橫紋齒猛蟻有效部位的制備方法和醫(yī)藥用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及橫紋齒猛蟻有效部位的制備方法和醫(yī)藥用途。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有防治真菌感染類疾病功能的中藥螞蟻橫紋齒猛蟻有效部位及其制備方法和用于制備抗真菌藥物的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的橫紋齒猛蟻有效部位是藥用螞蟻橫紋齒猛蟻(Odontoponera?transversa?Smith)經(jīng)超濾分離技術(shù)富集、精制而得。具體而言，是將橫紋齒猛蟻蟲體經(jīng)醇溶液浸泡提取得到的提取物再經(jīng)截留分子量為5KDa的超濾膜進(jìn)行超濾精制而成，該有效部位具有顯著的抑制白色念珠菌生長活性，可制備成片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、涂劑、外用搽劑、膜劑、膏劑、噴劑、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑形式，用于制備預(yù)防和治療真菌感染的藥物、日化用品或醫(yī)療器械。
【專利說明】橫紋齒猛蟻有效部位的制備方法和醫(yī)藥用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，本發(fā)明涉及一種具有抗真菌活性的橫紋齒猛蟻有效部位及其制備方法、含有該有效部位的藥物組合物及其在制備抗真菌感染藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展，各種新藥物和新技術(shù)如廣譜抗生素、激素、各種導(dǎo)管插管技術(shù)、化療、移植等醫(yī)療手段的廣泛使用，以及HIV感染和腫瘤，造成人類免疫系統(tǒng)被逐漸破壞的病例逐年增多，從而導(dǎo)致深部真菌感染引起的真菌病的發(fā)病率愈來愈高；而另一方面，隨著人類濫用抗生素和臨床抗真菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致傳統(tǒng)抗生素不能有效對抗某些嚴(yán)重真菌感染和細(xì)菌感染，真菌的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。傳統(tǒng)抗生素的作用已經(jīng)遭遇顯著瓶頸，大多數(shù)細(xì)菌、真菌對常見的抗生素產(chǎn)生了顯著的抗藥性；艾滋病患者、重癥患者、燒傷患者等并發(fā)真菌性感染更使病患危在旦夕。因此，尋找廣譜、高效、低毒的抗真菌新藥已成為藥物研究的熱點(diǎn)。
[0003]對耐藥菌/頑固性真菌的研究迫在眉睫。真菌感染引起的疾病大體上可以分為以下四類:侵襲性真菌病與全身性真菌病(如曲霉病和念珠菌病等)、粘膜型真菌病(如“鵝口瘡”等)、淺表型皮膚真菌 病(如“香港腳”或“頭皮癬”、“灰指甲”等)和過敏型真菌病(如哮喘與慢性炎癥等)。在以上四類真菌病中，以第一類對人類危害最大，而后三類真菌病相對較輕一些。據(jù)來自國外的臨床統(tǒng)計(jì)資料，在死于感染性疾病的人群中，有4%是死于全身性曲霉菌類真菌感染，大約2%的人死于全身性念珠菌感染。臨床統(tǒng)計(jì)資料表明，病人一旦患上全身性曲霉病，其死亡率高達(dá)85%，如患血液性念珠菌病則其死亡率達(dá)到了 40%。利用現(xiàn)有抗真菌藥物治療全身性真菌病或血液感染型真菌病的效果至今仍無法令人滿意。因此，藥學(xué)界正在尋找可以抑制全身性真菌感染的新型藥物。
[0004]目前，國內(nèi)外已開發(fā)上市的抗真菌藥物主要有四大類，即多烯類(如兩性霉素B)、三唑類(如氟康唑、咪康唑、益康唑、依曲康唑和酮康唑等)、烷基胺類(如特比萘芬)和新開發(fā)上市的棘白菌素(echinocandins)類(如卡帕芬凈和米卡民等)。前三大類抗真菌藥均為20世紀(jì)開發(fā)上市的老藥，而棘白霉素類則是21世紀(jì)初開發(fā)上市的新藥。老品種的康唑類如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等通過抑制真菌麥角留醇生物合成中的羊毛留醇14去甲基化酶而起效，此類老牌康唑類抗真菌藥物抗菌譜較窄而耐壓性與日俱增。新品種抗真菌藥物雖抗菌譜擴(kuò)大但是代謝性質(zhì)和理化特性不佳，水溶性低、生物利用度差；患者需要高脂飲食以利藥物吸收，或服用高價(jià)的特種制劑形式方可起效；為增加水溶性而添加的環(huán)糊精等也給腎功能不全者帶來較大威脅。
[0005]三唑類抗真菌藥物無論第一代還是第二代均對有絲真菌引起的全身性感染療效不佳；而棘白霉素類抗真菌新藥雖然對這類疾病有一定療效，然而其面臨的最大問題是:尚無口服劑型，只限于注射(且僅限于醫(yī)院使用)，故病人使用頗為不便。其次，雖然棘白霉素對常見念珠菌病等真菌性感染療效不錯(cuò)，但其價(jià)格昂貴，故而限制了它們在發(fā)達(dá)國家以外市場的銷售量。據(jù)報(bào)道，在我國市場上，每支卡帕芬凈注射劑(劑量為50毫克)的零售價(jià)為3，148元，而日本產(chǎn)的米卡民價(jià)格稍低一些，但每支(劑量為50毫克)也要650元。因此，我國醫(yī)院臨床目前最常用的全身性抗真菌藥物仍為大扶康和特比萘芬。
[0006]綜上所述，盡快尋找新型的抗真菌藥物及活性物質(zhì)來源，是今后數(shù)十年藥物工作者們需要抓緊研制的當(dāng)務(wù)之急。中藥與天然藥物因其在治療中不良反應(yīng)低不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛重視；由中藥或天然產(chǎn)物制成的各種單方或復(fù)方制劑以及中西藥配伍制劑，越來越多地應(yīng)用于臨床，顯現(xiàn)出良好的效果。由于中藥與天然藥物具有資源豐富、毒副作用低等特點(diǎn)，國內(nèi)的專家正將目光瞄準(zhǔn)該領(lǐng)域，發(fā)掘中國醫(yī)藥學(xué)寶庫，力圖找到能有效抑制真菌感染引起的各種疾病的藥物，而我們的前期研究已看到了希望。
[0007]地球上已經(jīng)記載和命名的昆蟲，其種類超過100萬種，約占整個(gè)動(dòng)物界種類的80%以上，其中我國約有15萬種。在漫長的進(jìn)化過程中，昆蟲已成為地球上優(yōu)勢的動(dòng)物物種。據(jù)估算，昆蟲的總生物量超過地球上所有動(dòng)物總生物量，是當(dāng)今世界上有待開發(fā)的生物類群之一。而藥用昆蟲是中國中醫(yī)藥寶庫中的組成部分，據(jù)記載，有藥用價(jià)值的昆蟲約有800余種，隸屬于昆蟲綱的14目35科以上。不少昆蟲類中藥因療效確切而在臨床上廣泛應(yīng)用。近年來，對昆蟲源藥用成分的挖掘以及藥用昆蟲在治療某些疑難雜癥方面的獨(dú)到作用，弓丨起了廣大醫(yī)藥工作者和昆蟲學(xué)者的極大興趣，藥用昆蟲的研究有了長足的進(jìn)展。本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)長期從事藥用昆蟲的開發(fā)利用研究，并已成功研制了以蟑螂為原料的“康復(fù)新液”、“肝龍膠囊”、“心脈龍注射液”等藥品，主治:燒傷和燙傷等外傷創(chuàng)面、乙肝、急慢性心衰和室性早博等心腦缺血性疾病等。
[0008]為了探索開發(fā)出新型的抗真菌天然藥物，本發(fā)明以藥用昆蟲螞蟻為研究對象。螞蟻又稱“玄駒”、“蚍蜉”、“狀元子”，是一種社會(huì)性昆蟲，螞蟻隸屬昆蟲綱(Class Insecta)、 膜翅目(Hymenoptera)、細(xì)腰亞目(Apocrita)、蟻總科(Formicoidea)、蟻科(Formicidae)。螞蟻種類繁多，全世界共有260屬，約有16，000多種，目前已定名的有8，800多種。我國估計(jì)達(dá)2，000種以上，其中已經(jīng)定名的大約有600種。螞蟻入藥的最早記載為唐朝陳藏器所著《本草拾遺》，其中就有“獨(dú)腳蟻主治疔腫疽毒，搗涂之”的記述；明朝李時(shí)珍《本草綱目》、清朝趙學(xué)敏《本草綱目拾遺》等也將螞蟻?zhàn)鳛橹兴幨珍?，認(rèn)為蟻幼蟲有“催乳汁、澤顏色”等功效，可合“壯藥(即滋補(bǔ)藥)”。目前我國臨床應(yīng)用的螞蟻不到20種，其中已定名且常用入藥的有包括絲光褐林蟻、擬黑多翅蟻、橫紋齒猛蟻等10種蟻科動(dòng)物無毒螞蟻的全體。近些年研究發(fā)現(xiàn)，螞蟻具有抗炎、鎮(zhèn)痛、提高免疫力，減少胃酸分泌、預(yù)防潰瘍發(fā)生、抗癲癇、抗驚厥等功效；藥用螞蟻具有調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)方面的藥理作用，特別是對類風(fēng)濕、糖尿病、癌癥等均有良好的治療效果(“我國藥用螞蟻的開發(fā)與利用概況”，赤峰學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，27 (7): 22-24)。
[0009]螞蟻除了可入藥，還可食用，其含有人體必需的70多種營養(yǎng)成分；其中蛋白質(zhì)含量豐富，約占42%~67%，螞蟻的成蟲含蛋白質(zhì)達(dá)55%，卵可達(dá)67% ;粗蛋白含量達(dá)42%以上；含有26種游離氨基酸，加上蛋白質(zhì)水解的氨基酸共27種氨基酸，游離氨基酸的總量可達(dá)1，868毫克/100克，水解氨基酸達(dá)到3，994毫克/100克，其中有8種是人體必需的氨基酸；同時(shí)，螞蟻體內(nèi)還含有28種游離脂肪酸，其中油酸62.44%，棕櫚酸21.14%，棕櫚油酸
11.03%。螞蟻體內(nèi)還含有多種激素、活性酶(螞蟻體內(nèi)含19種酶和輔酶，如FAD、SOD等，這些物質(zhì)對機(jī)體的能量代謝、腦細(xì)胞的更新及改善腦缺氧狀況有重要作用)、高能磷酸化合物及蟻醛(主要是草體蟻醛CltlH16O2,是萜烯類衍生物，具有良好的舒筋活血的功能，其滋補(bǔ)能力可與野山參相媲美)、蟻酸(甲酸，有的含量高達(dá)體重的20%，濃度達(dá)70%)。另外，螞蟻體內(nèi)還含有豐富的維生素，較為突出的有維生素A、C、D、E、B1、B2、B12，為人類健康提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)；除此之外，據(jù)測定，螞蟻體內(nèi)含28種微量元素，如:錳、鋅、硒、鎂、鈣、磷、鉻、鐵、碘、鑰、氟等，其中鋅的含量最高，故抗風(fēng)濕病療效顯著(“藥用螞蟻的研究進(jìn)展”，食品與藥品，2006，8 (OlA): 26-28)。
[0010]如上述，由于螞蟻的身體就是一個(gè)營養(yǎng)庫與制藥廠，因此其藥用與食用價(jià)值極高。美國的科學(xué)家研究產(chǎn)于美洲的切葉蟻(Attini族，Apterostigma dentigerum),發(fā)現(xiàn)該種螞蟻身體體表共生的放線菌Pseudonocardia spp.能產(chǎn)生可以抑制真菌Escovopsi ssp.和部分念珠菌菌株的一種環(huán)妝抗生素Dentigerumycin (^Dentigerumycin:a bacterialmediator of an ant-fungus symbiosis”，Nat Chem Biol.2009，5 (6): 391-393)。然而，切葉蟻Apterostigma dentigerum僅分布于美洲哥斯達(dá)黎加等部分地區(qū),而與其共生的放線菌Pseudonocardia spp.在其它地方也沒有發(fā)現(xiàn)，因此Dentigerumycin無法大量制備以進(jìn)一步開發(fā)。澳大利亞的科學(xué)家則在產(chǎn)于澳大利亞的斗牛犬蟻(Bulldog ant)Myrmecianigriscapa的后胸側(cè)板腺(metapleural gland)的分泌物中發(fā)現(xiàn)能夠抑制細(xì)菌、真菌生長白勺后胸側(cè)板腺素(metapleurins) (“Ants and antibiotics”，ECOS, 1989，61:27-28)。然而，斗牛犬蟻(Myrmecia nigriscapa及相似種)為澳大利亞特種昆蟲,其他國家和地區(qū)并未分布；且metapleurins的收集為刺激活體斗牛犬蟻，使其后胸側(cè)板腺分泌出類抗生素的活性物質(zhì)，因此，難以滿足進(jìn)一步研發(fā)所需的大量樣品。
[0011]橫紋齒猛蟻(Odontoponeratransversa Smith)是指蟻科(Formicidae)齒猛蟻屬(Odontoponera spp.)昆蟲,分布于中國廣東、廣西、海南、云南，以及東南亞等地。橫紋齒猛蟻為我國臨床上應(yīng)用的近20種“螞蟻”中的一種，其后腹部具密集網(wǎng)狀刻紋和稀疏粗大具毛刻點(diǎn)，較暗；少數(shù)個(gè)體具細(xì) 密縱刻紋。橫紋齒猛蟻頭和體背面具豐富的直立、亞直立毛，毛色金黃色至褐紅色；茸毛色淺，在觸角、足和后腹部較密集；體暗銹紅色至黑色。上顎、觸角和足暗紅褐色。本發(fā)明人對中國入藥螞蟻的大量研究發(fā)現(xiàn)，橫紋齒猛蟻具有抗真菌活性，本發(fā)明人又根據(jù)大量文獻(xiàn)調(diào)查及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了橫紋齒猛蟻抗真菌有效部位的制備工藝。經(jīng)本發(fā)明人查新發(fā)現(xiàn)，以往均無與本發(fā)明相同的橫紋齒猛蟻有效部位作為主藥進(jìn)行配制的藥物制劑的相關(guān)報(bào)道或?qū)＠?，更無運(yùn)用上述制劑用于防治真菌性感染疾病的文獻(xiàn)報(bào)道?？拐婢囼?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，橫紋齒猛蟻有效部位具有顯著的抗真菌活性，由此完成本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種具有抗真菌活性的橫紋齒猛蟻有效部位。
[0013]本發(fā)明還提供了橫紋齒猛蟻有效部位的制備方法，其特征是所述有效部位以超濾膜分離技術(shù)法富集、精制而得，具體采用以下步驟制備得到:
[0014]a)用重量比為30-300倍量的60%_80%醇溶液室溫浸泡提取橫紋齒猛蟻蟲體，浸泡提取時(shí)間為6-24小時(shí)，減壓濃縮回收溶劑；浸提后的蟲體自然晾干；
[0015]b)將經(jīng)步驟a浸泡提取后晾干的蟲體用組織勻漿機(jī)磨碎、勻漿，用重量比為30-300倍量的70%-90%醇溶液室溫浸泡提取，浸泡提取時(shí)間為6-24小時(shí)，減壓濃縮回收溶劑，得橫紋齒猛蟻醇提取部位；[0016]c)將步驟b得到的醇提取部位用有機(jī)溶劑溶解后，用截留分子量(MWCO)為5千道爾頓(5KDa)的超濾膜進(jìn)行超濾，收集透過超濾膜的膜透過液，減壓濃縮后干燥，粉碎得產(chǎn)
品；O
[0017]其中，步驟a和b中的醇溶液是指以碳原子小于5的低級醇的水溶液；減壓濃縮時(shí)的溫度不超過100°c，干燥方法優(yōu)選真空減壓干燥或冷凍干燥，步驟C中的有機(jī)溶劑是指65%-95%的乙醇溶液或50%-100%的甲醇水溶液或它們的混合物。
[0018]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供橫紋齒猛蟻有效部位在制備預(yù)防和治療抗真菌的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選在制備預(yù)防和治療念珠菌感染疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有橫紋齒猛蟻有效部位與制劑允許的藥物賦形劑或載體制備成藥物組合物，所制備的藥物組合物還可以含有其他抗細(xì)菌和/或抗真菌藥物。所述的藥物可按本領(lǐng)域已知方法制成多種劑型，包括片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、涂劑、外用搽劑、膜劑、膏劑、噴劑、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑、控釋或緩釋劑，及納米制劑。
[0020]經(jīng)本發(fā)明人詳細(xì)的文獻(xiàn)查閱，到目前為止，尚無有關(guān)橫紋齒猛蟻有效部位用于制備抗真菌藥物的報(bào)道。橫紋齒猛蟻有效部位對于真菌生長的強(qiáng)效抑制屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著確切的原創(chuàng)性，據(jù)此完成本發(fā)明。
[0021 ] 本發(fā)明有益之處在于:首次發(fā)現(xiàn)橫紋齒猛蟻有效部位具有抑制真菌生長、制備抗真菌感染方面的成藥潛力，為開發(fā)成為治療真菌感染創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。具有潛在巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明再一特點(diǎn)為:本發(fā)明之藥用昆蟲資源豐富，提取制備方法簡單易行、原料來源方便易得、成本低、污染小，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。
【具體實(shí)施方式】
[0022]為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例給出了橫紋齒猛蟻有效部位的制備方法，以及該提取物抑制真菌生長的部分藥理活性數(shù)據(jù)，說明其在制備抗真菌藥物中的應(yīng)用。必須說明下述實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0023]實(shí)施例1:橫紋齒猛蟻有效部位(A)的制備
[0024]1.1橫紋齒猛蟻乙醇提取部位(AO)的制備
[0025]本實(shí)施例所用藥材購于昆明藥材市場，經(jīng)云南省中醫(yī)學(xué)院趙榮華教授鑒定為橫紋齒猛蟻干品。
[0026]取400.0毫克的干燥橫紋齒猛蟻，室溫下浸泡于40毫升的75%乙醇溶液中18小時(shí)，濾出浸泡液，減壓濃縮、回收溶劑。浸提后的蟲體自然晾干。
[0027]將上述浸泡提取后晾干的蟲體用組織勻漿機(jī)磨碎、勻漿，并用40毫升的90%乙醇溶液室溫浸泡提取，提取時(shí)間為18小時(shí)；濾出溶液，經(jīng)減壓濃縮回收溶劑，得橫紋齒猛蟻醇提取部位(AO) 55.6毫克。
[0028]1.2橫紋齒猛蟻有效部位的制備
[0029]取30.0毫克由實(shí)施例1的1.1制備得到的橫紋齒猛蟻乙醇提取部位，用65%的甲醇水溶液震蕩溶解后，用MWCO為5KDa的超濾膜過濾，收集透過超濾膜的膜透過液，減壓濃縮后冷凍干燥，粉碎后稱重，得橫紋齒猛蟻有效部位(A) 3.5毫克。[0030]實(shí)施例2:橫紋齒猛蟻有效部位⑶的制備
[0031]2.1橫紋齒猛蟻乙醇提取部位(b)的制備
[0032]本實(shí)施例所用藥材購于昆明藥材市場，經(jīng)云南省中醫(yī)學(xué)院趙榮華教授鑒定為橫紋齒猛蟻干品。
[0033]取400.0毫克的干燥橫紋齒猛蟻，室溫下浸泡于120毫升的75%乙醇溶液中12小時(shí)，濾出浸泡液，減壓濃縮、回收溶劑。浸提后的蟲體自然晾干。
[0034]將上述浸泡提取后晾干的蟲體用組織勻漿機(jī)磨碎、勻漿，并用60毫升的90%甲醇溶劑室溫浸泡提取，提取時(shí)間為24小時(shí)；濾出溶液，經(jīng)減壓濃縮回收溶劑，得橫紋齒猛蟻醇提取部位(BO) 51.2毫克。
[0035]2.2橫紋齒猛蟻有效部位的制備
[0036]取30.0毫克由實(shí)施例2的2.1制備得到的橫紋齒猛蟻乙醇提取部位，用90%的甲醇溶液震蕩溶解后，用MWCO為5KDa的超濾膜過濾，收集透過超濾膜的膜透過液，減壓濃縮后冷凍干燥，粉碎后稱重，得橫紋齒猛蟻有效部位(B) 2.6毫克。
[0037]實(shí)施例3:橫紋齒猛蟻有效部位抑制真菌活性檢測
[0038]參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)提出的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌敏感性試驗(yàn)方法，測試實(shí)施例1制備得到的橫紋齒猛蟻醇提取部位(AO)、橫紋齒猛蟻醇提取部位(BO)、橫紋齒猛蟻有效部位(A)及橫紋齒猛蟻有效部位(B)的體外抗真菌活性。
[0039]3.1真菌標(biāo)準(zhǔn)株:
[0040]白色念珠菌ATCC76615 (CS3):解放軍第二醫(yī)科大學(xué)提供。
[0041]白色念珠菌ATCC90029 (5-FC耐藥菌株):北京醫(yī)院衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。
[0042]白色念珠菌98001:武漢菌種保藏中心提供。
[0043]3.2 試劑:
[0044]3.2.1沙氏瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar):廣東凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。
[0045]3.2.2酵母抽提物(yeast extract):海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝。
[0046]3.2.3 三氮嗎啡啉丙橫酸(3-N-morpholinopropanesulfonicacid，MOPS)
[0047]3.2.4標(biāo)準(zhǔn)抗真菌注射液:氟康唑(Fluconazole，F(xiàn)CZ)，揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)公司。配置成不同濃度梯度的倍比稀釋液。
[0048]3.2.5 二甲基亞諷(dimethylsulfoxide，DMSO)及二甲基甲酉先胺(dimethylformamide, DMF):上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司分裝產(chǎn)品。
[0049]3.3 儀器:
[0050]3.3.1電子天平JA1203N (AB204-5，METTLER TOLEDO):上海精密科學(xué)儀器公司產(chǎn)
品O
[0051]3.3.2SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品。
[0052]3.3.3隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9160MBE):上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
[0053]3.3.4電熱恒溫培養(yǎng)箱(HZQ-F160A):上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。
[0054]3.3.5美菱電冰箱(B⑶-221CHC):合肥美菱股份有限公司產(chǎn)品。
[0055]3.3.6 微量移液器(Proline Pipette, DragonMed Pipette):芬蘭雷勃公司產(chǎn)品。
[0056]3.3.7細(xì)胞計(jì)數(shù)板(96well cell culture cluster):上海求精儀器公司產(chǎn)品。[0057]3.3.8普通光學(xué)顯微鏡(Olympus ):日本奧林巴斯光學(xué)儀器株式會(huì)社產(chǎn)品。
[0058]3.3.9干烤箱(101A-2):上海崇明實(shí)驗(yàn)儀器公司產(chǎn)品。
[0059]3.3.10立式高壓蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S II ):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。
[0060]3.3.11磁力加熱攪拌器(ARE):意大利VELP公司產(chǎn)品。
[0061]3.3.12濾膜、濾器(0.22 u m, SARTORIUS):德國賽多利斯公司產(chǎn)品。 [0062]3.3.13酸度計(jì)(PHSJ-4A):上海精科雷磁公司產(chǎn)品。
[0063]3.3.14試管振蕩器(MS2):廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司產(chǎn)品。
[0064]3.3.15恒溫振蕩培養(yǎng)箱(THZ-18AB):上海一恒科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。
[0065]3.3.16低溫冰箱(-20° C，科龍B⑶-219WAK):廣東科龍電器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。
[0066]3.3.1796孔平底微量培養(yǎng)板:美國Corning Incorporated產(chǎn)品。
[0067]3.4實(shí)驗(yàn)方法:
[0068]3.4.1實(shí)驗(yàn)步驟:
[0069]3.4.1.1RPM1-1640液的配制:取10.4克RPM1-1640粉(含L谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，GIBC0)溶于900毫升無菌水中，加入34.53克三氮嗎啡啉丙磺酸(MOPS)至其終點(diǎn)濃度為0.165摩爾/升，室溫下用磁力攪拌器混勻2-3小時(shí)，使其充分溶解，用氫氧化鈉(I摩爾/升)調(diào)節(jié)PH值至7.0 (25°C )，用滅菌水定容至I升，濾過除菌，分裝后_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070]3.4.1.2儲(chǔ)備液的制備:儲(chǔ)備液濃度應(yīng)為應(yīng)用液的10倍，5-FC(5-氟尿嘧啶)和FCZ(氟康唑)為1，280微克/毫升，Amb (兩性霉素B)和KETO (酮康唑)為320微克/毫升，用電子天平分別稱取5-FC、FCZ、KETO和Amb各10毫克，5-FC用I毫升雙蒸水溶解，F(xiàn)CZ用I毫升二甲基甲酰胺(DMF)溶解，Amb和KETO分別用二甲亞砜(DMSO)溶解，之后用RPM1-1640稀釋至儲(chǔ)存液濃度，分裝后_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071]3.4.1.3應(yīng)用液的制備:用RPM1-1640液將儲(chǔ)備液作1:10稀釋后再作倍比稀，F(xiàn)CZ、5-FC和Amb為128微克/毫升-0.25微克/毫升作10個(gè)系列的濃度，KETO為32微克/毫升-0.06微克/毫升10個(gè)系列濃度，均為2倍終濃度。
[0072]3.4.1.4微量藥敏培養(yǎng)板的制備:使用一次性的96孔板，第1-10列分別加入10個(gè)濃度梯度的測試藥物的應(yīng)用液，從高濃度到低濃度。第11列加入RPM1-1640，每孔100微升，第12列作為空白對照，放入_20°C冰箱備用，使用時(shí)經(jīng)_4°C、4°C和室溫各I小時(shí)。
[0073]3.4.1.5念珠菌的激活與稀釋:將待測的菌株在YPD瓊脂培養(yǎng)基(1%酵母抽提物，1%蛋白胨，2%葡萄糖)上激活兩次后，取直徑大于I毫米的菌落少許于3毫升無菌生理鹽水中混勻制成菌懸液，取少許，用血細(xì)胞技術(shù)板計(jì)數(shù)四個(gè)大方格中的菌細(xì)胞數(shù)，取平均值X，此時(shí)菌細(xì)胞數(shù)為XX IO4CFU/毫升，用RPM1-1640液調(diào)整濃度為3X IO4CFU/毫升(兩倍終濃度)。
[0074]3.4.1.6加樣:在上述制備好的含有測試藥物的培養(yǎng)板上加入念珠菌懸液,每孔100微升空白對照不加，震蕩混勻后放入濕盒(防止微量板中的液體揮發(fā)而影響藥物的濃度)35°C孵育24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。
[0075]3.4.1.7肉眼判斷結(jié)果:以生長對照空白為依據(jù)，以80%抑制(即MIC80)為觀察終點(diǎn)，菌種生長明顯減少，液體輕微混濁；同時(shí)陽性生長中生長良好，空白對照清亮，無細(xì)菌生長。質(zhì)控菌株之MIC值在美國臨床微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)CLSI M27-A2方案規(guī)定的范圍內(nèi)，顯示實(shí)驗(yàn)結(jié)果是有效的。[0076]3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0077]3.5.1質(zhì)控株對抗真菌藥物的敏感性:四種陽性藥物對質(zhì)控菌株ATCC90029和98001標(biāo)準(zhǔn)株藥敏結(jié)果符合CLSM27-A2方案對于質(zhì)控株標(biāo)準(zhǔn)株的要求。即:重復(fù)3次以上進(jìn)行AmB、5-FC、FCZ和KETO的MIC值變化不超過2個(gè)濃度梯度。
[0078]3.5.2陽性對照及測試藥物樣品的抗真菌活性結(jié)果見表1。
[0079]表1測試藥物對白色念珠菌真菌(CS3菌株)的抑制作用
【權(quán)利要求】
1.一種橫紋齒猛蟻有效部位，其特征為所述橫紋齒猛蟻有效部位是指橫紋齒猛蟻乙醇提取部位經(jīng)超濾膜分離技術(shù)法富集、精制而得。
2.權(quán)利要求1所述之橫紋齒猛蟻有效部位用于制備抗真菌感染藥物的用途。
3.一種具有抗真菌感染的藥物組合物，其特征是:該藥物組合物含有治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的橫紋齒猛蟻有效部位、藥用輔料和藥用載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其制劑形式是片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、涂劑、外用搽劑、膜劑、膏劑、噴劑、注射劑、透皮貼劑或氣霧劑。
5.一種制備權(quán)利要求1所述橫紋齒猛蟻有效部位的方法，其特征是: a)用重量比為30-300倍量的60%-80%醇溶液室溫浸泡提取橫紋齒猛蟻蟲體，浸泡提取時(shí)間為6-24小時(shí)，減壓濃縮回收溶劑； b)將經(jīng)步驟a浸泡提取后的蟲體用組織勻漿機(jī)磨碎、勻漿，用重量比為30-300倍量的70%-90%醇溶液室溫浸泡提取蟲體漿，浸泡提取時(shí)間為6-24小時(shí)，減壓濃縮回收溶劑，得橫紋齒猛蟻醇提取部位； c)將步驟b得到的橫紋齒猛蟻醇提取部位用有機(jī)溶劑溶解后，用截留分子量為5千道爾頓的超濾膜進(jìn)行超濾，收集透過超濾膜的膜透過液，減壓濃縮后干燥，粉碎得產(chǎn)品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征是:所述醇溶液是指以碳原子小于5的低級醇的水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征是:步驟c中的有機(jī)溶劑是指65%-95%的乙醇溶液或50%-100%的甲醇水溶液；干燥是指真空減壓干燥或冷凍干燥。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK103638053SQ201310606049
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】白麗, 高鵬, 楊自忠, 巫秀美, 趙昱 申請人:大理學(xué)院