啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用，可有效解決啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯何種部位具有治療食管癌之功效和提高療效的問題，方法是，對啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯水煎物進行梯度洗脫，制備不同濃度乙醇洗脫部分并作用與食管癌細(xì)胞，篩選啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同洗脫組分中抑制食管癌細(xì)胞增殖的有效作用部位，有效作用部位對食管癌細(xì)胞生長的影響，從而實現(xiàn)啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明原材料豐富，制備方法簡單，其產(chǎn)品具有治療食管癌之功效，療效高，是中藥上的創(chuàng)新。
【專利說明】啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]食管癌(esophageal carcinoma)是消化系統(tǒng)一種常見的惡性腫瘤,全世界每年新增病例45萬人，五年生存率不到10%，在世界范圍惡性腫瘤中發(fā)病率居第八位，死亡率居第六位。我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)之一，特別是河南的林州和河北的磁縣，食管癌的發(fā)病率居全國各類惡性腫瘤第五位，死亡率居第4位，其中男女發(fā)病率比例為1.3~2.7:1，發(fā)病年齡多在40歲以上。手術(shù)治療是可切除食管癌的患病部位，但70%~80%的患者就診時已屬中晚期，失去手術(shù)機會。目前食管癌的治療主要是綜合治療，但總體預(yù)后仍然很差，因此尋找新的治療方法和藥物是目前治療食管癌研究的難點。食管癌屬于中醫(yī)“噎嗝”范疇，臨床分痰氣交阻、津虧熱結(jié)、瘀血內(nèi)結(jié)和氣虛陽微四型，對應(yīng)方劑分別啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯，且四方在臨床應(yīng)用中已取得肯定療效，實驗研究也發(fā)現(xiàn)四方能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長，但四方的具體作用部位和作用機制目前仍不完全明了。而且，啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯水煎液治療食管癌效果并不理想，因此如何進一步研究和提高啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯對治療食管癌的效果是人們關(guān)心所要解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用，可有效解決啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯何種部位具有治療食管癌之功效和提高療效的問題。
[0004]本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，對啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯水煎物進行梯度洗脫，制備不同濃度乙醇洗脫部分并作用與食管癌細(xì)胞，篩選啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同洗脫組分中抑制食管癌細(xì)胞增殖的有效作用部位，有效作用部位對食管癌細(xì)胞生長的影響，從而實現(xiàn)啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用；所述的啟膈散是由北沙參90g、丹參90g、茯苓30g、川貝母45g、郁金15g、砂仁殼12g制成；通幽湯由桃仁泥40g、當(dāng)歸身40g、升麻40g、生地黃20g、熟地黃20g、檳榔20g、紅花4g、炙甘草4g制成；沙參麥冬湯由北沙參90g、麥冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g制成；補氣運脾湯由白術(shù)90g、人參60g、橘紅45g、獲茶45g、黃芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g制成。
[0005]本發(fā)明原材料豐富，制備方法簡單，其產(chǎn)品具有治療食管癌之功效，療效高，有效解決了啟膈散、沙參麥冬湯 、通幽湯和補氣運脾湯何種部位治療食管癌和提高食管癌療效的問題，是中藥上的創(chuàng)新?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0006]圖1為本發(fā)明啟膈散水提物量效曲線圖。
[0007]圖2為本發(fā)明通幽湯水提物量效曲線圖。
[0008]圖3為本發(fā)明沙參麥冬湯水提物量效曲線圖。
[0009]圖4為本發(fā)明補氣運脾湯水提物量效曲線圖。
[0010]圖5為本發(fā)明啟隔散30%乙醇洗脫部位量效關(guān)系曲線圖。
[0011]圖6為本發(fā)明通幽湯50%乙醇洗脫部位量效關(guān)系曲線圖。
[0012]圖7為本發(fā)明沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位量效曲線圖。
[0013]圖8為本發(fā)明補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位量效曲線圖。
[0014]圖9為本發(fā)明食管癌四證方不同洗脫部位對EC9706細(xì)胞生長抑制作用時效關(guān)系曲線圖。
[0015]圖10為本發(fā)明空白對照組X 100。
[0016]圖11為本發(fā)明啟膈散30%乙醇洗脫相組X 100。
[0017]圖12為本發(fā)明通幽湯50%乙醇洗脫相組X 100。
[0018]圖13為本發(fā)明沙參麥冬湯50%乙醇洗脫相組X 100。
`[0019]圖14為本發(fā)明補氣運脾湯無水乙醇相組X 100。
[0020]圖15為本發(fā)明空白對照組X 200。
[0021]圖16為本發(fā)明啟膈散30%醇相組X 200。
[0022]圖17為本發(fā)明通幽湯50%醇相組X 200。
[0023]圖18為本發(fā)明沙參麥冬湯50%醇相組X 200。
[0024]圖19為本發(fā)明補氣運脾湯50%醇相組X 200。
[0025]圖20為本發(fā)明陰性對照組對照組。
[0026]圖21為本發(fā)明啟膈散30%乙醇洗脫部位組。
[0027]圖22為本發(fā)明通幽湯50%乙醇洗脫部位組。
[0028]圖23為本發(fā)明沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位組。
[0029]圖24為本發(fā)明補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位組。
【具體實施方式】
[0030]以下結(jié)合具體情況對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0031]本發(fā)明在具體實施中，是由以下技術(shù)方案給出。
[0032]首先分別選取啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯的原料藥物，啟膈散是由北沙參90g、丹參90g、茯苓30g、川貝母45g、郁金15g、砂仁殼12g組成；通幽湯由桃仁泥40g、當(dāng)歸身40g、升麻40g、生地黃20g、熟地黃20g、檳榔20g、紅花4g、炙甘草4g組成；沙參麥冬湯由北沙參90g、麥冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g、生甘草30g組成；補氣運脾湯由白術(shù)90g、人參60g、橘紅45g、茯苓45g、黃芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g組成；啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯組成后，分別用超純水洗去雜質(zhì)，分別加啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯原料藥物重量15倍的超純水浸泡2小時，煎煮2小時，濾去殘渣，濾液濃縮至含生藥量為0.5g/ml ;再分別5000r/min的轉(zhuǎn)速離心lOmin，取上清液,過濾,濾液緩慢加入處理好的樹脂柱中，上樣體積為柱體積的1/5 (200ml),以0.5BV/h的速度通過樹脂進行緩慢吸附，然后依次應(yīng)用IOBV (8000ml)的超純水、體積濃度為30%的乙醇(簡稱30%乙醇，以下同)、體積濃度為50%的乙醇(簡稱50%乙醇，以下同)、體積濃度為70%的乙醇(簡稱70%乙醇，以下同)、無水乙醇通過樹脂柱，通過樹脂柱的前5BV以IBV/h的速度進行洗脫，后5BV以2BV/h速度進行洗脫。分別收集不同洗脫液，回收溶劑，干燥，得啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位，有效用于制備治療食管癌的藥物，實現(xiàn)啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用；
[0033]所述的處理好的樹脂柱是，大孔吸附樹脂DlOl用無水乙醇浸泡24h，裝柱，以2BV/h (IBV=I個柱體積)速度無水乙醇洗沖柱子至洗脫液液與水1: 5不渾濁，同樣的洗脫速度水洗至流出液無醇味，4BV的質(zhì)量濃度為5%的HCl和以質(zhì)量濃度為2%的Na0H2BV/h的速度依次通過樹脂柱，浸泡2h，水洗至中性。 [0034]本發(fā)明的啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯的啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位，經(jīng)測試和實驗，具有抑制食管癌細(xì)胞EC9706生長的作用，有效用于治療食管癌，其療效明顯優(yōu)于啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯的水煎液，并經(jīng)實驗得到了有效證明，有關(guān)實驗資料如下:
[0035]1.實驗藥物
[0036]本發(fā)明的啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位。
[0037]對比藥物:啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯的水提物，所述的啟膈散水提物、沙參麥冬湯水提物、通幽湯水提物和補氣運脾湯水提物是分別按組方稱取原料后，分別用超純水洗去雜質(zhì)，加30倍超純水浸泡2小時，煎煮30min，濃縮至100ml，5000r/min離心15min取上清液,用濾紙過濾后濃縮至20ml。
[0038]2.主要試劑和儀器
[0039]大孔吸附樹脂DlOl (天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，HG2-885-76);胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(PAA) ；DMEM 培養(yǎng)基干粉(GIBCO) ；MTT (Sigma) DMSO (Amresco);細(xì)胞周期檢測試劑盒(南京凱基)；Heraeus細(xì)胞培養(yǎng)箱(Kendro公司)；倒置顯微鏡(Zeiss公司)；ELx800型酶標(biāo)儀(ΒΙ0-ΤΕΚ公司)；BioMate紫外可見分光光度計(Thermo公司)；pH測定儀(HANNA公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司)。
[0040]3.實驗方法
[0041]細(xì)胞培養(yǎng)
[0042]從液氮中取出細(xì)胞株EC9706，Imin內(nèi)迅速解凍。將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，補加IOmlDMEM培養(yǎng)基，離心1000r/min，IOmin0棄上清，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基10ml，吹打混勻，1000rmplOmin離心，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基以I X IO6個細(xì)胞/皿接種于0 IOOmm培養(yǎng)皿中，置37°C、5%C02飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2~3天傳代I次。
[0043]MTT法測定啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同洗脫部位及其水提物對EC9706細(xì)胞的量效關(guān)系
[0044]以I X IO4個細(xì)胞/孔的密度接種于96孔平面培養(yǎng)板，200 μ I/孔，培養(yǎng)24h。分別加入含啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同乙醇洗脫部位的10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基200 μ 1，濃度設(shè)6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μ g/ml8個梯度，每個濃度梯度設(shè)
3個復(fù)孔，空白對照組加含10%小牛血清的培養(yǎng)基200 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)48h。每孔加150 μ I含10%ΜΤΤ的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。每孔加入200 μ I DMSO,溶解ΜΤΤ，酶標(biāo)儀上以570nm/630nm測定光吸收值(0D)，按照腫瘤細(xì)胞生長抑制率(％) = (1_用藥組OD值/對照組OD值)X 100%公式計算各藥物組對細(xì)胞EC9706增殖的抑制率。找出對細(xì)胞抑制作用明顯的組分，運用SPSS13.0進行曲線擬合，繪制量效關(guān)系曲線圖，求出各抑制作用明顯組分的半數(shù)抑制率IC5tl值。 [0045]按照同樣的方法測定測定四方水提物25μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml、400 μ g/ml、800 μ g/ml、1600 μ g/ml、3200 μ g/ml8 個梯度，對 EC9706 細(xì)胞的量效關(guān)系，
并計算其IC5tl值。
[0046]MTT法測定啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同洗脫部位對EC9706細(xì)胞的時效關(guān)系
[0047]取抑制作用明顯的組分的IC5tl濃度，同時設(shè)4個加藥組和對照組，每組3個復(fù)孔，通過MTT法檢測12h、24h、36h、48h四個時間點藥物對細(xì)胞的抑制率，確定時間一藥效關(guān)系，繪制時效關(guān)系曲線。
[0048]倒置顯微鏡下觀察啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位對細(xì)胞EC9706形態(tài)的影響
[0049]以I X IO6細(xì)胞/ml接種Φ IOcm培養(yǎng)皿，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，設(shè)空白對照組、啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位5組。24h后，按各治法藥物組的IC5tl值的藥物濃度作用細(xì)胞，空白對照組加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況和形態(tài)。
[0050]啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同乙醇濃度洗脫部位對食管癌細(xì)胞EC9706周期的影響
[0051]以lXlO6cells/皿細(xì)胞密度種細(xì)胞EC97O6于0 IOOmm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h后，棄上清，設(shè)空白對照組、啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位5組，每組重復(fù)三個皿。各藥物組分別加入含各IC5tl藥物濃度的10%小牛血清培養(yǎng)基10ml，空白對照組加等量含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。胰酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至15ml離心管中，2000r/min離心5min，棄上清，4°C PBS (2ml)洗，混勻，2000rpm，5min離心，棄液。4°C PBS (2ml)洗，混勻，計數(shù)取I X 106個細(xì)胞于流式管中，2000rpm, 5min離心，棄液；先用4°C PBS懸浮細(xì)胞，大約1ml，充分懸浮，使細(xì)胞充分分散成單細(xì)胞之后，緩慢加入_20°C無水乙醇2.4ml，終濃度為70%乙醇。4°C固定24h以上。離心，1500rpm, 5min 棄固定液；4°C PBSlml 洗，混勻后，離心 1500rpm, 5min 棄液，4°C PBSlml洗，混勻，離心，1500rpm, 5min棄液。分別加入100 μ I RNAase, 37 °C水浴30min ;再加入400 μ I ΡΙ，染色液混勻，4°C避光30min。300目的尼龍濾膜直接過濾到流式檢測管中，每樣本獲取IO4個細(xì)胞熒光信號，激發(fā)波長488nm，用CellQuest Pro獲取、MODFIT軟件檢測EC9706細(xì)胞周期分布。周期分布用G0/G1%，S%，G2/M%表示。
[0052]統(tǒng)計學(xué)分析方法:采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，F(xiàn)檢驗，曲線擬合
[0053]4.結(jié)果[0054]啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯和補氣運脾湯不同梯度濃度乙醇洗脫部位分析
[0055]經(jīng)過大量預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，實驗中所采用的打孔吸附樹脂洗脫條件下，得到的各組出膏率均較大且比較穩(wěn)定。不同組分洗脫液進行濃縮烘干后得到不同組分的藥物干粉，各四方各組分出膏率大小順序一致:純水部位> 30%乙醇洗脫部位> 50%乙醇洗脫部位> 70%乙醇洗脫部位>無水乙醇洗脫部位，見表1。
[0056]表1食管癌證方不同乙醇濃度洗脫部位出膏分析
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種啟膈散、通幽湯、沙參麥冬湯、補氣運脾湯不同洗脫部位在治療食管癌藥物中的應(yīng)用，所述的啟膈散由北沙參90g、丹參90g、茯苓30g、川貝母45g、郁金15g和砂仁殼12g組成；所述的通幽湯由桃仁泥40g、當(dāng)歸身40g、升麻40g、生地黃20g、熟地黃20g、檳榔20g、紅花4g和炎甘草4g組成；所述的沙參麥冬湯由北沙參90g、麥冬90g、玉竹60g、天花粉45g、生扁豆45g和生甘草30g組成；所述的補氣運脾湯由白術(shù)90g、人參60g、橘紅45g、獲茶45g、黃芪45g、半夏30g、砂仁24g和甘草12g組成；啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯組成后，分別用超純水洗去雜質(zhì)，分別加啟膈散、沙參麥冬湯、通幽湯和補氣運脾湯原料藥物重量15倍的超純水浸泡2小時，煎煮2小時，濾去殘渣，濾液濃縮至含生藥量為0.5g/ml ;再分別以5000r/min的轉(zhuǎn)速離心IOmin,取上清液,過濾,濾液緩慢加入處理好的樹脂柱中，上樣體積為柱體積的1/5，以0.5BV/h的速度通過樹脂進行緩慢吸附，然后依次應(yīng)用IOBV的超純水、體積濃度為30%的乙醇、體積濃度為50 %的乙醇、體積濃度為70%的乙醇、無水乙醇通過樹脂柱，通過樹脂柱的前5BV以lBV/h的速度進行洗脫，后5BV以2BV/h速度進行洗脫，分別收集不同洗脫液，回收溶劑，干燥，得啟膈散30%乙醇洗脫部位、通幽湯和沙參麥冬湯50%乙醇洗脫部位、補氣運脾湯無水乙醇洗脫部位。
【文檔編號】A61K36/8969GK103550706SQ201310548117
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】司富春 申請人:河南中醫(yī)學(xué)院