從甌柑油胞層中分離純化七種黃酮類化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種有效的從甌柑油胞層中分離純化七種黃酮類化合物的方法，采用溶劑萃取，Sephadex凝膠過濾和高速逆流色譜（HSCCC）純化三個步驟，以甌柑果實油胞層為原料，最終純化得到七種黃酮類化合物，純度均在97%以上。本發(fā)明操作簡單，生產(chǎn)周期短，樣品用量少，設備投入少，條件穩(wěn)定容易控制，七種黃酮類化合物包括柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素，本發(fā)明方法適用于工業(yè)化生產(chǎn)和科學研究。
【專利說明】從甌柑油胞層中分離純化七種黃酮類化合物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于天然植物中有效成分的提取分離純化【技術領域】，具體涉及以甌柑油胞層為原料，采用溶劑萃取、Sephadex凝膠過濾和高速逆流色譜(HSCCC)的聯(lián)用技術同時分離純化甌柑油胞層中的七種黃酮類化合物的方法。
【背景技術】
[0002]瓶柑(CYtrascv.Swari1S1Siffia)是蕓香科柑橘屬的一個栽培變種,是浙江溫州的傳統(tǒng)特產(chǎn)，有兩千多年的栽培歷史。甌柑果實在民間具有抗癌、退熱降溫、止痰化咳、清涼解毒、改善血液循環(huán)、降壓等特殊療效，這些作用可能與其果實中富含的黃酮類化合物有關。前人的研究報道柑橘黃酮類化合物具有抗癌、降糖、降血脂、預防心血管疾病、消炎、神經(jīng)保護等活性，對人體健康起非常重要的作用。另外，黃酮類化合物也是重要的工業(yè)生產(chǎn)前體，如柚皮苷和新橙皮苷常用來生產(chǎn)它們相應的二氫查耳酮類。柚皮苷二氫查耳酮和新橙皮苷二氫查耳酮的甜度分別是蔗糖的300倍和1000倍，而且具有低熱量和低嚙齒性，可以適合糖尿病人和肥胖人群。同時，將黃酮類化合物添加到牙膏或化妝品中，具有較好的消炎、止血和美白的功效，并且在急性毒理實驗中也被證明是安全的，因此，黃酮類化合物的分離純化具有非常重要的保健價值和工業(yè)效益。
[0003]隨著近年來對黃酮類化合物的深入研究，市場需求量迅速增大?，F(xiàn)有技術中，柑橘黃酮類化合物的提取分離主要采用有機溶劑提取結合結晶法，但這些工藝效率低，生產(chǎn)周期長，污染嚴重，不利于大量生產(chǎn)。S^hadex凝膠柱可以綜合利用凝膠過濾和反相分配的原理進行天然產(chǎn)物的分離?；谝阂悍峙湓淼腍SCCC避免了固體支持物或載體帶來的樣品吸附、變性、污染等缺點，并具有較高的樣品回復率。采用溶劑萃取，凝膠過濾和HSCCC的聯(lián)用技術可有效快速的分離純化柑橘中的黃酮類化合物。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是 提供一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，通過以下步驟實現(xiàn):
(1)溶劑萃取:一定質量的甌柑油胞層粉末先用80%乙醇超聲提取3次(固液比1:20)，每次30 min，經(jīng)真空抽濾后，合并上清液，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸干至無乙醇相，溶于去離子水中，根據(jù)溶劑極性依次用正己烷，氯仿，正丁醇萃取兩次，分別合并兩次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物；
(2)Sephadex LH-20凝膠過濾:蒸干后的正己烷和氯仿萃取物溶于40%甲醇中，上Sephadex LH-20凝膠柱,上樣流速2 mL/min。上樣后的Sephadex LH-20凝膠柱依次用體積比為40%，60%，80%，100%甲醇洗脫凝膠柱，每個梯度洗4個柱床體積，洗脫流速為2 mL/min，洗脫液經(jīng)HPLC檢測，合并富含黃酮類化合物的洗脫液，在旋轉蒸發(fā)儀上50°C蒸干得到去除色素后的黃酮粗提物；
(3 ) HSCCC分離純化:配制不同的HSCCC溶劑體系，充分搖勻過夜后，上相為固定相，下相為流動相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，穩(wěn)定后，開啟逆流色譜儀將轉速調至800 rpm，同時流動相以2 mL/min速度通過HSCCC，待流出液分層后，去除色素后的正己烷和氯仿萃取物分別溶于正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比1:0.8:1:1)的下相中，正丁醇萃取物溶于乙酸乙酯-正丁醇-水(體積比4:1:5)下相中，根據(jù)色譜儀檢測器采集的圖譜分管收集各組分，用HPLC測定各組分的組成，分別合并含有單一黃酮類化合物的試管，在旋轉蒸發(fā)儀上50°C蒸干共得到七種黃酮類化合物，分別為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素，產(chǎn)品純度均在97%以上。本發(fā)明純化得到的七種黃酮類化合物經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)和質譜(MS)鑒定，與文獻報道一致。
[0005]本發(fā)明的黃酮類化合物的提取材料選自甌柑油胞層。利用正己烷、氯仿和正丁醇分段萃取甌柑油胞層中的黃酮類化合物。利用S^hadex LH-20凝膠柱去除正己烷和氯仿萃取物中的色素分子。進行HSCCC純化時，選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:0.8:1:1)的溶劑體系，從正己烷和氯仿萃取物中純化得到甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素，選擇乙酸乙酯-正丁醇-水(4:1:5)溶劑體系，從正丁醇萃取物中得到柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，純化得到的七種黃酮類化合物純度均在97%以上。
[0006]本發(fā)明采用溶劑萃取、Sephadex凝膠過濾和HSCCC的聯(lián)用技術，以甌柑油胞層烘干粉末為原料同時分離純化得到高純度的七種黃酮類化合物。本發(fā)明相對于過去的工藝有如下優(yōu)點:(I)不需要高溫高壓及惰性氣體的保護，合成工藝簡單；(2) HSCCC所用的溶劑可回收后重復利用，成本較低；(3)可用于分離利用性質非常接近的黃酮類化合物，適用性廣；(4)生產(chǎn)周期短，僅僅需要幾個小時就可以完成整個純化過程；(5)純化產(chǎn)物回收率高，純度高；(6)整個純化過程通過HPLC進行精確定量，準確度高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
[0008]圖2為甌柑油胞層中七種黃酮類化合物的結構。
[0009]圖3為正己燒萃取物的HSCCC圖譜，圖中，I為川陳皮素，2為橘皮素,3為5_去甲川陳皮素。
[0010]圖4為氯仿萃取物的HSCCC圖譜，圖中，I為甜橙黃酮，2為川陳皮素，3為橘皮素?！揪唧w實施方式】
[0011]本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0012]實施例1 本發(fā)明通過以下試驗進行影響因素的篩選確定
1、純化材料的選擇
新鮮的甌柑果實分為油胞層，白皮層，囊衣，汁胞四個部位，液氮充分凍干后，在冷凍干燥機中-80°C下干燥72 h至恒重，干樣用粉碎機磨碎待用。精確稱取一定量甌柑四個不同部位的干樣粉末，用80%乙醇(固液比1:20)超聲提取30 min，提取液在離心機上4000rpm離心10 min，如此重復兩次，合并上清液，用于甌柑果實四個不同部位中黃酮類化合物的HPLC分析。HPLC分析條件為:以水(溶液A)和色譜乙腈(溶液B)為流動相，采用梯度洗脫，洗脫梯度為:0~15 min，保持溶液B 20%不變，15~35 min，溶液B 20%~60% ；35~40 min,溶液B 60%~100% ;然后保持100%溶液B不變，洗脫2 min ；42~45 min,溶液B100%~20% ;保持20%溶液B 5 min后結束一個循環(huán)。檢測波長為280 nm (黃烷酮)和330nm (多甲氧基黃酮)，溫度為25°C，進樣量為10 UL0結果表明，在甌柑果實四個不同部位中，油胞層中含有種類最多的黃酮類化合物，可作為純化材料(參見表1)。
【權利要求】
1.一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，通過以下步驟實現(xiàn): (1)溶劑萃取:取甌柑油胞層粉末先用80%乙醇超聲提取3次，固液比1:20，每次30min,經(jīng)真空抽濾后，合并上清液，在旋轉蒸發(fā)儀上蒸干至無乙醇相，溶于去離子水中，依次用正己烷，氯仿，正丁醇萃取兩次，分別合并兩次萃取物，得到正己烷萃取物，氯仿萃取物和正丁醇萃取物； (2)Sephadex LH-20凝膠過濾:蒸干后的正己烷和氯仿萃取物溶于40%甲醇中，上Sephadex LH-20凝膠柱,上樣流速2 mL/min,上樣后的Sephadex LH-20凝膠柱依次用40%,60%, 80%, 100%甲醇洗脫凝膠柱，每個梯度洗4個柱床體積，洗脫流速為2 mL/min,洗脫液經(jīng)HPLC檢測，合并富含黃酮類化合物的洗脫液，在旋轉蒸發(fā)儀上50°C蒸干得到去除色素后的黃酮粗提物； (3)HSCCC分離純化:配制不同的HSCCC溶劑體系，充分搖勻過夜后，上相為固定相，下相為流動相，固定相首先以20 mL/min流速泵入HSCCC，穩(wěn)定后，開啟逆流色譜儀將轉速調至800 rpm，同時流動相以2 mL/min速度通過HSCCC，待流出液分層后，去除色素后的正己烷和氯仿萃取物分別溶于1:0.8:1:1的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的下相中，正丁醇萃取物溶于4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水下相中，根據(jù)色譜儀檢測器采集的圖譜分管收集各組分，用HPLC測定各組分的組成，分別合并含有單一黃酮類化合物的試管，在旋轉蒸發(fā)儀上50°C蒸干共得到七種黃酮類化合物，分別為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，其特征在于，黃酮類化合物的提取材料選自甌柑油胞層。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，其特征在于利用正己烷、氯仿和正丁醇分段萃取甌柑油胞層中的黃酮類化合物。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，其特征在于利用S^hadex LH-20凝膠柱去除正己烷和氯仿萃取物中的色素分子。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種從甌柑油胞層分離純化七種黃酮類化合物的方法，其特征在于進行HSCCC純化時，選擇1:0.8:1:1的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的溶劑體系，從正己烷和氯仿萃取物中純化得到甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素和5-去甲川陳皮素，選擇4:1:5的乙酸乙酯-正丁醇-水溶劑體系，從正丁醇萃取物中得到柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，純化得到的七種黃酮類化合物純度均在97%以上。
【文檔編號】A61K36/752GK103610800SQ201310565693
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月13日 優(yōu)先權日:2013年11月13日
【發(fā)明者】李鮮, 張九凱, 孫崇德, 陳昆松 申請人:浙江大學