁組織及癌組織中的表達情況。
[0017]圖3顯示AT0H8低表達與肝癌病人生存率低的相關性。
[0018]圖4顯不AT0H8對干細胞相關基因表達的影響。
[0019]圖5顯示雙熒光素酶報告基因檢測法檢測AT0H8對干細胞相關基因的抑制作用。
[0020]圖6顯示電泳遷移率實驗結果。
[0021]圖7顯示AT0H8過表達對腫瘤細胞的生長、克隆形成、集落形成、轉移能力的影響。
[0022]圖8顯示AT0H8過表達對肝癌細胞的侵襲能力、體內(nèi)成瘤能力的影響。
[0023]圖9顯示沉默AT0H8將肝癌的普通腫瘤細胞重編程成為肝癌腫瘤干細胞。
[0024]圖10顯示沉默AT0H8可促進體細胞重編程成為誘導多能干細胞。
[0025]圖11顯示AT0H8提高肝癌細胞對于化療藥物的敏感性。
【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例，進一步闡述本
【發(fā)明內(nèi)容】
。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如，《分子克隆實驗指南》(第三版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]實施例1AT0H8在肝癌組織中表達下調(diào)
[0028]1.RNA-seq高通量測序
[0029]通過提取3對肝癌病人的癌組織及其對應的癌旁組織的RNA進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)AT0H8在3對病人的癌組織中全部低表達。結果如圖1所示:448N(41)表示448樣本癌旁組織在樣本中被測到讀數(shù)是41 ；448T(1)表示448樣本癌組織在樣本中被測到讀數(shù)是I ;473N(29)表示473樣本癌旁組織在樣本中被測到讀數(shù)是29 ；473T(3)表示473樣本癌組織在樣本中被測到讀數(shù)是3 ；510N(39)表示510樣本癌旁組織在樣本中被測到讀數(shù)是39 ；51OT (3)表示510樣本癌組織在樣本中被測到讀數(shù)是3。
[0030]2.qRT-PCR檢測AT0H8在肝癌病人的臨床標本中的表達
[0031]設計qRT-PCR引物(引物序列為表2中的SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6)。根據(jù)qRT-PCR的結果，定義AT0H8在癌旁組織中的表達超過其在癌組織中的表達4倍為AT0H8低表達。結果顯示在242例肝癌病人的癌組織中超過48%低表達(見圖2)。
[0032]3.AT0H8低表達具有臨床意義
[0033]通過SPSS進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，肝癌病人的臨床資料和AT0H8在臨床樣本中的表達，與肝癌病人的生存率低、體內(nèi)AFP表達過高以及肝癌的低分化相關(見圖3和表1)。
[0034]表1臨床資料與AT0H8表達情況的相關情況
[0035]
【權利要求】
1.AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用，及作為癌癥的輔助診斷和/或預后判斷的敏感性檢測新靶點的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述癌癥為肝癌。
3.AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在誘導癌癥非腫瘤干細胞重編程成為腫瘤干細胞中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:所述癌癥為肝癌。
5.AT0H8基因和/或其編碼的蛋白在制備誘導多能干細胞中的應用。
6.一種用于癌癥診斷和/或預后判斷的試劑盒，所述試劑盒含有:特異性擴增AT0H8基因DNA鏈和/或其cDNA鏈的PCR引物，或抗AT0H8蛋白的抗體。
7.根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述癌癥為肝癌。
8.用于治療癌癥的藥物組合物，該藥物組合物含有:AT0H8基因和/或其編碼的蛋白，以及醫(yī)學上可接受的藥用輔料。
9.根據(jù)權利要求8所述的藥物`組合物，其特征在于:所述癌癥為肝癌。
【文檔編號】A61K38/17GK103736103SQ201310741165
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月27日 優(yōu)先權日:2013年12月27日
【發(fā)明者】關新元, 宋洋洋, 李焱 申請人:中山大學附屬腫瘤醫(yī)院